Summary
Mikrocomputertomografi (μCT) er et ikke-destruktivt billeddannelsesværktøj, der er medvirkende til at vurdere knoglestruktur i prækliniske undersøgelser, men der mangler konsensus om μCT-procedurer til analyse af knoglehelende callus. Denne undersøgelse giver en trinvis μCT-protokol, der muliggør overvågning af brudheling.
Abstract
Mikrocomputertomografi (μCT) er den mest almindelige billeddannelsesmodalitet til at karakterisere den tredimensionelle (3D) morfologi af knogle og nydannet knogle under brudheling i translationelle videnskabelige undersøgelser. Undersøgelser af heling af lange knoglebrud hos gnavere involverer typisk sekundær heling og dannelse af en mineraliseret callus. Formen af den dannede callus og densiteten af den nydannede knogle kan variere betydeligt mellem tidspunkter og behandlinger. Mens standardmetoder til kvantificering af parametre for intakt kortikal og trabekulær knogle er meget udbredt og indlejret i kommercielt tilgængelig software, mangler der enighed om procedurer til analyse af helbredende callus. Formålet med dette arbejde er at beskrive en standardiseret protokol, der kvantiterer knoglevolumenfraktion og callus mineraltæthed i den helbredende callus. Protokollen beskriver forskellige parametre, der skal overvejes under billeddannelse og analyse, herunder prøvejustering under billeddannelse, størrelsen af interessevolumen og antallet af skiver, der er kontureret for at definere callus.
Introduction
Mikrocomputertomografi (μCT) billeddannelse er blevet brugt i vid udstrækning i præklinisk knogleforskning, hvilket giver ikke-invasive, højopløselige billeder til evaluering af mikrostrukturen af knogler 1,2,3,4,5. μCT involverer et stort antal røntgenbilleder, opnået fra en roterende prøve eller ved hjælp af en roterende røntgenkilde og detektor. Algoritmer bruges til at rekonstruere 3D volumetriske data i form af en stak billedskiver. Klinisk CT er guldstandarden for 3D-billeddannelse af menneskelige knogler, og μCT er en almindeligt anvendt teknik til evaluering af knoglehelingseffektivitet hos forsøgsdyr 1,2,3,4,6,7. Mineraliseret knogle har fremragende kontrast til røntgen, mens blødt væv har relativt dårlig kontrast, medmindre der anvendes et kontrastmiddel. I vurderingen af brudheling genererer μCT billeder, der giver detaljerede oplysninger om 3D-strukturen og densiteten af den mineraliserede callus. In vivo μCT-scanning kan også bruges til langsgående tidsforløbsvurdering af frakturheling.
Kvantificeringen af intakt kortikal og trabekulær knogle ved hjælp af μCT er generelt veletableret og standardiseret8. Selvom prækliniske undersøgelser bruger en række kvantificeringsmetoder til at analysere frakturheling 9,10,11, er en detaljeret protokol for μCT-billedanalyse til calluskvantificering endnu ikke blevet offentliggjort. Derfor er formålet med denne undersøgelse at give en detaljeret trin-for-trin protokol til μCT-billeddannelse og analyse af knoglehelende callus.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Følgende protokol blev udviklet til at karakterisere langbenet helbredende callus høstet fra aflivede mus. De fleste af trinene kan dog anvendes på rotter og også bruges til in vivo-scanning af brækkede knogler. Protokollen beskriver et bestemt μCT-system og specifik billedbehandlings-, analyse- og visualiseringssoftware (se materialetabel), men metoden er generelt anvendelig til andre scannere og software. Protokollen blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee of Pennsylvania State University College of Medicine. Mus, der blev brugt i denne undersøgelse, var 16 uger gamle, mandlige C57BL/6J-mus (gennemsnitsvægt 31,45 ± 3,2 g).
1. Vævshøstning og konservering
BEMÆRK: Brug en passende murinfrakturmodel. Til dette studie blev mid-diaphyseal open tibial frakturmodellen anvendt i overensstemmelse med standardprotokollen beskrevet i12,13.
- Ved afslutningen af frakturmodelforsøget aflives musen ved at administrere en intraperitoneal injektion af ketamin eller xylazin (henholdsvis 500 mg / kg eller 50 mg / kg).
- Brug en saks til at høste den brækkede knogle fra midten af lårbenet til tibiotalarleddet uden at forstyrre brudstedet. Fjern musklerne omkring knoglen og efterlad kun det bløde væv, der er i direkte kontakt med knoglen for at understøtte brudstedet under de efterfølgende behandlingstrin. Fjern den intramedullære stift ved hjælp af mikro-myg lige hæmostatiske tang.
- Prøverne opbevares i formalin ved 4 °C eller i saltvand ved -20 °C. Valget af konserveringskøretøj afhænger af de tilsigtede anvendelser nedstrøms for μCT. I denne undersøgelse blev prøverne konserveret i saltvand ved -20 °C.
2. μCT-scanning
- Forberedelse af prøver
- For samtidig scanning af flere prøver placeres op til seks prøver i et specialudviklet, 3D-printet scanningsarmatur (figur 1 A, B) eller lignende. Samtidig scanning reducerer scanningstid og omkostninger. Den tilpassede armatur, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder seks slidser til at holde de lange knogleprøver og et centerhul til et hydroxyapatit (HA) fantom(Figur 1A,B; Tabel over materialer).
BEMÆRK: HA-fantomet fungerer som standard i trin 4.2 (se nedenfor) for at konvertere μCT-enheder (typisk Hounsfield) til HA-densitet (mgHA/ccm). - Anbring den forberedte armatur i en sprøjte eller et konisk rør, der svarer til synsfeltets diameter (FOV; Figur 1C). I denne undersøgelse blev der anvendt en 20 mm sprøjte til at matche synsfeltet på 21,5 mm.
- For at forhindre, at prøverne tørrer ud under scanningsprocessen, fyldes sprøjten eller kanonirøret med det konserveringsmiddel, der blev anvendt i trin 1.3 (saltvand blev anvendt i denne undersøgelse).
- For samtidig scanning af flere prøver placeres op til seks prøver i et specialudviklet, 3D-printet scanningsarmatur (figur 1 A, B) eller lignende. Samtidig scanning reducerer scanningstid og omkostninger. Den tilpassede armatur, der anvendes i denne undersøgelse, indeholder seks slidser til at holde de lange knogleprøver og et centerhul til et hydroxyapatit (HA) fantom(Figur 1A,B; Tabel over materialer).
- Scanning
- Før scanning skal du bekræfte, at μCT-maskinen er kalibreret som følger: Placer et HA-fantom, ved midterlinjen af μCT FOV, scan fantomet, og mål densiteten af HA. Sørg for, at den målte massefylde er i overensstemmelse med den massefylde, som fabrikanten har angivet.
- Juster prøvefiksturens midterlinje med den omtrentlige midterlinje for μCT FOV. Dette sikrer, at prøverne er inden for FOV, og deres lange akser har orientering, der omtrent falder sammen med den aksiale retning af de resulterende billeder.
BEMÆRK: Denne standardiserede orientering kan senere hjælpe med at gøre analyseproceduren mindre tilbøjelig til variationer, såsom i mængden af væv, der betragtes inden for interessevolumenet. - Indstil scanningsparametrene for μCT-systemet (Materialetabel). Parametrene anvendt i denne undersøgelse er 10,5 μm (isotropisk voxelstørrelse), 55 kVp (energi / intensitet), 145 μA (strøm) og 300 ms (integrationstid). Bestem voxelstørrelsen baseret på den omtrentlige tykkelse af musetrabeculae (20-60 μm)8. Undersøg scanningen visuelt i forskellige visninger for at sikre, at den dækker hele volumenet af alle callusprøver.
Figur 1: Strukturen af den tilpassede scanningsarmatur. (A) Billeder af scanningsarmaturet (øverst), der viser de seks prøvepladser, og HA-fantomet (nederst). (B) Billeder, der viser langbensprøven (øverst) og HA-fantomet (nederst) placeret i de dedikerede åbninger. (C) Billeder, der viser scanningsarmaturet anbragt i en 20 mm sprøjte. Klik her for at se en større version af denne figur.
3. Segmentering af billeder
BEMÆRK: Raw-billeder rekonstrueres automatisk til billedsekvensdata.
- Billedkonvertering: konverter de rekonstruerede billedsekvensdata til DICOM-billedsekvenser ved hjælp af en billedbehandlingssoftware (se materialetabel). Importer DICOM-billedsekvenser til softwaren (se materialetabellen) til billedbehandling, analyse og visualisering (figur 2A).
- Billedbeskæring: en prøve ad gangen, beskær hver billedstak, og sørg for, at hele prøven er inkluderet i den beskårne diskenhed (figur 2B). Gem det beskårne billede på følgende måde: Klik på fanen Filer øverst til venstre på skærmen, vælg Gem projekt, og vælg derefter Minimer projektstørrelse blandt de indstillinger, der vises på skærmen. Filen gemmes i det kommercielle softwareformat.
- Billedbenægtelse: Brug en filtreringsmetode til at reducere støjniveauet og undgå sløring som følger.
- Klik på fanen Filer , og vælg det billede, der skal behandles ved hjælp af åbne data. Det åbnede billede vises i projektvisningsvinduet i øverste venstre hjørne af skærmen.
- Højreklik for at vælge Billedbehandling og derefter Filtrer sandkasse. Klik på Opret.
- Udfør følgende i vinduet Egenskaber (i nederste venstre hjørne af skærmen): Vælg Data som eksempeltype; vælg filtertypen i rullemenuen ud for Filter; vælg 3D til fortolkning; vælg Separable i rullemenuen ud for kernetype; udfylde de værdier, der skal anvendes til standardafvigelse og kernestørrelsesfaktor, i den tilgængelige tomme boks ud for hver vælg Samme som input i rullemenuen ved siden af output; klik på Anvend.
BEMÆRK: Valg af filtertype (tilgængelige indstillinger er bilateral, boks, gaussisk, median, rekursiv eksponentiel, afgrænset, anisotrop diffusion, ikke-lokale midler, uskarp maskering og FFT-filter) og parametre afhænger af støjniveauet og voxelstørrelsen af scannede billeder. For det gaussiske filter er 3 x 3 x 3 og 5 x 5 x 5 almindeligt anvendte værdier for kernestørrelsesfaktoren, og 0,5-2,0 bruges almindeligvis til standardafvigelse8. I denne undersøgelse blev der anvendt et gaussisk filter, og 5 x 5 x 5 og 0,8 blev anvendt til henholdsvis kernestørrelsesfaktor og standardafvigelse.
- Justering af billedet
BEMÆRK: Dette er et valgfrit trin. Når der opstår forskydning af lange knogleprøver i forhold til billeddannelsesakserne under scanningsprocessen, kan der anvendes en digital justeringsmetode til at korrigere forskydningen (figur 2C).- Opret et 3D-gengivet billede af eksemplet på følgende måde. I projektvisningsvinduet skal du vælge det filtrerede, beskårne billede (oprettet i trin 3.3). Højreklik for at vælge Skærm og derefter Volumengengivelse i rullemenuen, og klik derefter på Opret. Kontroller visuelt det 3D-gengivne billede i sagittale og frontale planer.
- Drej manuelt den gengivne diskenhed for at opnå en god justering i længdeaksen. Anvend transformation på de roterede billeder som følger: I egenskabsvinduet skal du klikke på Transformér editor, derefter gå til transform editor-manipulator og vælge Transformer i rullemenuen. Nu kan prøven roteres og justeres. Når justeringsprocessen er færdig, skal du klikke på Transform Editor igen for at låse billedet.
- Gensample af det filtrerede billede (oprettet i trin 3.3) for at oprette nye tværgående (aksiale) plane billedudsnit på følgende måde: I vinduet Projektvisning skal du vælge billedet fra trin 3.4.2. Højreklik for at vælge Geometritransformering og derefter Resample Transformeret billede fra rullemenuen, og klik på Opret. I egenskabsvinduet skal du gå til Data og udføre følgende: for interpolation skal du vælge Standard i rullemenuen; for tilstand skal du vælge Udvidet; for at bevare, vælg Voxel Size; For Udfyldningsværdi skal du angive nul i feltet Tilgængelig tomt. Klik derefter på Anvend.
- Definition af interessevolumen (VOI)
- Gå gennem de tværgående billedskiver og identificer midterplanet for brudcallus. Definer VOI baseret på de proksimale og distale ender af callus. I tilfælde, hvor callusenderne er vanskelige at definere, skal du definere VOI baseret på en standardiseret afstand væk fra calluscenterplanet (figur 2D).
BEMÆRK: Under helingsfaser, der går forud for knoglemodellering, er det let at definere kanterne af den mineraliserede callus, fordi den trabekulære struktur af den nydannede vævede knogle adskiller sig fra den kortikale struktur af den oprindelige knogle. Men når ombygningsfasen følger, erhverver den nydannede knogle gradvist den kortikale struktur; Således bliver det stadig mere udfordrende at definere kanterne af callus.
- Gå gennem de tværgående billedskiver og identificer midterplanet for brudcallus. Definer VOI baseret på de proksimale og distale ender af callus. I tilfælde, hvor callusenderne er vanskelige at definere, skal du definere VOI baseret på en standardiseret afstand væk fra calluscenterplanet (figur 2D).
Figur 2: Billedsegmentering . (A) Et billede, der viser seks prøver inden for en scanning. (B) Billedbeskæring for at isolere individuelle prøver. C) Digital justering for at korrigere en forkert justeret længdeakse (gul stiplet linje). (D) Definition af VOI- og callus-centerplanet. Klik her for at se en større version af denne figur.
4. Billedanalyse
- Segmentering af callus og kortikal knogle
- Konturer den ydre grænse af callus halvautomatisk ved hjælp af segmenteringslassoværktøjet med indstillinger for automatisk sporing og sporing af kanter (figur 3A) som følger:
- Efter samling af transformerede billeder (trin 3.4.3) skal du klikke på fanen Segmentering i den anden fanerække øverst på skærmen. I segmenteringseditorvinduet skal du vælge et transformeret billede (oprettet i trin 3.4.3) i rullemenuen ud for billedet.
- I vinduet MATERIALER skal du dobbeltklikke på Tilføj; Ved at gøre dette vises to faner med navnet Material3 og Material4. Højreklik for at omdøbe materiale3 til callus og material4 til kortikal knogle.
- I vinduet VALG skal du klikke på lassoikonet; fra de indstillinger, der vises, skal du vælge Frihånd for 2D-tilstand, Indvendig for 3D-tilstand og både Automatisk sporing og Spor kanter for indstillinger. Brug lassoen til at markere interesseområderne.
- Gentag dette kontureringstrin med udsnit fordelt på tværs af VOI (figur 3B). De konturerede skiver kan adskilles fra hinanden (f.eks. adskilt af 20 skiver).
BEMÆRK: I områder med komplekse callusstrukturer kan brugeren overveje at reducere afstanden mellem konturerede skiver for at fange flere fragmenter (figur 3A, B). - Interpoler på tværs af de konturerede calluskonturer for at oprette en komplet callus-etiket (figur 3C, D) som følger: I vinduet MATERIALER skal du vælge Callus-filen (oprettet i trin 4.1.1.2.), klikke på fanen Valg øverst på skærmen og vælge Interpoler i rullemenuen. I vinduet VALG skal du klikke på plustegnet.
- Åbn Cortical Bone-filen, der blev oprettet i trin 4.1.1.2. Den kortikale knogle, herunder medullært hulrum, segmenteres som beskrevet for callus i trin 4.1.1 og 4.1.2. (figur 4A,B). Interpoler den konturerede periosteale cortex for at skabe en kortikal knogleetiket som skitseret for callus i trin 4.1.3 (figur 4C, D).
- Beregn den konturerede volumen og gennemsnitlige grå værdi af callus som følger: Klik på fanen Segmentering i øverste række på skærmen, og vælg Materialestatistik i rullemenuen. Dette genererer en tabel, der indeholder alle de beregnede værdier. Værdierne af den kortikale knogle og callus (efter fratrækning af den kortikale knogle) tilvejebringes separat. Når tabellen er genereret, skal du klikke på Eksportér til arbejdsområde for at gemme dataene.
- Konturer den ydre grænse af callus halvautomatisk ved hjælp af segmenteringslassoværktøjet med indstillinger for automatisk sporing og sporing af kanter (figur 3A) som følger:
- Omdannelse af gråtoneenheder til knoglemineraltæthed
- Beskær 3D-billedet af 4,5 mm HA-fantomet (figur 2B) fra hele billedet, og klik på Segmentering. HA-fantomets harpiks indeholder fem små HA-cylindre (figur 1A). For den HA-cylinder, der har den højeste densitet, skal du definere den første og den sidste skive ved visuel inspektion.
- Tegn to cirkler ved det første og det sidste udsnit (undgå kanter) ved hjælp af penselværktøjet (figur 5A) på følgende måde: Klik på Tilføj fire gange i vinduet MATERIALER. Højreklik for at omdøbe material3, material4, material5 og material6 til henholdsvis phantom1, phantom2, phantom3 og phantom4. Vælg Phantom1, klik på penselikonet i vinduet SELECTION, og brug skyderen til at justere penselstørrelsen (cirkulær sporing) baseret på fantomets størrelse (størrelsen på cirklen skal være mindre end fantomets).
- Anvend interpolation mellem de to cirkler for at oprette en diskenhed for hver HA-cylinder (figur 5B) på følgende måde: I vinduet MATERIALER skal du vælge Phantom1, klikke på fanen Valg i øverste række på skærmen og vælge Interpoler i rullemenuen. I vinduet VALG skal du klikke på plustegnet.
- Segmenteringsprocessen gentages med tre af de resterende HA-cylindre, startende med den næsthøjeste HA-densitet og sluttende med den næstlaveste HA-densitet (figur 5B). Cylinderen med den laveste HA-densitet kan udelukkes, fordi den ofte er vanskelig at segmentere.
- Brug de genererede 3D-etiketter til at beregne de gennemsnitlige grå værdier for de fire analyserede HA-cylindre. Brug et regneark (se materialetabel) eller lignende til at plotte de gennemsnitlige gråværdier og de tilsvarende knoglemineraltæthedsværdier (BMD) leveret af fantomproducenten. Generer en korrelationsligning mellem BMD og de grå værdier ved hjælp af lineær regression.
- Segmentering af den mineraliserede callus og beregning af BMD
- Baseret på korrelationsligningen genereret i trin 4.2.5 og den valgte tærskel, der adskiller mineraliseret og umineraliseret callus, bestemmes den tilsvarende gråværditærskel. Mærk derfor callusområdet med grå værdier, der er større end tærsklen, som mineraliseret callus og mærk resten som umineraliseret (figur 6A, B). I denne undersøgelse blev 250 mgHA/ccm anvendt som tærskel for mineraliseret callus14,15.
- Beregn de samlede callus og mineraliserede callus volumener. Baseret på disse værdier beregnes knoglevolumenfraktionen (mineraliseret callusvolumen normaliseret til det samlede callusvolumen = BV / TV). Den målte gennemsnitlige grå værdi for den samlede callus anvendes til beregning af callus BMD ved hjælp af korrelationsligningen i punkt 4.2.5.
BEMÆRK: Baseret på undersøgelsens mål og den software, der anvendes til analyse, kan andre parametre såsom SMI (strukturmodelindeks), trabekulær tykkelse og grad af anisotropi beregnes.
Figur 3: Segmentering af callus ydre grænse. (A) En kontur af den ydre grænse af callus (rød linje). B) Konturer ved skiver, der er udtaget prøver af over VOI (røde skiver). (C) En 3D callus etiket oprettet ved interpolation (rødt volumen). D) Et tværsnit af callusetiketten vist i C (inklusive kortikal knogle). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Segmentering af den kortikale knogle. (A) En kontur af cortexens periosteale overflade (grøn linje). B) Konturer ved skiver, der udtages prøver af over VOI (grønne skiver). (C) En 3D-etiket af den kortikale knogle (indeholdende medullært hulrum; grøn) og callus (rød) skabt af interpolerede etiketter af periosteal cortex og callus. (D) Et tværsnit af callus (rød) og kortikal knogle (indeholdende det intramedullære hulrum; grøn). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Omregning af gråtoneenheder til BMD. (A) Konturer af HA-cylinderen ved første og sidste skive (røde cirkler). (B) 3D interpolerede HA-cylindre (venstre) og tværsnit (højre). Brun: højeste HA-tæthed; blå: næsthøjeste HA-tæthed violet: tredje højeste HA-tæthed grøn: fjerde højeste HA-tæthed. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 6: Segmentering af den mineraliserede callus. (A) Den mineraliserede callus (≥250 mgHA/ccm) er vist med blåt, resten af callus (<250 mgHA/ccm) er vist med rødt, og det rum, der svarer til den oprindelige knogle, er vist med grønt. (B) En 3D-visning af hver isoleret etiket. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
For at overvåge knogledannelsen under frakturheling blev der induceret en åben tibial fraktur i midten af diafyseal hos voksne C75BL/6J-hanmus. Frakturen blev stabiliseret ved hjælp af en intramedullær negl, en etableret model for sekundær helbredelse13. Callusvæv blev høstet på dag 14, 21 og 28 efter brud12. Disse tidspunkter repræsenterer forskellige faser af helbredelse. Endokondral knogledannelse under sekundær knogleheling fortsætter via indledende dannelse af en fibrobrusk (blød) callus, som mineraliserer på senere stadier for at reducere mikromotion ved brudgabet, hvilket tillader dannelse af nye blodkar på tværs af brudlinjen13. Dag 14 efter fraktur i murine frakturmodellen, der anvendes i denne undersøgelse, repræsenterer stadiet af mineraliseret blød callus. Når helingen fortsætter fra dag 14 til dag 21, erstattes den mineraliserede bløde callus fuldstændigt af nydannet vævet knogle, hvilket resulterer i knoglebro af brudgabet13. Mellem dag 21 og 28 gennemgår callus resorption og ombygning for at genoprette den karakteristiske struktur af kortikal knogle12.
μCT-billeder blev erhvervet og analyseret på tre tidspunkter ved hjælp af protokollen beskrevet ovenfor. Mindst 10 prøver blev analyseret på hvert tidspunkt. For hver prøve blev knoglevolumenfraktion og BMD beregnet. Knoglevolumenfraktion blev beregnet ved at dividere volumenet af mineraliseret callus (BV) med det samlede callusvolumen (TV). Resultaterne viste betydelig dannelse af mineraliseret callus på dag 14 (figur 7A, B) og trinvise stigninger i knoglefraktionsvolumen og BMD, da helingen fortsatte fra dag 14 til dag 21 og 28 (figur 7A, B), i overensstemmelse med knoglebro af brudgabet. Som forventet gennemgik callus resorption/remodellering mellem dag 21 og 28, hvilket fremgår af et fald i det samlede callusvolumen (figur 7A, B). Kortikal brobygning af callus var mere tydelig på dag 28 end noget tidligere tidspunkt (figur 7A). Disse resultater indikerer, at den medfølgende μCT-protokol tillader overvågning af knogledannelse og callusstruktur under forskellige faser af knogleheling.
Figur 7: Overvågning af knogleheling ved hjælp af μCT. (A) 2D (sagittal, venstre panel) og 3D (højre panel) billeder af den helbredende callus genereret af μCT på de angivne tidspunkter efter fraktur. (B) BMD, knoglevolumenfraktion (BV / TV) og total callusvolumen beregnet ud fra billeder vist i A. Resultaterne viser helingsprogression gennem de sene reparations- og ombygningsfaser. N = 10-12. Prikkerne på linjeplottet repræsenterer gennemsnitlige ± SEM. (*) p < 0,05 ved hjælp af envejs ANOVA efterfulgt af Tukeys post-hoc-test. Klik her for at se en større version af denne figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Formålet med denne undersøgelse er at beskrive en detaljeret protokol til μCT-analyse med det formål at foretage nøjagtig kvantificering af den 3D mineraliserede callusstruktur, som ofte er grundlæggende i knogle- og brudhelingsstudier. Protokollen anvender en generel state-of-the-art 3D-billedanalysesoftwareplatform, der letter billedvisualisering, segmentering / mærkning og målinger, der spænder fra enkel til kompleks.
Den mest tidskrævende opgave i protokollen er halvautomatisk segmentering af callus, med udelukkelse af den kortikale knogle og medullær kanal. Denne region er også blevet udelukket i mange tidligere undersøgelser 9,16,17,18. Nogle undersøgelser har inkluderet de indfødte kortikale knogle- og kanalregioner i deres analyser19,21, mens tilgangen i andre undersøgelser ikke var klar. Inkludering af de indfødte cortices undgår vanskeligheden og den potentielle subjektivitet i konturerede findelte regioner af brudte cortices, men opblæser callus mineraliseringsforanstaltninger.
Protokollen fokuserer på at opnå outputmål, herunder total callusvolumen, mineraliseret volumen, knoglevolumenfraktion og knoglemineraltæthed. Disse parametre fortolkes let og rapporteres almindeligvis i litteraturen. Mineraliseret volumen og knoglevolumenfraktion afhænger af den valgte tærskel for differentiering af mineraliseret versus umineraliseret, mens knoglemineraltæthed ikke er. Vævsmineraltæthed kan også beregnes baseret på kun vævet mærket som mineraliseret, i stedet for knoglemineraltæthed baseret på både mineraliseret og umineraliseret callus. Vævsmineraltæthed er rapporteret at være forbundet med torsionsstyrke og stivhed9; Imidlertid påvirkes disse foranstaltninger mere sandsynligt af delvise volumeneffekter og billeddannelsesopløsning end knoglemineraltæthed.
Forskere har rapporteret om god korrelation mellem kvantificeret kortikal 3D-brobygning og hård hudstyrke og stivhed (kortikal brobygning vurderet på 2D-røntgenbilleder vurderes almindeligvis klinisk hos humane patienter)20. Yderligere 3D callus egenskaber rapporteret i litteraturen omfatter øjeblikke af inerti10,15,19, som karakteriserer den geometriske fordeling af callus (dvs. hvor spredt vævet er). Polært inertimoment vedrører teoretisk vridningsmodstand, og bøjningsmoment for inerti vedrører bøjningsmodstand. Selvom disse egenskaber kunne beregnes ud fra de segmenterede callusdata, der er beskrevet i denne undersøgelse, er deres korrelation med målte biomekaniske egenskaber rapporteret at være inkonsekvent 9,19,2 1. Andre tidligere rapporterede callusegenskaber inkluderer forbindelsestæthed, trabekulær tykkelse og strukturmodelindeks11,17,,2 2. Disse parametre bruges ofte til at karakterisere trabekulær knogle og beregnes let af μCT-scannersoftware; Imidlertid er deres forhold til brudhelingskvalitet ikke så klart. Den software, der anvendes i denne protokol, er et generelt program, der ikke er specifikt for knogler. Hvis visse knogleparametre såsom trabekulær tykkelse beregnes uden for denne protokol, kan segmenterede data således eksporteres til andre programmer til yderligere analyse (f.eks. som i Watson et al.23).
Denne protokol giver detaljerede arbejdsgange til karakterisering af kompleks callusstruktur og kvalitetskontrol fra et enkelt softwaremiljø sammenlignet med andre metoder, hvor der kræves flere programmer til analyse24. Derfor er tidsbesparelse en potentiel fordel ved denne protokol. Softwaren muliggør en række fleksible, sofistikerede 3D-visualiseringsmetoder, der hjælper med at sikre nøjagtig analyse og også giver mulighed for parallel tabulering af alle resultater.
μCT-analyseprotokollen kan tilpasses forskellige frakturmodeller hos mus såvel som rotter; For andre applikationer anbefales optimering af nogle af de kritiske trin for at sikre minimering af resultatvariation. Det bør specifikt overvejes at undersøge virkningen af at ændre VOI'ens størrelse eller antallet af konturerede skiver inden for VOI på resultaternes reproducerbarhed. Det anbefales også at bruge digital justering som beskrevet i trin 3.4, men hvis der anvendes forskellig software til analyse, kan det være nødvendigt at vurdere nødvendigheden af dette trin ved at sammenligne data, der genereres med og uden digital justering.
I denne protokol blev en halvautomatisk segmenteringsmetode anvendt til identifikation og adskillelse af callus fra kortikal knogle og marv. I tilfælde som findelte brud, hvor strukturen af callus er ekstremt kompleks, bliver konturering af callus og cortexens periosteale overflade udfordrende. Det anbefales i disse tilfælde at udføre kontureringen med flere eksperimenter for at vurdere og forsøge at begrænse subjektiviteten.
Der findes begrænsninger med denne protokol. Protokollen kræver konvertering og eksport af DICOM-billeder, så billeder efterfølgende kan analyseres i yderligere software; Dette trin tager lidt ekstra tid og kan nødvendiggøre brug af et kalibreringsfantom, der er i billedet. Da automatiserede segmenteringsteknikker fortsætter med at udvikle sig, herunder dem, der er baseret på maskinlæring, kan det være en fordel at erstatte de manuelle kontureringsdele af protokollen med disse nye teknikker. Samlet set kan den detaljerede protokol, der er beskrevet her til analyse af knoglehelende callus hos gnavere, især gavne laboratorier uden væsentlig μCT-analyseerfaring og kan hjælpe med at etablere en mere konsistent og standardiseret tilgang på tværs af feltet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) R01 DK121327 til R.A.E og R01 AR071968 til F.K.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10% neutral buffered formalin | Fisher chemical | SF100-20 | Used for bone tissue fixation |
| Avizo | Thermo Scientific | Image processing and analysis software | |
| Hydroxyapatite phantom | Micro-CT HA D4.5, QRM | QRM-70128 | |
| Image Processing Language | Scanco | Used to convert raw images to DICOM images | |
| Micro-Mosquito Straight Hemostatic Forceps | Medline | Used to remove the intramedullary pin | |
| Microsoft Excel | Microsoft | Spreadsheet software | |
| Scanco mCT system (vivaCT 40) | Scanco | Used for µCT imaging |
References
- Rüegsegger, P., Koller, B., Müller, R. A microtomographic system for the nondestructive evaluation of bone architecture. Calcified Tissue International. 58 (1), 24-29 (1996).
- Müller, R., et al. Morphometric analysis of human bone biopsies: a quantitative structural comparison of histological sections and micro-computed tomography. Bone. 23 (1), 59-66 (1998).
- Waarsing, J. H., et al. Detecting and tracking local changes in the tibiae of individual rats: a novel method to analyse longitudinal in vivo micro-CT data. Bone. 34 (1), 163-169 (2004).
- Boyd, S. K., Davison, P., Müller, R., Gasser, J. A. Monitoring individual morphological changes over time in ovariectomized rats by in vivo micro-computed tomography. Bone. 39 (4), 854-862 (2006).
- Christiansen, B. A. Effect of micro-computed tomography voxel size and segmentation method on trabecular bone microstructure measures in mice. Bone Reports. 5, 136-140 (2016).
- Holdsworth, D. W., Thornton, M. M. Micro-CT in small animal and specimen imaging. Trends in Biotechnology. 20 (8), 34-39 (2002).
- Schambach, S. J., Bag, S., Schilling, L., Groden, C., Brockmann, M. A. Application of micro-CT in small animal imaging. Methods. 50 (1), 2-13 (2010).
- Bouxsein, M. L., et al. Guidelines for assessment of bone microstructure in rodents using micro-computed tomography. Journal of Bone and Mineral Research. 25 (7), 1468-1486 (2010).
- Morgan, E. F., et al. Micro-computed tomography assessment of fracture healing: Relationships among callus structure, composition, and mechanical function. Bone. 44 (2), 335-344 (2009).
- O'Neill, K. R., et al. Micro-computed tomography assessment of the progression of fracture healing in mice. Bone. 50 (6), 1357-1367 (2012).
- Bissinger, O., et al. Fully automated segmentation of callus by micro-CT compared to biomechanics. Journal of Orthopaedic Surgery and Research. 12 (1), 108 (2017).
- Brown, M. L., et al. Delayed fracture healing and increased callus adiposity in a C57BL/6J murine model of obesity-associated type 2 diabetes mellitus. PLOS One. 9 (6), 99656 (2014).
- Khajuria, D. K., et al. Aberrant structure of fibrillar collagen and elevated levels of advanced glycation end products typify delayed fracture healing in the diet-induced obesity mouse model. Bone. 137, 115436 (2020).
- Sigurdsen, U., Reikeras, O., Hoiseth, A., Utvag, S. E. Correlations between strength and quantitative computed tomography measurement of callus mineralization in experimental tibial fractures. Clinical Biomechanics. 26 (1), 95-100 (2011).
- Duvall, C. L., Taylor, W. R., Weiss, D., Wojtowicz, A. M., Guldberg, R. E. Impaired angiogenesis, early callus formation, and late stage remodeling in fracture healing of osteopontin-deficient mice. Journal of Bone and Mineral Research. 22 (2), 286-297 (2007).
- Gerstenfeld, L. C., et al. Comparison of effects of the bisphosphonate alendronate versus the RANKL inhibitor denosumab on murine fracture healing. Journal of Bone and Mineral Research. 24 (2), 196-208 (2009).
- Alentado, V. J., et al. Validation of the modified radiographic union score for tibia fractures (mRUST) in murine femoral fractures. Frontiers in Endocrinology. 13, 911058 (2022).
- Yu, K. E., et al. Enhancement of impaired MRSA-infected fracture healing by combinatorial antibiotics and modulation of sustained inflammation. Journal of Bone and Mineral Research. 37 (1), 1352-1365 (2022).
- Nyman, J. S., et al. Quantitative measures of femoral fracture repair in rats derived by micro-computed tomography. Journal of Biomechanics. 42 (7), 891-897 (2009).
- Fiset, S., et al. Experimental validation of the radiographic union score for tibial fractures (RUST) using micro-computed tomography scanning and biomechanical testing in an in-vivo rat model. The Journal of Bone and Joint Surgery. 100 (21), 1871-1878 (2018).
- Shefelbine, S. J., et al. Prediction of fracture callus mechanical properties using micro-CT images and voxel-based finite element analysis. Bone. 36 (3), 480-488 (2005).
- Liu, Y., et al. Glucocorticoid-induced delayed fracture healing and impaired bone biomechanical properties in mice. Clinical Interventions in Aging. 13, 1465-1474 (2018).
- Watson, P. J., Fitton, L. C., Meloro, C., Fagan, M. J., Gröning, F. Mechanical adaptation of trabecular bone morphology in the mammalian mandible. Scientific Reports. 8 (1), 7277 (2018).
- Nie, C., Wang, Z., Liu, X. The effect of depression on fracture healing and osteoblast differentiation in rats. Neuropsychiatric Disease and Treatment. 14, 1705-1713 (2018).
