Evaluación de la transcitosis intestinal de aislados de bacteriemia neonatal por Escherichia coli

Resumen

Escherichia coli causa sepsis en neonatos que ingieren la bacteria alrededor del momento del nacimiento. El proceso involucrado en la capacidad de E. coli para viajar desde el tracto entérico al torrente sanguíneo es poco conocido. Este modelo in vitro evalúa la capacidad de las cepas de E. coli para viajar a través de las células epiteliales intestinales.

Resumen

Los recién nacidos ingieren cepas maternas de E. coli que colonizan su tracto intestinal alrededor del momento del parto. Las cepas de E. coli con la capacidad de translocarse a través del intestino invaden el torrente sanguíneo del recién nacido, causando bacteriemia potencialmente mortal. La metodología presentada aquí utiliza células epiteliales intestinales polarizadas cultivadas en insertos semipermeables para evaluar la transcitosis de aislados de bacteriemia neonatal por E. coli in vitro. Este método utiliza la línea celular intestinal T84 establecida que tiene la capacidad de crecer para confluir y formar uniones estrechas y desmosomas. Después de alcanzar la confluencia, las monocapas T84 maduras desarrollan resistencia transepitelial (TEER), que se puede cuantificar utilizando un voltímetro. Los valores de TEER están inversamente correlacionados con la permeabilidad paracelular de los componentes extracelulares, incluidas las bacterias, a través de la monocapa intestinal. El paso transcelular de bacterias (transcitosis), por otro lado, no necesariamente altera las mediciones TEER. En este modelo, el paso bacteriano a través de la monocapa intestinal se cuantifica hasta 6 h después de la infección, y se realizan mediciones repetidas de TEER para controlar la permeabilidad paracelular. Además, este método facilita el uso de técnicas como la inmunotinción para estudiar los cambios estructurales en las uniones estrechas y otras proteínas de adhesión de célula a célula durante la transcitosis bacteriana a través del epitelio polarizado. El uso de este modelo contribuye a la caracterización de los mecanismos por los cuales E. coli neonatal se transcita a través del epitelio intestinal para producir bacteriemia.

Introducción

Escherichia coli es la causa más común de sepsis de inicio temprano en recién nacidos ^1,2,3. La tasa de mortalidad de la bacteriemia neonatal por E. coli puede alcanzar el 40%, y la meningitis es una posible complicación asociada a discapacidades graves del desarrollo neurológico². La ingestión de cepas maternas de E. coli por el recién nacido puede producir bacteriemia neonatal; Este proceso ha sido replicado en modelos animales ^2,4. Una vez ingeridas, las bacterias ....

Protocolo

NOTA: Realice todas las manipulaciones de las células, bacterias, placas y reactivos T84 en un gabinete de seguridad de nivel de bioseguridad 2 (BSL-2) para evitar la contaminación. Use áreas e incubadoras separadas para todo el trabajo que involucre células T84 estériles, células T84 infectadas y E. coli. Los aislados clínicos de E. coli probados con los métodos aquí descritos fueron obtenidos siguiendo las directrices del Comité de Revisión Institucional de nuestra institución ^1,16.

1. Preparación de insertos de transcitosis con células T84 (aproximadamente....

Resultados

Figura 1: T84 TEER a lo largo del tiempo. A medida que la capa de celda T84 madura en el inserto, la resistencia eléctrica de la monocapa aumenta. A un TEER de al menos 1.000 Ω·^cm2, la capa celular está suficientemente desarrollada para disminuir el transporte bacteriano paracelular y permitir la medición del tránsito bacteriano principal.......

Discusión

Este método se deriva de técnicas utilizadas en gastroenterología y enfermedades infecciosas²⁰. Se han utilizado modelos in vitro de la barrera epitelial intestinal para dilucidar los mecanismos por los cuales el contenido luminal interactúa con este componente relevante de la inmunidad innata ^6,8. Las interacciones huésped-patógeno de E. coli neonatal invasiva también se han caracterizado por separado a través de análisi.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
10.000 U/mL Mezcla de penicilina/estreptomicina	Fisher Scientific	15-140-122
15 mL tubos cónicos estériles	MidSci	C15B
Tubos de microcentrífuga de 2	mL Avant	AVSS2000
50 mL tubos cónicos estériles de polipropileno	Falcon	352070
	Aspirador Corning	4930
Cabinas de bioseguridad	Labconco	30441010028343	En el método se utilizan tres de ellos: uno para el trabajo con tejidos estériles, otro para el trabajo con tejidos infectados y otro para el trabajo con bacterias.
Centrífuga	Sorvall	Legend RT
Asas de inoculación desechables	Fisherbrand	22363605
Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	11965-084
Voltímetro/ohmio epitelial	World Precision Instruments	EVOM2
Suero fetal bovino	Fisher Scientific	10437028
Mezcla de nutrientes F-12 de jamón	Gibco	11765-047
Hemacitómetro	Sigma Aldrich, Bright Line	Z359629
Incubadora	New Brunswick	Incubadoras Innova 4080
Thermo	Scientific	51030284	En el método se utilizan tres de ellos: uno para el cultivo de tejidos estériles, otro para el cultivo de tejidos infectados y otro para la incubación bacteriana.
Caldo de lisogenia	Difco	244610
Agar caldo de lisogenia	IBI Scientific	IB49101
Microscopio Nikon Eclipse TS2R	Espectrofotómetro Nikon
	Unico	1100RS
T84 Células intestinales Colección	Americana de Cultivo de Tejidos	CCL248
Insertos para cultivo de tejidos, con membrana de treftalato de polietileno, 3 y micro; m poros,  Formato de 24 pocillos	Falcon	353096
Placa de cultivo de tejidos, 24 pocillos	Falcon	353504
tinte azul tripano	Fisher Scientific	T10282