Artículo de método
El presente protocolo describe el uso de la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) para analizar la cinética de asociación y disociación de la unión entre un aptámero de ADN y tetraciclina, incluida la preparación de muestras, los patrones de ejecución y las muestras, y la interpretación de los datos resultantes.
La determinación de la afinidad y el comportamiento de unión entre un aptámero y su objetivo es el paso más crucial en la selección y el uso de un aptámero para su aplicación. Debido a las drásticas diferencias entre el aptámero y las moléculas pequeñas, los científicos deben esforzarse mucho en caracterizar sus propiedades de unión. La calorimetría de titulación isotérmica (ITC) es un enfoque poderoso para este propósito. ITC va más allá de determinar constantes de disociación (Kd) y puede proporcionar los cambios de entalpía y la estequiometría de unión de la interacción entre dos moléculas en la fase de solución. Este enfoque lleva a cabo una valoración continua utilizando moléculas sin etiquetas y registra el calor liberado a lo largo del tiempo sobre los eventos de unión producidos por cada valoración, por lo que el proceso puede medir con sensibilidad la unión entre macromoléculas y sus pequeños objetivos. Aquí, el artículo presenta un procedimiento paso a paso de la medición ITC de un aptámero seleccionado con un objetivo pequeño, la tetraciclina. Este ejemplo demuestra la versatilidad de la técnica y su potencial para otras aplicaciones.
Los aptámeros son fragmentos de ssDNA o ARN seleccionados a través de un proceso de evolución con alta afinidad y especificidad de unión a las dianas deseadas1,2, que pueden funcionar como elementos de reconocimiento avanzado o anticuerpos químicos 3,4,5. Por lo tanto, la afinidad y especificidad de unión de los aptámeros a sus objetivos juegan un papel crucial en la selección y aplicación de un aptámero, y la calorimetría de titulación isotérmica (ITC) se ha utilizado ampliamente para estos fines de caracterización.....
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NOTA: La Figura 2 muestra los pasos principales del experimento ITC para determinar la asociación termodinámica y cinética de un aptámero de ADN y tetraciclina.
1. Preparación de las muestras
NOTA: Las muestras para ITC deben prepararse en el mismo tampón tanto para el aptámero como para el ligando, a fin de evitar la liberación de calor causada por la mezcla de diferentes tampones de la celda y la jeringa de la muestra. Esto generalmente se logra a través de la diálisis de todos los materiales en el mismo tampón. El tampón se intercambia utilizando un protocolo adapta....
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ITC proporciona una constante de disociación precisa (Kd), la estequiometría de unión y los parámetros termodinámicos de las interacciones de dos moléculas6. En este ejemplo, el aptámero seleccionado por Kim et al.9,11 se une a la tetraciclina con afinidades de unión de K d 1 = 13 μM, Kd 2 = 53 nM. Curiosamente, esta unión se determinó utilizando el método de filtración de equili.......
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El método presentado aquí fue modificado de acuerdo con las instrucciones de TA Instruments y es suficiente para determinar la afinidad de unión y la termodinámica de muchos aptámeros y objetivos seleccionados en nuestro centro. Los pasos cruciales de este procedimiento incluyen el intercambio del tampón para tener un objetivo que coincida con el ligando, ejecutar muestras con los parámetros adecuados y encontrar el modelo de ajuste de unión apropiado para analizar los datos. El registro continuo de la liberación de calo.......
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Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 5'-CGTACGGAATTCG CTAGCCCCCCGGCAGGCCACGG C TTGGGTTGGTCCCACTGCGGGGGGGGGGGGGG TGGATCCGAGCTCCAC GTG-3'Integrated | DNA Technologies, Inc | La secuencia se adopta de la investigación de Gu, que no ha identificado Kd utilizando ITC (consulte las referencias 8 y 9) | |
| Affinity ITC Auto Low Volume (190 µ L) Sistema completo– Gold Cells | TA Instruments | 61000.901 | Sistema de calorimetría de titulación isotérmica |
| CaCl2 | Avantor (VWR) | E506-100ML | Cloruro de calcio 1 M en solución acuosa, grado biotecnológico, |
| centrífuga | Eppendorf | 5417R | La Eppendorf 5417R es insuperable en seguridad, fiabilidad y facilidad de uso. Muy fácil de mantener con un motor sin escobillas que gira hasta 16.400 RPM con RCF máximo de hasta 25.000 x g. |
| Estación de desgasificación completa (110/230V) | TA Instruments | 6326 | Este desgasificador proporciona una plataforma de agitación autónoma, una cámara de vacío, un puerto de vacío, un control de temperatura y un temporizador electrónico para la preparación adecuada de la muestra. |
| EDTA | TekNova | E0375 | EDTA 500 mM, pH 7.5 |
| NanoDrop One Microvolumen Espectrofotómetro UV-Vis | ThermoFisher | ND-ONE-W | Espectrofotómetro UV-Vis |
| Nanosep, Nanosep MF y NAB Dispositivos centrífugos | Pall Laboratory | OD030C34 | 3 kDa |
| PBS pH 7.4 | IBI Scientific IB70165 | Tampón que contiene fosfato de sodio, cloruro de sodio, fosfato de potasio y cloruro de potasio Grado ultrapuro estéril filtrado con 0.2 y micro; Filtro M. Esterilizado en autoclave a 121 ° C durante más de 20 min. | |
| Posi-Click 1.7 mL Tubos de Microcentrífuga de Tapa Grande | labForce (una marca de Thomas Scientific) | 1149K01 | |
| Tetraciclina, Hidrochorro | EMD Millipore Corperation | CAS64-75-5 |
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