Investigación de la relajación del estrés y las respuestas de falla en la tráquea

A pesar de su papel crítico en la enfermedad pulmonar, la estructura más grande de la vía aérea, la tráquea, tiene estudios limitados que detallan sus propiedades viscoelásticas¹. Una comprensión profunda del comportamiento viscoelástico dependiente del tiempo de la tráquea es fundamental para la investigación de la mecánica pulmonar, ya que comprender las propiedades específicas del material de las vías respiratorias puede ayudar a avanzar en la ciencia de la prevención de lesiones, el diagnóstico y la intervención clínica para las enfermedades pulmonares, que son la tercera causa principal de muerte en los Estados Unidos ^2,3,4.

Los estudios de caracterización tisular disponibles han reportado las propiedades de rigidez de la tráquea 5,6,7,8. Las respuestas mecánicas dependientes del tiempo han sido mínimamente investigadas a pesar de su importancia en la remodelación tisular, que también está alterada por la patología ^9,10. Además, la falta de datos de respuesta dependientes del tiempo también limita las capacidades predictivas de los modelos computacionales de mecánica pulmonar que actualmente recurren al uso de las leyes constitutivas genéricas. Es necesario abordar esta brecha mediante la realización de estudios de relajación del estrés que puedan proporcionar las características materiales requeridas para informar los estudios biofísicos de la tráquea. El estudio actual ofrece detalles de métodos de prueba, adquisición de datos y análisis de datos para investigar el comportamiento de relajación del estrés de la tráquea porcina.

Todos los métodos descritos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de la Universidad de Drexel. Todos los animales cadavéricos fueron adquiridos de una granja aprobada por el Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA) ubicada en Pensilvania, Estados Unidos. Para el presente estudio se utilizó un cadáver de un cerdo macho de Yorkshire (3 semanas de edad).

1. Recolección de tejidos

1. Adquiera un cadáver de un cerdo de una granja aprobada y realice los experimentos dentro de las 2 h posteriores a la eutanasia. Mantenga el cadáver en hielo hasta que se complete la recolección de tejido para garantizar que se conserven las propiedades biomecánicas del tejido fresco.
   NOTA: En la literatura publicada, las pruebas de tejido fresco en animales se realizan comúnmente dentro de las 2 h posteriores a la eutanasia. Para más detalles, véanse las referencias 11,12,13,14,15,16,17,18,19.
2. Coloque el cadáver en posición supina, haga una incisión vertical en la línea media a lo largo del cuello y exponga el cartílago tiroides, el cartílago cricoides y la tráquea desde el hueso hioides hasta la muesca supraesternal.
3. Cosecha la laringe y la tráquea de longitud completa usando una cuchilla #10 (Figura 1A).
4. Separe la muestra de tráquea de la laringe y luego corte el tubo traqueal longitudinalmente a lo largo de toda la longitud en un lado usando la cuchilla # 10 (Figura 1B).
5. Mida el grosor de la tráquea utilizando la imagen transversal adquirida (obtenida usando ImageJ²⁰, ver Tabla de materiales) (Figura 1C). Utilice el grosor del tejido medido para calcular el área de la sección transversal durante el análisis de datos.
6. Cortar la tráquea en dos tiras circunferenciales de aproximadamente 5 mm de ancho (proximalmente) y dos tiras longitudinales de aproximadamente 5 mm de ancho (distalmente), siendo la longitud mínima de estas tiras de 25 mm (Figura 1D).
7. Obtenga imágenes de las cuatro muestras (es decir, tiras de tráquea cortadas) junto con una regla. Utilice estas imágenes para proporcionar mediciones digitalizadas del ancho de la muestra utilizando la Imagen J (Figura 1E). Luego, use este ancho medido para calcular el área de la sección transversal de la muestra durante el análisis de datos.
8. Asegúrese de que todas las muestras de tejido se mantengan hidratadas con solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) durante todo el estudio. Mantenga las muestras hidratadas en una gasa empapada en PBS hasta que estén listas para la prueba. Sumerja el tejido en PBS justo antes de probar la hidratación adecuada.

2. Ensayos biomecánicos

1. Fije cada muestra a una abrazadera diseñada a medida (véanse los informes anteriores 11,12,13,14,15,16,17,18,19) de modo que la muestra se mantenga longitudinalmente entre las abrazaderas (Figura ^1F).
2. Fije cuidadosamente las abrazaderas (sin inducir ningún estiramiento) a una máquina de prueba de materiales (consulte la Tabla de materiales), que tiene una célula de carga de 50 N unida al actuador superior (Figura 1G).
3. Mida la distancia de agarre a agarre (es decir, abrazadera) usando una regla. Utilice esta distancia como longitud inicial del tejido para los cálculos de deformación.
4. Realizar el preacondicionamiento mediante carga de tracción de cada muestra cinco veces a una velocidad de deformación del 1% / s a una deformación del 1%.
5. Mantenga cada muestra en un alargamiento máximo de 0% o 10% durante 300 s para investigar la respuesta viscoelástica de relajación al estrés del tejido.
6. Después de la prueba de relajación del estrés, estire el tejido inmediatamente al 1% / s hasta que ocurra una falla mecánica.
7. Documente el lugar de la falla y confirme que no se ha producido ningún deslizamiento asegurándose de la presencia de muestras dentro de las pinzas después de la prueba (Figura 1H).

3. Adquisición de datos

1. No adquiera ningún dato durante el preacondicionamiento.
2. Grabe los videos de prueba de estrés-relajación y fallos utilizando cualquier cámara digital a un mínimo de 30 cuadros / s.
3. Adquiera datos de tiempo(s), carga (N) y desplazamiento (mm) utilizando un software de adquisición de datos (consulte la Tabla de materiales) a una velocidad de muestreo de 250 muestras/s durante las pruebas de relajación y falla de tensión.
4. Guarde los datos adquiridos como un archivo .csv y utilícelos para el análisis de datos como se detalla en el paso 4.
5. Adquiera imágenes fijas del tejido sujetado antes de la relajación por estrés, después de la relajación por estrés y después del fracaso (Figura 2).

4. Análisis de datos

1. Entrada de datos
   1. Descargue e instale el software de análisis de datos de MATLAB (consulte Tabla de materiales), incluidas las cajas de herramientas "Optimización" y "Procesamiento de imágenes".
   2. Descargue la carpeta comprimida (Archivo de codificación complementario 1), que incluye los códigos de MATLAB y un conjunto de datos de muestra que se utilizará para explicar los pasos del análisis de datos.
   3. Navegue hasta la carpeta comprimida descargada y extraiga su contenido.
   4. Abra MATLAB y establezca la carpeta descomprimida como directorio de trabajo. Asegúrese de que el directorio de trabajo tenga las siguientes carpetas y archivos etiquetados como se menciona en la nota siguiente. Asegúrese de que no haya carpetas o archivos adicionales en este directorio de trabajo, ya que pueden interferir con el código y provocar un error.
      NOTA: (1) Fallo (post-relajación), (2) Fallo solamente, (3) Relajación, (4) calc_relax_failure.m, (5) main_relax_failure.m, (6) PruebasFechas.xlsx.
   5. Desplácese hasta la carpeta Sólo error .
      NOTA: Los datos contenidos en esta carpeta se derivan del grupo de control en este estudio, es decir, datos biomecánicos de muestras traqueales que fueron sometidas a fallas mecánicas después de un alargamiento del 0%.
   6. Almacene datos de muestras probadas en una fecha determinada en un archivo de Microsoft Excel mediante la siguiente convención de nomenclatura de archivos: mmddyy. Por ejemplo, los datos de todas las muestras traqueales del grupo de control analizadas el 30 de abril de 2022 deben almacenarse en Solo fallas | 043022.xlsx.
      NOTA: Tenga en cuenta que, en el estudio actual, todas las pruebas biomecánicas se realizaron en un solo día; sin embargo, si los datos se derivaron de varias fechas de prueba, cree un nuevo archivo de Microsoft Excel, denominado en la convención descrita, para cada una de esas fechas de prueba.
   7. Error abierto solo | 043022.xlsx y reconocer que hay varias pestañas de hoja de trabajo, cada una con los datos sin procesar de cada muestra sometida a falla mecánica en esta fecha en particular, es decir, el 30 de abril de 2022.
   8. Asegúrese de que las muestras estén etiquetadas según la siguiente convención: [tipo de muestra]_[ número de muestra]_[insertar nivel de deformación previo al estiramiento]%.
      NOTA: Por ejemplo, en el presente estudio, las muestras traqueales del grupo control se sometieron a pruebas de falla mecánica bajo carga axial o circunferencial sin ninguna relajación previa del estrés. Por lo tanto, estas muestras se nombran en el siguiente formato: TA_1_0% y TC_1_0%, respectivamente. El 0% denota que no hay pre-estiramiento. Las muestras traqueales de nuestro grupo experimental se mantuvieron primero en elongación fija bajo carga axial o circunferencial del 10% para evaluar la respuesta de relajación de tensión viscoelástica y luego se sometieron a fallas mecánicas. Por lo tanto, estas muestras se nombran en el siguiente formato: TA_1_10 % y TC_1_10% (consulte los pasos 4.1.16 y 4.1.23, que representan las condiciones de carga axial y circunferencial, respectivamente).
   9. Seleccione la pestaña de la hoja de cálculo TA_1_0%. Asegúrese de que las columnas de encabezado de datos sin procesar estén etiquetadas exactamente como se escriben en negrita en la nota siguiente.
      NOTA: (1) Tiempo (seg), (2) Carga (N), (3) Posición (mm), (4) Diámetros (mm) (paso 1.7), (5) Área de sección transversal promedio (Espesor x Ancho, mm 2) (obtenido en el paso 1.5 y paso 1.7), (6) Longitud inicial (mm) (paso^2.3).
   10. Cierre el archivo actual de Microsoft Excel, sólo error | 043022.xlsx.
   11. Vuelva al directorio de trabajo del software de análisis de datos.
   12. Desplácese hasta la carpeta Relajación.
       NOTA: Los datos contenidos en esta carpeta se derivan del grupo experimental en este estudio, es decir, datos biomecánicos de muestras traqueales que fueron sometidas a pruebas de relajación de estrés a un alargamiento fijo del 10% durante 300 s.
   13. Almacene los datos de las muestras de grupo experimentales probadas en una fecha determinada en un archivo de Microsoft Excel utilizando la siguiente convención de etiquetado: mmddyy.
       NOTA: Por ejemplo, los datos de todas las muestras traqueales del grupo experimental analizadas el 30 de abril de 2022 deben almacenarse en Relaxation | 043022.xlsx. Consulte la nota del paso 4.1.6 para obtener detalles adicionales.
   14. Relajación abierta | 043022.xlsx y reconocer que hay varias pestañas de hoja de trabajo, cada una con los datos de relajación de carga sin procesar de cada muestra en el grupo experimental que se probó en esta fecha en particular, es decir, el 30 de abril de 2022.
   15. Haga una pausa y observe que cada una de las muestras, como se indica en las fichas de la hoja de cálculo incluidas en este archivo de Microsoft Excel, se sometió posteriormente a un fallo mecánico bajo carga mecánica de tracción.
       NOTA: Los datos de fallo correspondientes para cada una de las muestras presentes deben almacenarse en la carpeta Fallo (Post-Relajación), descrita con más detalle en el paso 4.1.20.
   16. Asegúrese de que las muestras estén etiquetadas utilizando la convención descrita en el paso 4.1.8.
   17. Alterne entre cada pestaña de hoja de cálculo que se encuentra en el archivo actual de Microsoft Excel y consulte el paso 4.1.9 para asegurarse de que los datos de relajación de carga sin procesar para cada muestra, indicados por cualquier pestaña de hoja de cálculo dada, tengan el formato correcto.
   18. Guarde y cierre el archivo actual de Microsoft Excel, Relajación | 043022.xlsx.
   19. Vuelva al directorio de trabajo del software de análisis de datos.
   20. Desplácese hasta la carpeta Error (post-relajación).
   21. Asegúrese de que hay un archivo de Microsoft Excel con las mismas fechas (consulte el paso 4.1.6 para obtener detalles sobre cómo asignar un nombre a los archivos de Microsoft Excel correspondientes a cada fecha de prueba) que el presente en la carpeta Relajación.
       NOTA: Los datos contenidos en la carpeta actual, Fallo (post-relajación), son los datos de fallos mecánicos sin procesar correspondientes de muestras traqueales sometidas a pruebas de relajación por tensión a un alargamiento fijo del 10% durante 300 s.
   22. Fracaso abierto (post-relajación) | 043022.xlsx y reconocer varias pestañas de hoja de cálculo, cada una de las cuales contiene datos de fallos mecánicos sin procesar de las mismas muestras presentes en Relaxation | 043022.xlsx.
   23. Asegúrese de que las muestras estén etiquetadas utilizando la convención mencionada en el paso 4.1.8 y que las etiquetas coincidan con las de Relajación | 043022.xlsx.
       NOTA: Por ejemplo, los datos en el archivo actual de Microsoft Excel para el TA_1_10% representan datos de falla mecánica sin procesar para la muestra traqueal # 1 bajo carga axial que previamente se sometió a pruebas de relajación de tensión al 10 % de elongación fija durante 300 s.
   24. Alterne entre cada pestaña de hoja de cálculo y consulte el paso 4.1.9 para asegurarse de que la columna de encabezado para los datos de fallas mecánicas sin procesar para cada muestra tenga el formato correcto.
   25. Cierre el archivo actual de Microsoft Excel, Error (posterior a la relajación) | 043022.xlsx.
   26. Vuelva al directorio de trabajo del software de análisis de datos.
   27. Repita los pasos 4.1.5-4.1.26 para obtener fechas de prueba adicionales, según corresponda.
   28. Abra el archivo de Microsoft Excel, testingDates.xlsx, que dirigirá el código para analizar las fechas de prueba especificadas por el usuario.
   29. Enumere las fechas de prueba en la primera columna en el siguiente formato: mm/dd/aa.
   30. En la segunda columna, indique utilizando una Y (para sí) o N (para no) si alguna muestra en esta fecha de prueba en particular era del grupo experimental (relajación de la tensión seguida de falla mecánica).
   31. En la tercera columna, indique utilizando una Y (para sí) o N (para no) si alguna muestra en esta fecha de prueba en particular pertenecía al grupo de control (falla mecánica directa).
   32. Repita los pasos 4.1.29-4.1.31 para fechas de prueba adicionales.
   33. Guarde y cierre el archivo actual de Microsoft Excel, testingDates.xlsx.
   34. Vuelva al directorio de trabajo del software de análisis de datos.
   35. Abra el archivo de script principal, main_relax_failure.m.
   36. Seleccione la flecha verde grande en la interfaz del software para ejecutar el código. Como alternativa, escriba run main_calc_relax en la ventana de comandos.
   37. Cuando se le solicite, introduzca niveles de elongación fijos separados por comas (en %) para los distintos grupos experimentales y pulse OK.
       NOTA: En el presente estudio, solo se utilizó un alargamiento de relajación por estrés, es decir, ingresar 10. No incluya 0% para el grupo de control. Sin embargo, si los datos se derivaron de múltiples elongaciones, por ejemplo 10% y 20%, introduzca 10,20.
   38. Cuando se le solicite, ingrese las duraciones de las pruebas de relajación de estrés separadas por comas (en segundos) para los diversos grupos experimentales y presione OK.
       NOTA: En el presente estudio, las muestras traqueales se mantuvieron en una elongación fija durante 300 s y, por lo tanto, en la entrada 300. Sin embargo, si los datos se derivaron de múltiples duraciones de relajación del estrés, por ejemplo, 90 s y 300 s, ingrese 90,300.
2. Respuesta de relajación del estrés viscoelástico
   1. Usando el código (main_relax_failure.m), convierta los datos de tiempo de carga (línea de código 144) en datos de tiempo de tensión nominal utilizando la siguiente ecuación¹⁹: , donde σ representa la tensión (mega Pascales [MPa]), F representa la carga circunferencial o axial (Newtons [N]), y A₀ representa el área de la sección transversal inicial (milímetros cuadrados [mm²]).
   2. Utilizando el código (main_relax_failure.m), determine la carga máxima y las magnitudes de tensión (líneas de código 138 y 146) en respuesta a la aplicación del alargamiento fijo del 10% en la muestra al comienzo de la prueba de relajación de 300 s.
      NOTA: Estos valores se denominan en lo sucesivo carga máxima inicial y tensión máxima inicial, respectivamente.
   3. Usando el código (main_relax_failure.m), calcule el porcentaje de reducción de la tensión (o carga) a 300 s (líneas de código 141 y 149) utilizando la siguiente ecuación: , donde Rel% representa el porcentaje de relajación, σ(0⁺) representa la tensión máxima inicial (o carga máxima inicial) y σ(300) representa el nivel de tensión (o carga) registrado después de la relajación de más de 300 s.
   4. Consulte el código (main_relax_failure.m) para modelar la respuesta de relajación de tensión viscoelástica (líneas de código 152-161) utilizando un modelo de decaimiento exponencial de la serie Prony de dos términos. Este modelo es comúnmente utilizado para describir el comportamiento viscoelástico de diversos tejidos biológicos, incluyendo varios niveles de la vía aérea cartilaginosa (tráquea, bronquios grandes y bronquios pequeños)^21,22.
      NOTA: Los valores de estrés calculados [σ(t)] se normalizan para producir la siguiente función de relajación reducida: y G(0) = 1. Para comparar las respuestas viscoelásticas de tensión-relajación, G(t) se ajusta a la curva utilizando regresión no lineal de mínimos cuadrados de la siguiente manera: , donde t es el tiempo durante la retención de relajación del estrés, g es el coeficiente de relajación, τ₁ y τ₂ e indican los tiempos de relajación (en segundos) que describen el comportamiento a corto (inicial) y largo plazo (equilibrio) del tejido, respectivamente.
3. Respuesta mecánica a fallos
   1. Utilice el código (main_relax_failure.m) para convertir los datos de carga-desplazamiento (líneas de código 143-144) registrados por la máquina de ensayo de tracción en datos de tensión-deformación nominal utilizando las ecuaciones mencionadas en la nota siguiente.
      NOTA: , donde σ representa la tensión nominal (MPa), F representa la carga circunferencial o axial (N) y A 0 representa el área de la sección transversal inicial (mm²); , donde representa la deformación resultante, Δ L representa el desplazamiento y L₀ representa la longitud inicial de la muestra. Para las muestras sometidas a pruebas de tracción de falla después de la retención de relajación de tensión, L₀ representa la longitud preestirada del tejido. Por ejemplo, la muestra 3 (longitud inicial de 8 mm) fue preestirada al 10%, y por lo tanto, L₀ se consideró 8,8 mm para calcular los valores de deformación resultantes¹⁹.
   2. Utilice la función (calc_relax_failure.m) para identificar la carga máxima (es decir, la carga de falla) y el desplazamiento de falla correspondiente, así como la tensión máxima (es decir, la tensión de falla) y la tensión de falla correspondiente (líneas de código 33 y 61-63).
   3. Utilice la función (calc_relax_failure.m) para descartar los datos de desplazamiento de carga después de la carga de error (línea 34).
   4. Utilice la función (calc_relax_failure.m) para trazar la curva de desplazamiento de carga y, cuando se le solicite, seleccione manualmente dos puntos en la región lineal de la curva para aproximar la rigidez del tejido (N/mm) (líneas de código 37-58).
      NOTA: Dado que la curva de desplazamiento de carga se normaliza por el área de sección transversal y la longitud inicial de la muestra para producir la curva de tensión-deformación, el código utiliza las coordenadas x e y seleccionadas por el usuario de la curva de desplazamiento de carga para calcular el módulo de elasticidad (MPa) utilizando la siguiente ecuación¹⁹: , donde E representa el módulo de elasticidad, x e y representan las coordenadas seleccionadas en la curva de desplazamiento de carga, A 0 representa el área de la sección transversal, L₀ representa la longitud de la muestra al comienzo de la falla mecánica, y Δσ y Δ representan el cambio en la tensión y la tensión sobre la región lineal de la respuesta a la falla, respectivamente.
   5. Repita el paso 4.3.4 para cada muestra.
4. Salida de datos
   1. Una vez que el código se haya ejecutado correctamente, asegúrese de que los resultados calculados estén disponibles en el directorio de trabajo del software de análisis de datos como un archivo de Microsoft Excel en la siguiente convención de nomenclatura: relax_failure_results_mmddyy.xlsx, donde mmddyy se reemplazará por la fecha en que se ejecutó el código.

La Figura 1 muestra el tejido fallido cerca del sitio de sujeción y la presencia de tejido dentro de la pinza, lo que confirma que no hay deslizamiento durante la prueba de tracción. La Figura 2 indica varios sitios de falla, incluidos los sitios de sujeción superior o inferior o a lo largo de la longitud del tejido, que se observaron durante las pruebas de tracción entre las muestras analizadas. Los resultados del análisis de los datos se resumen en las Figuras 3-4 y en las Tablas 1-2. Las respuestas de relajación del estrés para muestras traqueales después de un preestiramiento axial o circunferencial al 10% de deformación se muestran en la Figura 3. La carga máxima inicial y la tensión, el porcentaje de reducción de la tensión sobre la retención de 300 s y las constantes de tiempo, t1 y t2, en una función de relajación de la serie Prony de 2 términos se calcularon a partir de estas curvas de relajación. Estos parámetros viscoelásticos se incluyen en la Tabla 1. Las respuestas de tensión-deformación de la muestra traqueal sometida a prueba de falla bajo cargas axiales o circunferenciales después de ningún pre-estiramiento o 10% pre-estiramiento se muestran en la Figura 4. A partir de estas curvas, se determinaron la tensión de falla y la deformación de falla correspondiente, así como el módulo de elasticidad, que se enumeran en la Tabla 2.

Las pruebas preliminares caracterizaron con éxito las respuestas de relajación del estrés del tejido traqueal. En estos experimentos iniciales, la respuesta de relajación previa al estiramiento del 10% informó que la tensión máxima inicial era mayor en las direcciones de carga axial, mientras que el porcentaje de reducción en la tensión fue mayor en la dirección de carga circunferencial en comparación con la dirección de carga axial (Tabla 1). Los tiempos de relajación (τ1 y τ2 que describen el comportamiento de equilibrio a corto [inicial] y largo plazo del tejido) también fueron más altos en la dirección de carga axial en comparación con la dirección de carga circunferencial para el mismo grupo de preestiramiento del 10%. Al comparar los datos de falla, los valores de tensión de falla y E fueron mayores en las direcciones de carga circunferencial en los grupos de pre-estiramiento del 0% y 10%, mientras que la deformación de falla reportada en las direcciones de carga axial fue mayor (Tabla 2). Estos hallazgos preliminares justifican experimentos adicionales para caracterizar aún más las respuestas de relajación y falla del estrés en el tejido traqueal para comprender mejor sus respuestas de relajación del estrés en condiciones de carga de tracción, tanto axial como circunferencialmente. Los pasos descritos en este protocolo pueden ayudar a lograr este objetivo.

Figura 1: Recolección de tejidos y detalles de pruebas mecánicas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sitios de falla. Muestre los sitios de falla indicados por flechas amarillas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Respuesta de relajación por estrés sobre una retención de 300 s de muestras de tráquea preestiradas al 10% de tensión. (A) Carga axial o (B) circunferencial (n = 1 por condición de carga). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Respuestas de tensión-deformación para la prueba de falla de muestras de tráquea bajo carga axial o circunferencial después de ningún preestiramiento o 10% de preestiramiento (n = 1 por condición de carga). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Tabla 1: Valores medidos y calculados de los parámetros de relajación de la tensión para muestras de tráquea sometidas a un preestiramiento de una deformación del 10% para someterse a una relajación del estrés durante 300 s.

Tabla 2: Respuestas a fallos de muestras de tráquea en varios grupos experimentales.

Archivo de codificación suplementario 1: Los códigos personalizados para estudiar el comportamiento de estrés-relajación de la tráquea. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Los autores no tienen nada que revelar.