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Artículo de método

Medición de la termogénesis del músculo esquelético en ratones y ratas

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DOI:

10.3791/64264

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27 de julio de 2022

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1School of Biomedical Sciences, Kent State University, 2College of Public Health, Kent State University, 3Department of Biological Sciences, Kent State University

En este artículo

Resumen

Los ratones y las ratas se implantan quirúrgicamente con transpondedores de temperatura remotos y luego se habitúan al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar o durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante).

Resumen

La termogénesis del músculo esquelético proporciona una vía potencial para comprender mejor la homeostasis metabólica y los mecanismos subyacentes al gasto de energía. Sorprendentemente, hay poca evidencia disponible para vincular los mecanismos neurales, miocelulares y moleculares de la termogénesis directamente con cambios medibles en la temperatura muscular. Este documento describe un método en el que se utilizan transpondedores de temperatura para recuperar mediciones directas de la temperatura del músculo esquelético de ratón y rata.

Los transpondedores remotos se implantan quirúrgicamente dentro del músculo de ratones y ratas, y los animales tienen tiempo para recuperarse. Los ratones y las ratas deben habituarse repetidamente al entorno y procedimiento de prueba. Los cambios en la temperatura muscular se miden en respuesta a estímulos farmacológicos o contextuales en la jaula del hogar. La temperatura muscular también se puede medir durante la actividad física prescrita (es decir, caminar en la cinta a una velocidad constante) para tener en cuenta los cambios en la actividad como contribuyentes a los cambios en la temperatura muscular inducidos por estos estímulos.

Este método se ha utilizado con éxito para dilucidar los mecanismos subyacentes al control termogénico muscular a nivel del cerebro, el sistema nervioso simpático y el músculo esquelético. Se proporcionan demostraciones de este éxito utilizando el olor a depredador (PO; olor a hurón) como estímulo contextual e inyecciones de oxitocina (Oxt) como estímulo farmacológico, donde el olor a depredador induce la termogénesis muscular, y Oxt suprime la temperatura muscular. Por lo tanto, estos conjuntos de datos muestran la eficacia de este método para detectar cambios rápidos en la temperatura muscular.

Introducción

Dentro de la investigación metabólica, el examen de la termogénesis del músculo esquelético es una nueva vía prometedora para probar la homeostasis del peso corporal. La literatura publicada apoya la idea de que las respuestas termogénicas de uno de los sistemas de órganos más grandes del cuerpo, el músculo esquelético, proporcionan una vía para aumentar el gasto de energía y otros efectos metabólicos, reequilibrando así eficazmente los sistemas dentro de enfermedades como la obesidad 1,2,3. Si el músculo puede considerarse un órgano termogénico, los estudios deben utilizar una metodología práctica para estudiar los cambios termogénicos dentro de este órgano. El deseo de comprender el impacto endotérmico de los músculos esqueléticos y la utilidad de esta metodología para estudiar la termogénesis muscular sin temblores no son específicos de los estudios metabólicos. Disciplinas como la evolución4, la fisiología comparada5 y la ecofisiología 6,7 han mostrado un gran interés en comprender las formas en que la termogénesis muscular puede contribuir a la endotermia y cómo este mecanismo se adapta al medio ambiente. El protocolo presentado proporciona los métodos críticos necesarios para abordar estas preguntas.

El método proporcionado se puede utilizar en la evaluación de la modulación de estímulos contextuales y farmacológicos de la temperatura muscular, incluida la técnica única de proporcionar olor a depredador (PO) para cambiar el contexto para replicar la amenaza del depredador. Informes anteriores han demostrado la capacidad de PO para inducir rápidamente un aumento considerable en la termogénesis muscular8. Además, los estímulos farmacológicos también pueden alterar la temperatura muscular. Esto ha sido demostrado en el contexto de la termogénesis muscular inducida por PO, donde el bloqueo farmacológico de los receptores periféricos β-adrenérgicos, utilizando nadolol, inhibió la capacidad de PO para inducir la termogénesis muscular sin afectar significativamente la termogénesis contráctil durantela caminata en cinta 8. La administración central de agonistas del receptor de melanocortina en ratas también se ha utilizado para discernir los mecanismos cerebrales que alteran la termogénesis 9,10.

Aquí se proporciona una investigación preliminar de la capacidad de la neurohormona oxitocina (Oxt) para alterar la termogénesis muscular en ratones. Similar a la amenaza del depredador, los encuentros sociales con un conespecífico del mismo sexo aumentan la temperatura corporal, un fenómeno conocido como hipertermia social11. Dada la relevancia de Oxt para el comportamiento social12, se ha especulado que Oxt es un mediador de la hipertermia social en ratones. De hecho, un antagonista del receptor de oxitocina disminuye la hipertermia social en ratones11, y las crías de ratón que carecen de Oxt muestran déficits en los aspectos conductuales y fisiológicos de la termorregulación, incluida la termogénesis13. Dado que Harshaw et al. (2021) no encontraron evidencia que respalde la termogénesis del tejido adiposo marrón (BAT) dependiente del receptor adrenérgico β3 con hipertermia social11, se ha postulado que la hipertermia social puede ser impulsada por la inducción de Oxt de la termogénesis muscular.

Para medir la termogénesis del músculo esquelético, el siguiente protocolo utiliza la implantación de transpondedores IPTT-300 preprogramados adyacentes al músculo de interés dentro de un ratón o rata 8,10,14,15. Estos transpondedores son microchips encapsulados en vidrio que se leen utilizando los lectores de transpondedor correspondientes. Poca o ninguna investigación ha utilizado esta tecnología en esta capacidad, aunque los estudios han sugerido la necesidad de la especificidad proporcionada por este método16,17. Investigaciones anteriores han demostrado la fiabilidad de este método y una variedad de formas en que los transpondedores de temperatura pueden ser utilizados en comparación con otros métodos de prueba de temperatura18 o en conjunto con métodos quirúrgicos (por ejemplo, canulación19). Sin embargo, los estudios de esta naturaleza se basan en diferentes ubicaciones estratégicas para medir la temperatura corporal total 20,21,22 o tejidos específicos como BAT23,24,25.

En lugar de medir la temperatura desde estos lugares o mientras se usan termómetros de oído o rectales26, el método descrito aquí proporciona especificidad para el músculo de interés. La capacidad de apuntar a un sitio mediante la implantación directa de transpondedores adyacentes a los músculos de interés es más eficaz para sondear la termogénesis muscular específicamente. Proporciona una nueva vía además de las proporcionadas por la termometría infrarroja de superficie 27,28 o las mediciones de temperatura cutánea a través del termopar 29. Además, los datos proporcionados a través de este método ofrecen una gama de vías de investigación, evitando la necesidad de equipos y software grandes, costosos y de alta tecnología, como la termografía infrarroja30,31,32.

Este método se ha utilizado con éxito para medir la temperatura en los cuádriceps y gastrocnemios, ya sea unilateral o bilateralmente. Este método también ha sido efectivo en conjunto con la cirugía estereotáxica14,15. Dentro de ~7-10 cm de la extremidad del transpondedor, se utilizan lectores de transpondedor portátiles (DAS-8027/DAS-7007R) para escanear, medir y mostrar la temperatura. Esta distancia ha sido crítica y valiosa para investigaciones previas 8,9,10 porque minimiza los posibles factores estresantes y las variables que alteran la temperatura, como el manejo de los animales durante los procedimientos de prueba. Usando temporizadores, las mediciones se pueden registrar y recolectar durante un período de tiempo sin interacción directa con los animales.

Para minimizar aún más la perturbación de los ratones durante las pruebas, este método describe el ensamblaje y el uso de elevadores hechos de tuberías de PVC para dar al experimentador acceso al fondo de las jaulas domésticas durante la prueba. Usando los elevadores en conjunto con el lector digital, las mediciones de temperatura de la extremidad del transpondedor se pueden hacer sin ninguna interacción animal después de colocar el estímulo. A un costo mínimo, este método se puede utilizar junto con estímulos farmacológicos y contextuales, lo que lo hace bastante accesible para los investigadores. Además, este método se puede emplear con un número sustancial de sujetos (~ 16 ratones o ~ 12 ratas) a la vez, ahorrando tiempo en el aumento del rendimiento general para cualquier proyecto de investigación.

En este método se introduce un mecanismo diseñado para presentar olores a ratones utilizando bolas infusoras de té de malla de acero inoxidable, a partir de ahora denominadas "bolas de té". Aunque estas bolas de té son ideales para contener cualquier material de olor, en estos estudios, las toallas que sirvieron como ropa de cama en la jaula durante 2-3 semanas para hurones, un depredador natural de ratones y ratas, se colocan dentro de cada bola de té de tratamiento. Cada toalla se corta en cuadrados de 5 cm x 5 cm. Esta alícuota también se repite con toallas de control inodoras idénticas. Presentar estos olores sin una barrera (es decir, bola de té) llevó a los ratones a triturar las fibras dentro de sus jaulas, aumentando la actividad física. Este comportamiento no fue tan destacado en ratas. Las bolas de té proporcionan una carcasa ventilada a la toalla, dando acceso completo al olor mientras se mantienen protegidos durante la totalidad del ensayo experimental. Estas bolas de té pueden desinfectarse de acuerdo con los protocolos de uso de animales, prepararse e introducirse directamente después de la cirugía para comenzar a habituar a los animales a la estructura junto con el estímulo de control. Los ratones pueden entonces vivir con el enriquecimiento adicional, disminuyendo la prominencia de la presentación del estímulo agudo.

La habituación a la presencia de la bola de té es sólo un aspecto de la habituación que es crítico para este método. El protocolo de habituación descrito también consiste en la exposición repetida al procedimiento de prueba para normalizar el entorno de prueba (es decir, personal, transporte y movimiento al lugar de prueba, exposición al estímulo). Esta habituación prolongada minimiza las respuestas matizadas de los animales y centra las mediciones en las variables dependientes deseadas (por ejemplo, estímulos farmacológicos o contextuales). La evaluación previa de este protocolo ha identificado cuatro ensayos como el número mínimo de habituaciones necesarias antes de las pruebas de temperatura dentro de las jaulas domésticas en ratas8. Si las pruebas están separadas por largos períodos (más de 2-3 semanas), los animales deben estar habituados nuevamente. Para la habituación repetida, un mínimo de uno o dos ensayos son suficientes. Sin embargo, si las pruebas de temperatura están separadas por períodos de tiempo más prolongados, puede ser necesario repetir más ensayos.

En el esfuerzo continuo para acostumbrar a ratones y ratas al procedimiento de prueba, se debe incluir un período de aclimatación antes de la presentación del estímulo en cada ensayo experimental. Este tiempo de aclimatación es crítico para reequilibrar la temperatura y la actividad después de ser trasladado al lugar de prueba. Los roedores tienden a tener fuertes aumentos de temperatura debido a la translocación. La aclimatación debe consistir en un mínimo de 1 h sin interacción del experimentador el día de la prueba antes de cualquier adición de un agente farmacológico o estímulos contextuales. Esto es necesario cada día de prueba.

En las pruebas de temperatura de la jaula en el hogar descritas, los ratones tienen el rango libre de su jaula doméstica para vagar en respuesta al estímulo probado. Esto puede causar cambios variables en la actividad, afectando la precisión de las lecturas de temperatura y, por lo tanto, el análisis de los efectos termogénicos de la variable independiente (por ejemplo, estímulo farmacológico o contextual). En reconocimiento de los posibles cambios en la temperatura debido al nivel de actividad, a continuación se incluye un protocolo que describe el uso de la temperatura durante la caminata en la cinta rodante. La literatura publicada describe el uso exitoso de este procedimiento en ratas, y actualmente se está empleando con ratones 8,10,14,15. La caminata en cinta mantiene una velocidad constante de actividad para el sujeto de prueba. Para este estudio, las cintas de correr se utilizan estrictamente para controlar el nivel de actividad y, por lo tanto, se establecen a la velocidad más baja disponible en la cinta para promover la marcha de ratones y una configuración igualmente baja para las ratas.

El siguiente procedimiento se describe para la medición de la temperatura de gastrocnemio unilateral en ratones y la presentación del olor del depredador. El diseño se puede usar junto con agentes farmacológicos y es transferible a ratas y otros grupos de músculos esqueléticos (es decir, cuádriceps) en ratones. Para ratas, los transpondedores se pueden colocar en el gastrocnemio bilateralmente y en el tejido adiposo marrón. Debido a las limitaciones de tamaño y distancia, solo se puede utilizar un transpondedor por ratón. Se pueden hacer modificaciones menores (por ejemplo, la eliminación de estímulos contextuales) para evaluar las respuestas termogénicas a los agentes farmacológicos.

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Protocolo

Estos métodos se pueden aplicar tanto a modelos de ratas como de ratones y se realizaron con aprobación institucional (Universidad Estatal de Kent, Aprobación IACUC # 359 y # 340 CN 12-04). Antes de la aplicación del protocolo, los animales deben alojarse de conformidad con la Guía para el cuidado y uso de animales de laboratorio.

1. Preparación del lector de transpondedor

NOTA: Antes de su uso, el lector del transpondedor debe estar configurado; Los siguientes pasos solo incluyen los cambios de configuración necesarios para este estudio. Esta parte del protocolo está directamente asociada con los lectores portátiles DAS-8027-IUS; Otros modelos de lectores deben seguir las instrucciones proporcionadas por el manual para lograr resultados de programación.

  1. Establezca Audio Beep en OFF.
    1. Encienda el dispositivo presionando el botón SCAN y espere a que aparezca la iluminación en la pantalla OLED. Mantenga presionado el botón ATRÁS/MENÚ para acceder a la pantalla del menú .
    2. Con el botón NEXT/ENTER, desplácese por las opciones hasta OPERATIONAL SETUP. Aquí, alterne las flechas hacia arriba o hacia abajo para girar SÍ y abrir el submenú operativo.
    3. Con el botón NEXT/ENTER, desplácese hasta AUDIO BEEP. Como la configuración predeterminada es ON, cambie las flechas hacia arriba o hacia abajo y cambie la configuración a OFF.
    4. Pulse el botón NEXT/ENTER para guardar este cambio de configuración.
  2. Establezca Vibrar al leer en ON.
    1. Siga los pasos 1.1 a 1.2 o complete el siguiente paso directamente después del paso 1.4.
    2. Con el botón NEXT/ENTER, desplácese hasta VIBRAR AL LEER. Como la configuración predeterminada es OFF, alterne las flechas hacia arriba y hacia abajo y cambie la configuración a ON para sentir, a través de la vibración, cuando se ha completado la lectura, independientemente de poder ver la pantalla.

2. Programa de transpondedores

NOTA: Cada transpondedor implantado debe programarse primero con una identificación animal (identificación de animal o identificación de transpondedor). Esta nomenclatura se puede utilizar como identificación secundaria para el sujeto de prueba (por ejemplo, cuatro dígitos para la abreviatura de la cepa del ratón, la ubicación del transpondedor y tres o cuatro dígitos adicionales para indicar el número de animales). La programación se puede completar días antes de la cirugía mientras se mantienen los transpondedores estériles antes de la cirugía.

  1. Introduzca el código de identificación en el transpondedor.
    1. Aplique una bobina elevadora en el cabezal del lector, un accesorio específico para el modelo DAS 8027-IUS, que ayuda en el procedimiento de programación.
    2. Con una mano enguantada, coloque el transpondedor (dentro del aplicador) en la bobina de refuerzo.
    3. Encienda el dispositivo presionando el botón SCAN y espere a que se encienda la pantalla OLED. Mantenga presionado el botón ATRÁS/MENÚ para acceder a la pantalla del menú .
    4. Con el botón NEXT/ENTER, desplácese por las opciones hasta WRITE TRANSPONDER ID. Aquí, alterne las flechas hacia arriba o hacia abajo para girar SÍ.
    5. Con el botón NEXT/ENTER, cambie a ENTER ID CODE.
    6. Utilice las teclas de flecha arriba y abajo para desplazarse por los números y las letras. Pulse SIGUIENTE/ENTRAR después de cada selección de caracteres para desplazarse al siguiente carácter.
    7. Cuando se complete el código de identificación, presione SCAN para escribir el transpondedor.
    8. Retire el transpondedor de la bobina de refuerzo y repita según sea necesario. Compruebe que el transpondedor lee los cambios de temperatura calentando los transpondedores cerrados entre las manos enguantadas y midiendo con el escáner de temperatura.
      NOTA: Los ajustes de AUTO MULTI WRITE y SEQUENTIAL COUNT se pueden establecer en ON para permitir la programación de transpondedor múltiple o secuencial durante una sesión. Cada transpondedor debe probarse durante la programación.

3. Prepara "pelotas de jaula caseras"

  1. Coloque una toalla inodora / control de 5 cm x 5 cm en una bola de té.
  2. Coloque estas bolas de jaula caseras en jaulas nuevas después de la cirugía para comenzar a habituar al animal al método en el que se presentarán los estímulos contextuales durante la prueba. Reemplace estas bolas de jaula caseras cada 2 semanas.

4. Cirugía y cuidados postoperatorios

  1. Pesar y registrar el peso corporal de los sujetos antes de la cirugía. Usando una cámara de inducción, proporcione anestesia (por ejemplo, 2-5% de isoflurano) al animal.
  2. Usando cortapelos eléctricos, afeite completamente la extremidad posterior. Administrar analgesia (p. ej., 5 mg/kg de ketoprofeno, s.c.) de acuerdo con las directrices institucionales.
    NOTA: Es posible que se requiera analgesia adicional si este procedimiento se combina con otros métodos quirúrgicos.
  3. Limpie el área con alcohol al 70% (o toallita con alcohol estéril disponible comercialmente) y lavado con povidona yodada (o hisopos de betadina estériles envueltos individualmente disponibles comercialmente) alternando al menos tres veces, terminando con povidona yodada.
  4. Devuelva al animal a la cámara de inducción y anestesie al animal a niveles quirúrgicos. Luego, coloque el ratón en una máscara facial para la exposición continua a la anestesia. Aplique ungüento oftálmico de neomicina en los ojos del animal para evitar la sequedad mientras está bajo anestesia.
    NOTA: El procedimiento no debe comenzar hasta que el ratón no muestre evidencia de recepción del dolor (es decir, reflejo corneal, respuesta de pellizco de la cola, reflejo de pellizco del dedo del pie).
  5. Usando solo tijeras quirúrgicas, haga un corte poco profundo a través de la piel en la extremidad posterior derecha.
  6. Moviéndose paralelo al gastrocnemio, coloque el borde afilado de un transpondedor estéril preprogramado y sin tapa en la incisión. Asegúrese de que el émbolo verde mire hacia arriba y sea visible. Continúe empujando el aplicador del transpondedor en la incisión hasta que la abertura del aplicador del transpondedor ya no sea visible.
    NOTA: No presione accidentalmente el émbolo verde del aplicador del transpondedor durante el paso 4.6. La descarga prematura del transpondedor conducirá a una colocación incorrecta.
  7. Gire el aplicador 180°, lo que hace que el émbolo verde mire hacia abajo hacia la extremidad del ratón, que ya no es visible para el experimentador. Empuje el aplicador del transpondedor en la ubicación final. Una vez en la ubicación ideal, adyacente o parcialmente encerrado en el gastrocnemio, empuje el émbolo verde, permitiendo que la presión del aplicador guíe la mano del investigador hacia atrás lejos del ratón.
  8. Con fórceps, mantenga unida la piel abierta y coloque un clip para heridas con un autoclip estéril o una sutura estéril. Si es necesario, use suturas absorbibles antes del autoclip estéril para cerrar la capa de fascia. Usando el transpondedor-lector, verifique la temperatura del músculo del ratón.
  9. Retire el ratón de la anestesia y colóquelo en una jaula casera limpia colocada encima de una almohadilla térmica de circulación de agua configurada a baja para su recuperación. Asegúrese de que la jaula doméstica incluya una bola de té con una toalla inodora para comenzar la habituación.
    NOTA: El ratón debe despertar de la cirugía dentro de los 15 minutos. Los alimentos se pueden colocar en el fondo de la jaula para facilitar el acceso durante los días de recuperación.
  10. Cuidados postoperatorios
    1. Registre el peso y la temperatura del ratón diariamente usando un transpondedor-lector durante al menos 2 días después de la cirugía o hasta que los ratones recuperen o estabilicen el peso corporal.
    2. Administrar analgesia no narcótica (por ejemplo, 5 mg/kg de ketoprofeno, s.c.) una vez al día a los ratones durante al menos 2 días después de la cirugía, con dosis adicionales proporcionadas según sea necesario.
      NOTA: Los ratones y las ratas deben recuperarse completamente dentro de los 5-8 días posteriores a la cirugía y pueden someterse a procedimientos de habituación y prueba.

5. Preparación de pruebas - jaula doméstica

  1. Construcción de elevadores
    NOTA: El siguiente paso se basa en jaulas con filtro de ratón de 194 mm x 181 mm x 398 mm. Para adaptarse a jaulas más grandes (por ejemplo, una jaula casera para ratas), será necesario ajustar el ancho.
    1. Corte la tubería de PVC con un cortador de PVC de trinquete en ocho secciones y ensamble siguiendo la Figura 1C. Esto dará una estructura de mesa abierta que puede contener aproximadamente cuatro jaulas. Haga el número deseado de elevadores.
  2. Configuración de la habitación
    1. Asigne una ubicación a cada elevador dentro de la sala de pruebas. Separe los elevadores configurados para recibir diferentes estímulos contextuales (es decir, olores) por un mínimo de 2 m para evitar variables de confusión.
      NOTA: Cada ratón debe tener un lugar de prueba asignado dentro de la sala de pruebas y en los elevadores físicos tanto como sea posible para evitar el desarrollo de asociaciones entre diferentes ubicaciones y estímulos termogénicos.
    2. Usando bandas magnéticas, coloque láminas quirúrgicas o batas a través de los elevadores, creando una barrera visual entre el investigador y los sujetos de prueba. Establezca esta barrera para minimizar los cambios de temperatura resultantes de la actividad del ratón al ver a los experimentadores moviéndose hacia la jaula o alrededor de la sala de pruebas.
    3. (Opcional) Coloque espejos en la superficie debajo de los elevadores para facilitar la visualización del fondo de la jaula durante la prueba.
      NOTA: Los elevadores se pueden desinfectar a través de un sistema de lavado de jaula. La tela o las sábanas quirúrgicas deben lavarse antes de la habituación y las pruebas.
  3. Preparación de bolas de té
    1. Preparar bolas de té con control y toallas PO (aproximadamente 5 cm x 5 cm). Para evitar la contaminación cruzada, prepare primero bolas de té de control de olor.
      NOTA: Las toallas con olor a depredador deben someterse a pruebas de patógenos antes de su uso. Estas toallas también deben estar contenidas, y los materiales que interactúan con ellas deben desinfectarse inmediatamente (es decir, lavar la jaula), evitando la exposición del olor a otros animales.

6. Prueba de temperatura - jaula doméstica

NOTA: Los animales deben estar habituados a todo el procedimiento de prueba, excluyendo los estímulos contextuales o farmacológicos experimentales. Esto debe completarse un mínimo de 4 veces antes de la prueba.

  1. Transfiera los animales a la sala de pruebas preparada. Coloque a los animales en un lugar preasignado en el elevador. Esta ubicación debe ser la misma en todos los procedimientos de habituación y prueba.
  2. Retire la "bola de la jaula casera" de la jaula casera del ratón y vuelva a cubrir las jaulas con un paño o una sábana quirúrgica. Permita que los ratones se aclimaten al espacio de prueba durante 1-2 h.
  3. Una vez completada la aclimatación, utilice el escáner para medir y registrar la temperatura de referencia de cada sujeto. Evite manipular los revestimientos de tela durante las mediciones.
    NOTA: Los agentes farmacológicos se pueden aplicar aquí. El tiempo de espera posterior a la inyección o la aplicación se puede agregar según sea necesario antes de la prueba. Se recomienda registrar una línea de base secundaria directamente antes de la prueba después de la adición de un agente farmacológico para monitorear la respuesta a los estímulos farmacológicos. Si no se está probando la respuesta al olor, las mediciones de temperatura de los ratones pueden comenzar directamente después de la inyección. La aleatorización debe emplearse al proporcionar cualquier estímulo.
  4. Destape la jaula y coloque la bola de té (control o PO) en el piso de la jaula doméstica. Reemplace la tapa de la jaula y la cubierta de tela.
  5. Comience el cronómetro. Mida las temperaturas de los sujetos de prueba en el mismo orden de colocación de la bola de té. Registre las temperaturas y el tiempo de reloj de las mediciones siguiendo los puntos de tiempo deseados.
  6. Cuando se complete el experimento, retire la bola de tratamiento. Coloque los ratones que recibieron PO en una nueva jaula doméstica con la "bola de jaula casera" original. Devuelva la "bola de jaula casera" a la jaula de los ratones que recibieron olor de control. Transfiera los ratones a la ubicación de la vivienda.
    NOTA: El procedimiento anterior se puede traducir a modelos de ratas dentro de jaulas de tamaño apropiado. Es posible que se requieran ajustes a las mediciones sugeridas en la Figura 1C para permitir un mejor acceso al fondo de la jaula doméstica.

figure-protocol-1
Figura 1: Transpondedores y pruebas de temperatura de jaulas domésticas . (A) Diagrama de colocación unilateral del transpondedor para probar la temperatura en un gastrocnemio de ratón. Una vez programado y colocado, el transpondedor-lector (DAS-8027-IUS, mostrado) se puede utilizar para medir la temperatura. (B) Izquierda, foto de una bola de té de acero inoxidable de malla abierta y una toalla de 5 cm x 5 cm. Derecha, bola de té cerrada, utilizada para sostener toallas de habituación y olor en las pruebas de jaula caseras. (C) Esquema de elevadores construidos con tuberías de PVC para pruebas de jaulas domésticas. (D) Flujo de trabajo del protocolo de prueba de jaulas en el hogar. (E) Imágenes de las instalaciones del área de prueba de jaulas domésticas. A la izquierda, cuatro jaulas para ratones encima de un elevador. Las tiras magnéticas se encuentran en la pared adyacente, y los imanes y la tela quirúrgica están sobre la mesa. Derecha, jaulas de ratón cubiertas en elevadores. (A), (C) y (D) fueron creados con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

7. Prueba de temperatura - caminar en cinta rodante

  1. Asigne a cada animal una cinta de correr como su ubicación asignada para los procedimientos de habituación y prueba.
  2. Prepare las cintas de correr para las pruebas, asegurándose de que los amortiguadores sean funcionales.
    NOTA: Para caminar en cinta rodante, las cintas de correr deben ajustarse al ritmo más bajo disponible que promueva el movimiento continuo, pero no correr tanto para la habituación como para las pruebas. Para la cinta de correr metabólica cerrada modular 1012M-2, esto es de 5,2 m / min para ratones y 7 m / min para ratas. Este ritmo puede necesitar ser ajustado en función de la obesidad del sujeto. Los shockers deben ajustarse a una intensidad y tasa de repetición de 5.0.
  3. Habituación
    1. Mueva los ratones a la sala de pruebas. Permita que los ratones de 1 a 2 h se aclimaten a la transferencia de la habitación en sus jaulas domésticas.
    2. Después de la aclimatación, guíe a los ratones a la apertura de su cinta de correr asignada y cierre la cinta de correr. Encienda el cinturón, el amortiguador y el cronómetro.
    3. Permita que los ratones caminen en las cintas de correr durante 15 minutos, utilizando el estímulo de choque como motivación para el movimiento. Detenga la prueba inmediatamente si un animal permanece en un choque activo durante un período prolongado.
    4. Después de la prueba, retire los ratones y devuélvalos a las jaulas domésticas.
    5. Limpie las cintas de correr con detergente líquido y agua.
  4. Ensayo
    1. Mueva los ratones a la sala de pruebas. Permita que los ratones 1-2 h se aclimaten a la transferencia de la habitación en sus jaulas domésticas.
    2. Mida y registre la temperatura de referencia antes de mover el mouse a la cinta de correr.
      NOTA: Para pruebas que incluyan agentes farmacológicos, aplíquelos o inyéctese aquí, siguiendo el esquema que se muestra en la Figura 2A. El tiempo de espera después de la inyección se puede agregar según sea necesario antes de colocar los ratones en la cinta de correr. La aleatorización debe emplearse al proporcionar cualquier estímulo.
    3. Coloque cuadrados de 5 cm x 5 cm de toallas de control o PO dentro de la cinta de correr más cercana a la parte delantera de la cinta de correr. Adhiera las toallas al techo de la cinta de correr o debajo para facilitar su colocación y extracción.
    4. Guíe a los ratones a la cinta de correr asignada. Encienda la correa de la cinta de correr y el amortiguador.
    5. Inicie el cronómetro. Tome medidas de los sujetos de prueba en el mismo orden en que los ratones se instalaron en las cintas de correr. Registre las temperaturas y la hora del reloj de las mediciones siguiendo los puntos de tiempo deseados.
      NOTA: La temperatura se puede medir de manera confiable desde fuera de la cinta mientras un ratón está dentro de una cinta de correr cerrada durante la actividad de caminar. Para las ratas, el tamaño de la cinta de correr y las limitaciones de distancia del transpondedor-lector pueden requerir que un experimentador mantenga abierta la parte posterior de la cinta de correr para insertar el lector dentro de la cinta de correr, más cerca del sujeto.
    6. Cuando se complete la prueba, apague los amortiguadores y las cintas de correr; Devuelva a los ratones a sus jaulas domésticas. Transfiera los ratones a la ubicación de la vivienda.
    7. Limpie las cintas de correr con detergente líquido y agua, prestando especial atención a eliminar cualquier PO residual.
    8. Cuando se completen los experimentos, eutanasia a los animales (por ejemplo, usando la inhalación deCO2 ) y confirme visualmente la ubicación del transpondedor.

figure-protocol-2
Figura 2: Pruebas de temperatura controlada por actividad. (A) Flujo de trabajo de pruebas de temperatura controladas por actividad con un agente farmacológico utilizando caminata en cinta rodante. (B) Imágenes de las instalaciones de las cintas de correr. A la izquierda, una imagen de la configuración completa del equipo. A la derecha, una imagen más cercana de cintas de correr individuales y chocadores. (A) fue creado con Biorender.com. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Resultados

Los transpondedores se implantaron unilateralmente en el gastrocnemio derecho de diez ratones de tipo salvaje (WT) de 4-6 meses de edad criados a partir de la cepa SF1-Cre (Tg (Nr5a1-cre) 7Lowl / J, cepa # 012462, C57BL / 6J y fondos FVB; hembra N = 5; macho N = 5). Después de la recuperación, los ratones se habituaron a un procedimiento de prueba de temperatura en jaula en el hogar que no incluía un estímulo contextual (por ejemplo, PO). Las mediciones de temperatura con una varita de transpondedor se registraron dentro...

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Discusión

Este protocolo de prueba de temperatura proporciona al campo una vía para medir directamente la termogénesis del músculo esquelético. Esto es crítico a medida que la investigación profundiza en la identificación de los mecanismos subyacentes a la termogénesis muscular33. El método proporciona dos protocolos rentables para medir la termogénesis del músculo esquelético en condiciones contextuales y farmacológicas. Este protocolo enfatiza la importancia tanto de la habituación como de la aclimatación...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

Este trabajo es compatible con R15 DK097644 y R15 DK108668. Agradecemos al Dr. Chaitanya K Gavini y a la Dra. Megan Rich por sus contribuciones anteriores y al Dr. Stanley Dannemiller por garantizar nuestro cumplimiento con las pautas institucionales de uso de animales. Un agradecimiento especial al Dr. Tim Bartness por proporcionar la investigación fundamental necesaria para construir este método y sus estudios asociados. Las figuras 1A, C, D y 2A se crearon utilizando Biorender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
1012M-2 Cinta de Correr Metabólica Modular Cerrada para Ratones, 2 Carriles con ShockColumbus Instruments
1012R-2 Cinta de Correr Metabólica Modular Cerrada para Ratas, 2 Carriles con ShockColumbus Instruments
1-1/4 pulg. Cortador de PVC con trinqueteBrassCraft
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