Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

Summary

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Abstract

La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado. Por lo tanto, el uso de modelos preclínicos apropiados de evaluación de seguridad cardíaca es un paso crítico durante el desarrollo de fármacos. Actualmente, la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los estudios en animales. Sin embargo, los modelos animales están plagados de poca especificidad traslacional para los humanos debido a las diferencias específicas de la especie, particularmente en términos de características electrofisiológicas cardíacas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro invaluable para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Los hiPSC-CM se pueden obtener de individuos con diversos antecedentes genéticos y diversas afecciones enfermas, lo que los convierte en un sustituto ideal para evaluar individualmente la cardiotoxicidad inducida por fármacos. Por lo tanto, es necesario establecer metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de las hiPSC-CM. En este protocolo, detallamos varios ensayos funcionales que pueden evaluarse en hiPSC-CM, incluida la medición de contractilidad, potencial de campo, potencial de acción y manejo de calcio. En general, la incorporación de hiPSC-CM en la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca tiene el potencial de revolucionar el desarrollo de fármacos.

Introduction

El desarrollo de fármacos es un proceso largo y costoso. Un estudio de nuevos medicamentos terapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) entre 2009 y 2018 informó que el costo medio estimado de la investigación capitalizada y los ensayos clínicos fue de $ 985 millones por producto¹. La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado². En particular, la cardiotoxicidad es reportada entre múltiples clases de fármacos terapéuticos³. Por lo tanto, la evaluación de la seguridad cardíaca es un component....

Protocol

1. Preparación de medios y soluciones

1. Prepare el medio de mantenimiento hiPSC-CM mezclando un frasco de 10 ml de suplemento 50x B27 y 500 ml de medio RPMI 1640. Conservar el medio a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes. Equilibre el medio a la temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
2. Preparar el medio de siembra hiPSC-CM mezclando 20 ml de reemplazo sérico y 180 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM (dilución al 10%, v/v). Si bien se prefiere el medio de siembra recién preparado, se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Equilibre el medio a RT antes de usarlo.
3. Preparar la solución de recubrimiento de m....

Results

Este protocolo describe cómo medir el movimiento de contracción, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca²⁺ de hiPSC-CM. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático que incluye la digestión enzimática, la siembra celular, el mantenimiento y la conducción funcional del ensayo. La formación de la monocapa hiPSC-CM es necesaria para la medición del movimiento de contracción (Figura 2B). Un rastro representativo del movimien.......

Discussion

La tecnología iPSC humana se ha convertido en una plataforma poderosa para el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Aquí, describimos un protocolo detallado para medir la contractilidad de hiPSC-CM, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca²⁺. Este protocolo proporciona una caracterización integral de la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CM. Estos ensayos funcionales han sido aplicados en múltiples publicaciones de nuestro grupo 12,13,18,24,25,26,27.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Plato con fondo de vidrio de 35 mm con micropocillo de 20 mm #1.5 cubreobjetos	Cellvis	D35-20-1.5-N	Pinza de parche
50x B27 suplementos	Life Technologies	17504-044	hiPSC-CM medio
de cultivo placa de cultivo de 6 pocillos	E & K Scientific	EK-27160	hiPSC-CM Cultivo
de 96 pocillos, fondo transparente, poliestireno negro, microplacas tratadas con TC	Corning	3603	Medición del movimiento de contracción
Accutase	Sigma-Aldrich	A6964	Disociación enzimática
Axion's Integrated Studio (AxIS)	Software de navegación	Axion Biosystems
Capilares de vidrio de borosilicato	Aparato Harvard	BF 100-50-10,Abrazadera	parche
CaCl2 1 M en H2O	Sigma-Aldrich	21115	Tyrode' s solución
Portaobjetos de cámara de recuento de células	ThermoFisher Scientific	C10228	Recuento
de células CytoView Placas MEA de 48 pocillos	Axion Biosystems	M768-tMEA-48B	MEA
DMEM/F12	Gibco/Life Technologies	12634028	Medio de matriz extracelular
DPBS, sin calcio, sin magnesio	Fisher Scientific	14-190-250
EGTA	Sigma-Aldrich	E3889	Solución de pipeta intracelular
EPC 10 USB  amplificador de pinza de parche	Warner Instruments	89-5000	pinza de parche
Fura-2, AM, permeant de célula	ThermoFisher Scientific	F1221	Ca2+ medición de transitorios
Glucosa	Sigma-Aldrich	G8270	Tyrode' s solución
HEPES	Sigma-Aldrich	H3375	Tyrode' s solución
hiPSCs	Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KCl	Sigma-Aldrich	529552	Tyrode' s solution KnockOut
Serum Replacement	ThermoFisher Scientific	10828-028	hiPSC-CM medio de siembra
KOH 8  M	Sigma-Aldrich	P4494	Solución de pipeta intracelular
Lambda DG 4	Sutter Instrument Company		Ca2+ medición transitoria; fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad
Luna-FL contador de células de fluorescencia automatizado	WISBIOMED	LB-L20001	Recuento de células
Maestro Pro  Sistema MEA	Axion Biosystems		MEA
Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basal	Corning	356231	Medio de matriz extracelular
MgATP	Sigma-Aldrich	A9187	Solución de pipeta intracelular
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266	Tyrode' s solución
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888	Tyrode' s solución
NaOH 10  M	Sigma-Aldrich	72068	Tyrode' s solución
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solución al 20% en DMSO)	ThermoFisher Scientific	P3000MP	Ca2+ medición transitoria
Medio RPMI 1640 Life	Technologies	11875-119	hiPSC-CM
medio de cultivo Sony SI8000 Cell Motion Imaging System	Sony Biotechnology		Contraction motion measurement
Extractor de micropipetas Sutter	Sutter Instruments	P-97	Pinza de parche
Tinción azul de tripano	Life Technologies	T10282	Recuento de células