Cuantificación experimental de las interacciones entre los sistemas de administración de fármacos y las células in vitro: una guía para la evaluación preclínica de nanomedicina

Summary

Se demuestra un flujo de trabajo para la cuantificación absoluta de las interacciones fármaco-célula portadora utilizando citometría de flujo para permitir una mejor evaluación racional de nuevos sistemas de administración de fármacos. Este flujo de trabajo es aplicable a portadores de medicamentos de cualquier tipo.

Abstract

Un componente importante del diseño de sistemas de administración de fármacos se refiere a cómo amplificar o atenuar las interacciones con tipos específicos de células. Por ejemplo, un quimioterapéutico podría funcionalizarse con un anticuerpo para mejorar la unión a las células cancerosas ("dirigido") o funcionalizarse con polietilenglicol para ayudar a evadir el reconocimiento de células inmunes ("sigilo"). Incluso a nivel celular, optimizar la unión y la absorción de un portador de fármacos es un problema complejo de diseño biológico. Por lo tanto, es valioso separar la fuerza con la que un nuevo portador interactúa con una célula de la eficacia funcional de la carga de un transportista una vez entregada a esa célula.

Para continuar con el ejemplo quimioterapéutico, "qué tan bien se une a una célula cancerosa" es un problema separado de "qué tan bien mata una célula cancerosa". Los ensayos cuantitativos in vitro para estos últimos están bien establecidos y generalmente se basan en la medición de la viabilidad. Sin embargo, la mayoría de las investigaciones publicadas sobre las interacciones célula-portador son cualitativas o semicuantitativas. En general, estas mediciones se basan en el etiquetado fluorescente del portador y, en consecuencia, informan interacciones con las células en unidades relativas o arbitrarias. Sin embargo, este trabajo puede estandarizarse y hacerse absolutamente cuantitativo con un pequeño número de experimentos de caracterización. Tal cuantificación absoluta es valiosa, ya que facilita las comparaciones racionales, inter e intraclase de varios sistemas de administración de fármacos: nanopartículas, micropartículas, virus, conjugados anticuerpo-fármaco, células terapéuticas diseñadas o vesículas extracelulares.

Además, la cuantificación es un requisito previo para los metanálisis posteriores o los enfoques de modelado in silico . En este artículo, se presentan videoguías, así como un árbol de decisión sobre cómo lograr la cuantificación in vitro para los sistemas de administración de medicamentos portadores, que tienen en cuenta las diferencias en el tamaño del portador y la modalidad de etiquetado. Además, se discuten otras consideraciones para la evaluación cuantitativa de los sistemas avanzados de administración de fármacos. Esto pretende servir como un recurso valioso para mejorar la evaluación racional y el diseño para la próxima generación de medicamentos.

Introduction

El diseño de construcciones de administración de fármacos que exhiben un comportamiento específico y diseñado dependiendo del tipo de célula que encuentren ha atraído un interés sustancial de la investigación. Las posibles construcciones o "portadores" de administración de fármacos incluyen formulaciones lipídicas, inorgánicos nanocultivados, ensamblajes poliméricos, vesículas extracelulares, células bacterianas funcionalizadas o virus modificados. Todos estos pueden exhibir especificidad de órganos, tejidos o células debido a propiedades físicas, propiedades de superficie o funcionalizaciones químicas diseñadas como la unión de anticuerpos

Protocol

1. Elegir la transmisión adecuada

1. Siga el árbol de decisión descrito en la Figura 1 para determinar el mejor flujo de trabajo (flujo) (Figura 2) para la configuración experimental utilizada. Consulte la discusión para obtener más comentarios sobre esta elección de corriente.
2. Si sigue el flujo del citómetro, continúe con los pasos 2.1.1-2.2.7. Si sigue la transmisión masiva, continúe con los pasos 3.1.1.1-3.1.5.7.

Results

Como se discutió anteriormente, los diferentes tipos de portadores de fármacos requieren el uso de diferentes técnicas para la cuantificación absoluta de la asociación célula-portador. Por ejemplo, las partículas de núcleo de poli(ácido metacrílico) estabilizado con disulfuro (PMA_SH) de 633 nm son lo suficientemente grandes y densas para su detección con un citómetro de flujo sensible. Como tal, estas partículas se marcaron fluorescentemente, luego se cerraron y se contaron utilizando la dispersión de luz de á.......

Discussion

La caracterización de las interacciones entre los portadores de fármacos y las células es cada vez más importante en el desarrollo de nuevos sistemas de administración de fármacos. Específicamente, para permitir la evaluación racional y la comparación de varias construcciones de portadores, la cuantificación absoluta del rendimiento de dicho portador para interactuar con las células objetivo y fuera del objetivo es crítica. Este protocolo describe una metodología de dos flujos que permite a cualquier investigador que tra.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Alexa Fluor 647 C2 Maleimide	Invitrogen	A20347	colorante estable al pH utilizado para marcar portadores de PMASH de 150 nm, 235 nm o 633 nm; ejemplo de buen colorante para usar en estudios de asociación de portadores
Apogee A50 Microflow	Apogee		Citómetro de flujo sensible capaz de detectar portadores pequeños para el conteo
CytoFLEX S Citómetro de flujo	Beckman Coulter		Citómetro de flujo sensible capaz de detectar portadores pequeños para el conteo y la lectura para los experimentos finales de barrera celular Software
FCS Express	De Novo		Software utilizado para analizar datos de citometría de flujo, es decir, realizar compuertas y derivar valores medios de intensidad de fluorescencia de las poblaciones de elección. Las alternativas incluyen FlowJo, OMIQ, Python
Infinite 200 PRO	Tecan Lifesciences		Instrumento lector de microplacas estándar utilizado para mediciones de fluorescencia masiva de portadores en solución
LSRFortessa Cell Analyzer	BD Biosciences		flujo menos sensible, pero uno más generalmente disponible para los investigadores. Se puede utilizar para leer el experimento final del portador de células
NanoSight NS300	Malvern Instrumento analítico		utilizado para el análisis de seguimiento de nanopartículas
Prisma 8	Software GraphPad		utilizado para graficar y calcular curvas estándar. Las alternativas incluyen Microsoft Excel, Origin, Minitab, Python, entre muchos otros,
kits Quantum MESF, Alexa Fluor 647	Bangs Laboratories	647	Cuentas de cuantificación absoluta para citómetro de flujo. Se utiliza para convertir intensidades de fluorescencia medidas a granel en un lector de microplacas en intensidades de fluorescencia medidas en un citómetro de flujo utilizando el estándar MESF