Method Article

Desarrollo y prueba de dipéptidos nanoestructurados metilados que inhiben la actividad de la quinasa Src in vitro para aplicaciones anticancerígenas

DOI:

10.3791/64256

⸱

November 30th, 2022

 ,  , 
1Biochemistry Department, College of Science, King Abdulaziz University, 2Independent Scholar, 3School of Health Sciences and Biomedical Engineering, Hebei University of Technology, 4School of Engineering, Saveetha University, 5Programa de Pós-graduação em Ciência e Engenharia dos Materiais, UFPI

In This Article

Retraction Notice

The article Developing and Testing Methylated Nano-Structured Dipeptides that Inhibit Src Kinase Activity In Vitro for Anti-Cancer Applications has been retracted by the journal due to authorship and reproducibility concerns.

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí se presenta un protocolo para diseñar y probar dipéptidos que pueden inhibir la actividad de la enzima quinasa Src utilizando ensayos acelulares y celulares para aplicaciones anticancerígenas. Los péptidos formulados aquí (W-RCH3, WCH3-R CH3 y W-R(CH3)2) inhibieron la cinasa Src con valores de IC50 de 510 nM, 916 nM y 1 μM, respectivamente.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aquí, con el objetivo de desarrollar un nuevo tratamiento contra el cáncer, se diseñaron siete dipéptidos que contenían triptófano metilado y/o arginina metilada y se produjeron utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc. La sobreexpresión de la enzima tirosina quinasa Src se ha implicado en el desarrollo de diferentes tipos de cáncer. Se ha demostrado anteriormente que los dipéptidos que contienen aminoácidos no naturales como la arginina metilada (RCH3), la arginina dimetilada (R(CH3)2) y/o los residuos de triptófano metilado (WCH3) inhiben la cinasa Src. En este estudio, tres de estos dipéptidos, W-RCH3, WCH3-R CH3 y W-R(CH3)2, se probaron mediante ensayos acelulares y se encontró que tenían valores de IC50 (la concentración a la que se produce la inhibición del 50%) de 510 nM, 916 nM y 1 μM, respectivamente. Estos valores fueron comparables a los obtenidos para los péptidos cíclicos penta- a nano-W-R ([W-R]5-[W-R]9) sintetizados en estudios previos. Sin embargo, las versiones no metiladas de los dipéptidos no mostraron ninguna actividad inhibitoria contra la quinasa Src. Todos estos dipéptidos (50 μM) no mostraron ninguna citotoxicidad después de la incubación hasta 72 h con tres líneas celulares cancerosas diferentes, incluidas las líneas celulares de leucemia (CCRF-CEM), adenocarcinoma de mama (MDA-MB-231) y adenocarcinoma de ovario (SK-OV-3), lo que indica la permeabilidad limitada de los péptidos a través de la membrana celular. Por lo tanto, se necesitan más estudios para mejorar la permeabilidad de estos péptidos para aplicaciones anticancerosas, como el uso de un portador de péptidos o la funcionalización adicional de péptidos. En resumen, este estudio proporciona un protocolo para sintetizar y probar péptidos que inhiben la actividad de la quinasa Src y, por lo tanto, poseen una capacidad anticancerígena prometedora, como se ha demostrado mediante ensayos acelulares y celulares.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El cáncer es causado por el crecimiento anormal de células normales y es una de las enfermedades más letales en todo el mundo. Estas células anormales se diseminan a diferentes órganos del cuerpo mediante un proceso llamado metástasis. La forma más común de cáncer es el cáncer de mama, que se presentó en 2,26 millones de personas en 2020. Además, en 2020 se produjeron alrededor de 1,80 millones de muertes por cáncer de pulmón1. Según la Organización Mundial de la Salud, alrededor de 10 millones de personas murieron de cáncer en 20202. Las células cancerosas difieren de las células normales en que sobreexpresan ciertas enzimas, como las proteínas tirosina cinasas (PTK). El Instituto Nacional del Cáncer define las quinasas como enzimas capaces de fosforilar otras proteínas o azúcares3. El conocimiento de la función reguladora de las cinasas puede facilitar el diseño de fármacos eficaces contra el cáncer. Por ejemplo, las PTK catalizan la fosforilación de otras proteínas o azúcares y, como consecuencia, el ATP se convierte en ADP por la pérdida de un grupo fosfato. Un 80% de los oncogenes y protooncogenes codifican PTKs4. Las cinasas Src son una familia de tirosina quinasas no receptoras, incluidas Lck, Fyn, Hck, Blk, Yes e Yrk, que se sobreexpresan en las células cancerosas, especialmente en el cáncer de mama 5,6. Las tirosina quinasas Src se asocian con la mitogénesis, la diferenciación, la activación de las células T y la transformación celular. Src ayuda a la invasión y metástasis de las células cancerosas debido a su capacidad para reducir la adhesión de las células cancerosas. Hay cinco dominios diferentes en la quinasa Src, ordenados de los terminales N a C como: dominio de ácidos grasos, dominio de homología Src 3 (SH3), dominio de homología Src 2 (SH2), dominio tirosina quinasa (SH1) y dominio regulador C-terminal7.

figure-introduction-1
Figura 1: Los dominios diana en la enzima quinasa Src, incluyendo un dominio SH3, un dominio SH2, un dominio quinasa (SH1) y un segmento regulador C-terminal corto. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

El dominio de cinasa SH1 es el objetivo más común cuando se diseñan inhibidores de la cinasa Src, ya que contiene dos sitios conservados para la unión de ATP y sustrato (Figura 1). Si se conoce la secuencia de aminoácidos del dominio quinasa, el sustrato también se puede utilizar como objetivo para diseñar un compuesto que imite la unión del sustrato a la quinasa Src8. Además, se pueden utilizar otros sitios como los dominios SH3 y SH2 como destinos. En comparación con otros agentes quimioterapéuticos, los inhibidores de la cinasa presentan menos toxicidad y mayor eficacia9. A partir de septiembre de 2021, hay 73 moléculas pequeñas que actúan como inhibidores de la quinasa que han sido aprobadas por la FDA10. El imatinib es un ejemplo de un fármaco contra el cáncer que inhibe selectivamente la actividad de la tirosina cinasa; Sin embargo, algunos pacientes son resistentes al fármaco debido a la aparición de una mutación puntual en el dominioquinasa 11. AstraZeneca lanzó Saracatinib, que es un fármaco que inhibe la familia Src de tirosina quinasas con un valor IC50 (la concentración a la que se produce la inhibición del 50%) de 2,7 nM, pero se descartó en los ensayos de fase 212. De los 52 inhibidores de PTK aprobados por la FDA de EE. UU. a principios de 2020,13 solo 28 PTK de receptor objetivo, 11 bloquean el PTK no receptor, 11 inhiben las proteínas quinasas de serina/treonina y dos bloquean MEK1/213. El creciente interés de la investigación en oncología continuará impulsando el descubrimiento de inhibidores de quinasas como posibles fármacos contra el cáncer. Sin embargo, hasta el momento, solo 50 de las 500 proteínas quinasas han sido objeto de tratamiento; Por lo tanto, se espera que se estudie un mayor número de quinasas para el desarrollo de fármacos en un futuro próximo14. Además, es necesario descubrir inhibidores de la quinasa para explorar mutaciones de la quinasa aún no identificadas que conducen al cáncer.

Por lo tanto, este estudio tuvo como objetivo desarrollar péptidos que pudieran usarse como inhibidores para la familia Src y dirigirse al sitio de unión de ATP debido a su capacidad para servir como un sitio conservado entre diferentes quinasas. Con este fin, se sintetizaron y probaron una serie de dipéptidos que contenían triptófano metilado y/o arginina metilada para determinar su capacidad sinérgica para inhibir la quinasa Src. El anillo de indol del triptófano imita la adenina del ATP y compite con el ATP desde la unión hasta el sitio de unión del ATP. Además, la arginina metilada en el ligando compite por el dominio SH3 de Src. Los investigadores demostraron que un polipéptido que contiene arginina desmetilada inhibe el dominio SH3, posiblemente debido a una secuencia conservada específica en el motivo de unión SH3 (es decir, PXXP), que tiene una afinidad de unión a un ligando que contiene dos o tres residuos de Arg en el N-terminal o uno o dos residuos de Arg en el C-terminal de los ligandos15, 16,17. El grupo guanidino de Arg se une al residuo conservado de Asp-99 del dominio SH318,19, mientras que la porción restante del Arg se une al Trp-118 conservado de la enzima, como se confirma a partir del análisis de RMN y las estructuras cristalinas de varios dominios SH319. Aquí, se presenta un protocolo para la síntesis de siete dipéptidos metilados y la prueba de su capacidad de inhibición frente a la quinasa Src. Además, se examinó la capacidad de estos péptidos para matar varias líneas celulares cancerosas in vitro.

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Protocol

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1. Síntesis de péptidos

NOTA: La síntesis de W-R se describe como un ejemplo representativo (Figura 2).

  1. Pesar 566 mg (0,3 mmol) de resina H-Arg(Pbf)-2-clorotririllo y añadirla al recipiente de síntesis de péptidos (ver Tabla de Materiales), según el procedimiento utilizado por Mandal et al20. Realizar la síntesis de péptidos utilizando la estrategia bien establecida de síntesis de péptidos en fase sólida (SPPS)21.
    NOTA: Los dipéptidos metilados o dimetilados que contenían aminoácidos no naturales se ensamblaron en una resina de rink amida (capacidad de carga de 0,3 mmol/g), mientras que los dipéptidos que contenían aminoácidos naturales se ensamblaron en una resina que tenía el primer aminoácido adherido, como la resina H-Arg(Pbf)-2-clorotririllo (capacidad de carga de 0,3 mmol/g). Es importante destacar que la resina de amida de pista produce un péptido cubierto con un NH2 C-terminal.
  2. Hinche la resina seca durante 1 h en 5 mL de N,N-dimetilformamida (DMF) bajo presión de gas nitrógeno conectado con el recipiente peptídico.
    NOTA: Realice todo el proceso de síntesis en una campana extractora. Se deben usar gafas, guantes y una bata de laboratorio durante todo el experimento. Un temporizador también es esencial para realizar un seguimiento entre los pasos de adición de reactivos químicos.
  3. Elimine el exceso de DMF utilizando la presión del gas nitrógeno conectado con el recipiente de síntesis de péptidos durante todo el proceso de síntesis.
  4. Pesa 473,9 mg de Fmoc-trp(Boc)-OH (0,9 mmol) y 341 mg de 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametilorronio hexafluorofosfato (HBTU) (0,9 mmol) como reactivos de acoplamiento. Añadir los polvos a un tubo de ensayo y disolverlos en 5 mL de DMF seco.
  5. Añadir 313,4 μL (1,8 mmol) de N,N-diisopropiletilamina (DIPEA) como agente activador en el tubo de ensayo (paso 1.4) y mezclar agitando el tubo.
  6. Agregue el contenido del tubo de ensayo a la resina y deje que la reacción continúe durante 1 h bajo gas nitrógeno a temperatura ambiente. A continuación, drena el exceso de DMF con gas nitrógeno a presión y lava la resina 3 veces con DMF.
  7. Desproteja el Fmoc N-terminal con 5 mL de piperidina al 20% en DMF (v/v) durante 20 min bajo gas nitrógeno. Lavar la resina 3 veces con DMF (3 x 5 mL).
  8. Seque la resina agregando 5 mL de diclorometano (DCM) y manténgala bajo gas nitrógeno durante 5 minutos, luego drene el DCM usando la presión del gas nitrógeno. Agregue 5 mL de metanol bajo gas nitrógeno durante 5 min para aumentar la sequedad de la resina.
  9. Añadir 10 mL de un cóctel de escisión recién preparado de TFA/tioanisol/ditiotreitol/anisol (90:3:5:2 v/v/p/v) durante 2,5 h para desproteger todas las cadenas laterales y escindir el dipéptido de la resina.
    PRECAUCIÓN: El cóctel de escisión debe agregarse en un cilindro medidor de vidrio ya que el TFA es ácido y peligroso; Tenga cuidado al usarlo.
  10. Después de 2,5 h, drene la solución de reacción del recipiente peptídico utilizando presión de nitrógeno en un matraz de fondo redondo. Añadir 250 mL de éter dietílico frío (Et2O) al matraz de fondo redondo que contiene el péptido crudo para precipitar el péptido.
  11. Filtre el péptido precipitado usando un papel de filtro en un embudo cónico con un brazo lateral que esté conectado con agua (de modo que la filtración ocurra debido a la presión del agua) y recoja el precipitado (los péptidos) para eliminar completamente el éter. El péptido crudo precipita en 10 minutos.
  12. Purifique el péptido crudo en una columna de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de fase inversa (consulte la tabla de materiales) utilizando un sistema de gradiente. Utilice un gradiente de acetonitrilo de 0%-100% que contenga 0,1% de TFA en agua que contenga 0,1% de TFA durante 30-60 min a un caudal de 1 mL/min.

figure-protocol-1
Figura 2: Síntesis de péptidos en fase sólida de W-R. Abreviaturas: HBTU = 2-(1H-benzotriazol-1-il)-1,1,3,3-tetrametiluronio hexafluorofosfato; DIPEA = N,N-diisopropiletilamina; TFA = ácido trifluoroacético; DMF = dimetilformamida. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Determinación de la toxicidad celular de los péptidos sintetizados

  1. Coloque 2.000 células/pocillo de células SK-OV-3, 5.000 células/pocillo de células MDA-MB-231 o 5 × 106 células/pocillo de células CCRF-CEM (en un volumen total de 100 μL/pocillo) en una microplaca de 96 pocillos. Incubar las células en una atmósfera humidificada de 5% de CO2, 95% de aire a 37 °C hasta que alcancen una confluencia del 75%-80%.
    NOTA: El medio RPMI-16 se utiliza para cultivar células CCRF-CEM y el medio esencial mínimo de Eagle (EMEM) para las líneas celulares MDA-MB-231 y SK-OV-3. Ambos medios se complementan con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y un 1% de penicilina/estreptomicina (10.000 unidades/mL de penicilina y 10 mg/mL de estreptomicina en NaCl al 0,9%). Coloque todos los medios y suplementos en un baño de agua a 37 °C durante 30 minutos antes de comenzar el experimento. El experimento debe realizarse con una capucha de bioseguridad, usando guantes y una bata de laboratorio.
  2. Aspire el medio con una pipeta y agregue 100 μL del péptido de 50 μM o 10 μM de doxorrubicina (Dox) utilizada como control positivo por triplicado en pocillos que contengan los tres tipos diferentes de células cancerosas colocadas en la placa de 96 pocillos. Regrese la placa a la incubadora durante 72 h (en las mismas condiciones que se mencionaron en el paso 2.1).
  3. Después de 72 h, agregue 20 μL de 3-(4,5-dimetiltiazol-2-il)-5-(3-carboximetoxifenil)-2-(4-sulfofenil)-2H-tetrazolio (MTS) en la placa de 96 pocillos. Envuelva la placa con papel de aluminio e incube la placa durante 1-4 h a 37 °C en una atmósfera humidificada.
    NOTA: MTS es un colorante que se usa para visualizar células vivas (sin tratar o tratadas con los péptidos), ya que solo las células vivas convierten el tetrazolio MTS en un tinte de formazano coloreado que se puede medir a 490 nm.
  4. Mida la absorbancia del producto de formazano a 490 nm (A490) en un lector de microplacas (ver Tabla de Materiales). Incluya medio mezclado con MTS como blanco para el experimento. Utilice agua sola (ya que los péptidos son solubles en agua) y 0,1 N HCl (ya que WCH3 requiere HCl para disolverse) como controles negativos.
  5. Mida el porcentaje de supervivencia celular usando la siguiente ecuación (Ec 1), usando un programa de hoja de cálculo (ver Tabla de Materiales). El procedimiento es el mismo que el utilizado por Mandal et al20.
    figure-protocol-2Ecesión (1)

3. Ensayo de actividad de la quinasa c-Src

NOTA: El ensayo de actividad de la quinasa Src se realizó utilizando un kit de ensayo comercial (ver Tabla de Materiales) por triplicado, de acuerdo con el procedimiento de Chhikara et al.22. Utilice WCH3 y RCH3 solos como controles para comparar el efecto del aminoácido metilado solo sobre la cinasa y con otro aminoácido metilado o no metilado.

  1. En una microplaca de fondo redondo de superficie negra no vinculante de bajo volumen de 384 pocillos, agregue 2,5 μL del cóctel de reacción que contiene 0,7 nM de dominio de quinasaHis 6-Src en tampón de quinasa, que forma parte del kit de ensayo, a 2,5 μL de péptidos prediluidos disueltos en DMSO al 10% (concentración objetivo 4x). Incubar durante 10 min a temperatura ambiente utilizando un agitador de microplacas (5 rpm) siguiendo el protocolo del fabricante.
    NOTA: El cóctel de reacción consiste en el tampón de quinasa (200 mM HEPES, pH 7.5), MgCl2 (16 mM), DMSO (4%), EGTA (8 mM), 2-mercaptoetanol (43 mM) y Brij-35 (0.04%). El sustrato óptimo de la reacción de la quinasa de este experimento es (AEEEIYGEFEAKKKK).
  2. Añadir 5 μL del cóctel ATP/sustrato (40 μM/600 μM) a la placa e incubar durante 30 min en un agitador de microplacas a temperatura ambiente.
  3. Mientras tanto, prepare la mezcla de detección de ADP 1x que contiene 8 nM de trazador ADP y 10 μg/mL de anticuerpo ADP2 conjugado con colorante (consulte la Tabla de materiales) para detener y detectar el tampón B (1x) del kit. Detenga la reacción de quinasa (paso 3.2) añadiendo 10 μL de la mezcla de detección 1x ADP e incube durante 1 h a temperatura ambiente.
  4. Mida la intensidad de fluorescencia utilizando un lector de microplacas, con excitación a 580 nm, emisión a 630 nm y ancho de banda de 10 nm. Obtener unidades de fluorescencia relativa (RFUs) del instrumento para obtener el porcentaje de inhibición de la enzima, según la Ec (2).
    figure-protocol-3Ecesión (2)
  5. Calcule el valor de IC50 tal como figura en el sitio web de la empresa23.

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Results

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W-RCH3, WCH3-R CH3, W-R(CH3)2, WCH3-R, WCH3-R(CH3)2 y los péptidos W-R de control se sintetizaron utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida Fmoc (Figura 3), con una pureza del 95%, 98,7%, 99%, 100%, 100% y 99,5%, respectivamente. Las estructuras químicas de estos dipéptidos se confirmaron mediante ESI-MS. Los valores m/z de estos dipéptidos fueron 374,1624, 388,1949, 388,1794, 374,1815, 402,2022 y...

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Discussion

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Los péptidos fabricados y probados aquí para la inhibición de la quinasa Src y la consiguiente destrucción de las células cancerosas contenían triptófano metilado y/o arginina metilada, que son aminoácidos no naturales. La formación del precipitado blanco al agregar éter dietílico es un paso crítico en la síntesis de estos péptidos. Sin embargo, no todos los péptidos sintéticos pueden formar un precipitado; por lo tanto, incluso cuando no se forma un precipitado, la síntesis exitosa de p...

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Disclosures

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Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nos gustaría agradecer al Decanato de Investigación Científica (DSR) de la Universidad Rey Abdulaziz (KAU), Jeddah, Arabia Saudita, que ha financiado este proyecto bajo la subvención no. (G: 031-130-1443).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-ditiotreitolSigma-Aldrich10708984001Síntesis de péptidos
Embudo de filtro fritado de Aldrich para síntesis en fase sólidaSigma-AldrichZ283304recipiente de síntesis de péptidos
Alexa594 TracerBell Brook Labs, Madison, WI3013
AnísolSigma-Aldrich8014520500
CellTiter 96 AQueous One  Solución  Reactivos de ensayo de proliferación celular PromegaG3582Ensayo de proliferación celular (reactivo MTS)
Diclorometano, 99,9%, Fishersci Extra SecoAC326850025
Fmoc-ADMA(Pbf)-OHSigma-Aldrich8521070001
Fmoc-Arg(Me,Pbf)-OHSigma-Aldrich8521050001
Fmoc-Arg(Pbf)-OHSigma-Aldrich8520670025
Fmoc-Trp(Boc)- OHSigma-Aldrich47561-25G-F
HPLC C18 columna Shimadzu  (Sistema RP-HPLC)gradiente de agua/acetonitrilo
IRDye QC-1 extintorBell Brook Labs, Madison, WI3013
Lector de microplacas SpectraMax M2eDispositivos
Microsoft ExcelSoftware de hoja de cálculoMicrosoft
N,N-Diisopropiletilamina (DIPEA)Sigma-Aldrich496219
N,N-Dimetilformamida, anhidro, 99.8%FishersciAA43997M1
Piperidina 20%Sigma-Aldrich80645
Resina de amida para pista (malla 100-200)Sigma-Aldrich8550010025
ThioanisolSigma-Aldrich92358
Transcreener Ensayo ADP2 FI BellBrook Labs, Madison, WI3013Kit de ensayo de actividad de quinasa c-Src
molecularesde

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