Method Article

Aplicaciones técnicas de la matriz de microelectrodos y los registros de pinza de parche en cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos

DOI:

10.3791/64265

⸱

August 4th, 2022

 ,  ,  ,  , 
1Stanford Cardiovascular Institute, Stanford University School of Medicine, 2Division of Cardiovascular Medicine, Department of Medicine, Stanford University School of Medicine, 3Department of Radiology, Stanford University School of Medicine

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro prometedor para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Aquí, detallamos un protocolo para medir la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CMs.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado. Por lo tanto, el uso de modelos preclínicos apropiados de evaluación de seguridad cardíaca es un paso crítico durante el desarrollo de fármacos. Actualmente, la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los estudios en animales. Sin embargo, los modelos animales están plagados de poca especificidad traslacional para los humanos debido a las diferencias específicas de la especie, particularmente en términos de características electrofisiológicas cardíacas. Por lo tanto, existe una necesidad urgente de desarrollar un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca. Los cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) se han convertido en un modelo in vitro invaluable para la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y el modelado de enfermedades. Los hiPSC-CM se pueden obtener de individuos con diversos antecedentes genéticos y diversas afecciones enfermas, lo que los convierte en un sustituto ideal para evaluar individualmente la cardiotoxicidad inducida por fármacos. Por lo tanto, es necesario establecer metodologías para investigar exhaustivamente las características funcionales de las hiPSC-CM. En este protocolo, detallamos varios ensayos funcionales que pueden evaluarse en hiPSC-CM, incluida la medición de contractilidad, potencial de campo, potencial de acción y manejo de calcio. En general, la incorporación de hiPSC-CM en la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca tiene el potencial de revolucionar el desarrollo de fármacos.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo de fármacos es un proceso largo y costoso. Un estudio de nuevos medicamentos terapéuticos aprobados por la Administración de Alimentos y Medicamentos de los Estados Unidos (FDA) entre 2009 y 2018 informó que el costo medio estimado de la investigación capitalizada y los ensayos clínicos fue de $ 985 millones por producto1. La cardiotoxicidad inducida por fármacos es la principal causa de desgaste y retirada del mercado2. En particular, la cardiotoxicidad es reportada entre múltiples clases de fármacos terapéuticos3. Por lo tanto, la evaluación de la seguridad cardíaca es un componente crucial durante el proceso de desarrollo del fármaco. El paradigma actual para la evaluación de la seguridad cardíaca sigue dependiendo en gran medida de los modelos animales. Sin embargo, las diferencias de especies con respecto al uso de modelos animales son cada vez más reconocidas como una causa primaria de predicciones inexactas para la cardiotoxicidad inducida por fármacos en pacientes humanos4. Por ejemplo, la morfología del potencial de acción cardíaca difiere sustancialmente entre humanos y ratones debido a las contribuciones de diferentes corrientes de repolarización5. Además, las isoformas diferenciales de miosina cardíaca y ARN circulares que pueden afectar la fisiología cardíaca han sido bien documentadas entre las especies 6,7. Para cerrar estas brechas, es imperativo establecer un modelo confiable, eficiente y basado en humanos para la evaluación preclínica de la seguridad cardíaca.

La innovadora invención de la tecnología de células madre pluripotentes inducidas (iPSC) ha generado plataformas sin precedentes de detección de fármacos y modelado de enfermedades. Durante la última década, los métodos para generar cardiomiocitos derivados de células madre pluripotentes inducidos por humanos (hiPSC-CM) sehan establecido bien 8,9. Los hiPSC-CM han atraído un gran interés en sus aplicaciones potenciales en el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por fármacos y la medicina de precisión. Por ejemplo, los hiPSC-CM se han utilizado para modelar los fenotipos patológicos de las enfermedades cardíacas causadas por la herencia genética, como el síndrome de QT largo10, la miocardiopatía hipertrófica 11,12 y la miocardiopatía dilatada13,14,15. En consecuencia, se han identificado vías de señalización clave implicadas en la patogénesis de las enfermedades cardíacas, que pueden arrojar luz sobre posibles estrategias terapéuticas para un tratamiento efectivo. Además, los hiPSC-CM se han utilizado para detectar cardiotoxicidad inducida por fármacos asociada con agentes anticancerosos, incluyendo doxorrubicina, trastuzumab e inhibidores de la tirosina cinasa16,17,18; Se están investigando estrategias para mitigar la cardiotoxicidad resultante. Finalmente, la información genética retenida en los hiPSC-CMs permite el tamizaje y la predicción de la cardiotoxicidad inducida por fármacos tanto a nivel individual como poblacional19,20. En conjunto, los hiPSC-CM han demostrado ser una herramienta invaluable para la predicción personalizada de la seguridad cardíaca.

El objetivo general de este protocolo es establecer metodologías para investigar de manera integral y eficiente las características funcionales de las hiPSC-CM, que son de gran importancia en la aplicación de hiPSC-CM hacia el modelado de enfermedades, la detección de cardiotoxicidad inducida por medicamentos y la medicina de precisión. Aquí, detallamos una serie de ensayos funcionales para evaluar las propiedades funcionales de los hiPSC-CM, incluida la medición de la contractilidad, el potencial de campo, el potencial de acción y el manejo del calcio (Ca2+) (Figura 1).

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Preparación de medios y soluciones

  1. Prepare el medio de mantenimiento hiPSC-CM mezclando un frasco de 10 ml de suplemento 50x B27 y 500 ml de medio RPMI 1640. Conservar el medio a 4 °C y utilizarlo en el plazo de un mes. Equilibre el medio a la temperatura ambiente (RT) antes de usarlo.
  2. Preparar el medio de siembra hiPSC-CM mezclando 20 ml de reemplazo sérico y 180 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM (dilución al 10%, v/v). Si bien se prefiere el medio de siembra recién preparado, se puede almacenar a 4 ° C durante no más de 2 semanas. Equilibre el medio a RT antes de usarlo.
  3. Preparar la solución de recubrimiento de matriz extracelular descongelando un frasco (10 ml) de matriz de membrana basal a 4 °C durante la noche y alícuota 500 μL de matriz de membrana basal en tubos estériles de 1,5 ml. Conservar a -20 °C para su uso posterior. Mezcle 500 μL de matriz de membrana basal y 100 ml de medio DMEM/F12 helado (dilución 1:200, v/v) para hacer una solución de recubrimiento de matriz de membrana basal.
  4. Prepare 50 ml de solución de Tyrode que contenga 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucosa y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.4 con NaOH. Prepare la solución fresca de Tyrode el día del experimento.
  5. Preparar 50 ml de solución de pipeta intracelular que contenga 120 mM de KCl, 1 mM de MgCl2, 10 mM de EGTA y 10 mM de HEPES. Ajuste el pH a 7.2 con KOH. Alícuota la solución de pipeta intracelular en tubos estériles de 5 ml y almacénela a -20 °C. El día del experimento, agregue MgATP a la solución para lograr una concentración final de 3 mM.
  6. Preparar 1 ml de solución de carga de Fura-2 AM que contenga 2 μM de Fura-2 AM y 0,1% de Pluronic F-127. Prepare una solución de carga fresca el día del experimento y protéjala de la luz.

2. Medición del movimiento de contracción hiPSC-CM

  1. Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal agregando 100 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular a cada pocillo de placas de 96 pocillos. Incubar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Disociación enzimática de hiPSC-CMs
    1. Solicite hiPSCs al Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Generar hiPSC-CMs según las publicaciones anteriores 8,9. Observe los hiPSC-CM cultivados en placas de seis pocillos bajo un microscopio con un aumento de 10x.
      NOTA: No disocie las células cuando todavía son proliferativas. De lo contrario, las células crecerán demasiado en los pocillos después del rechapado y conducirán a resultados inexactos de los ensayos funcionales. Por lo general, los hiPSC-CM detienen la proliferación en los días 18-23.
    2. Asegúrese de que los hiPSC-CM laten con fuerza y tengan una pureza superior al 95%. Evaluar la pureza mediante inmunotinción contra troponina T cardíaca, un marcador específico de cardiomiocitos 8,9.
    3. Aspirar el medio de mantenimiento y lavar las células con 1x DPBS dos veces. Añadir 1 ml de solución de desprendimiento celular a cada pocillo de las placas de seis pocillos e incubar durante 10 min a 37 °C.
      NOTA: La duración de la incubación debe ser monitoreada regularmente. Asegúrese de no digerir demasiado las células, ya que reducirá la viabilidad celular.
    4. Pipete suavemente hiPSC-CMs hacia arriba y hacia abajo varias veces usando una pipeta de 5 ml para generar una suspensión de una sola celda. Agregue un volumen igual de medio de siembra hiPSC-CM para neutralizar la solución de desprendimiento celular.
    5. Centrifugar hiPSC-CMs a 300 x g durante 3 min a RT. Aspirar el sobrenadante y resuspender el pellet celular en 1-2 mL de medio de siembra hiPSC-CM.
    6. Cuantificar la densidad celular y la viabilidad utilizando un método de exclusión de azul de tripano. Brevemente, mezcle 10 μL de suspensión celular con un volumen igual de azul de tripano, transfiéralo a un portaobjetos de conteo de células y luego cuente con un contador de celdas, como se describió anteriormente21.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 96 pocillos.
    2. Sembrar 50.000 células por pocillo en 100 μL de medio de siembra hiPSC-CM y colocar las placas de 96 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
    3. Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 100 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días hasta la grabación.
  4. Adquisición de datos
    1. Mida el movimiento de contracción de hiPSC-CM al menos 10 días después de la colocación (recomendado).
    2. Encienda el controlador de temperatura y ajuste 37 °C como temperatura preferida. Encienda el microscopio, la cámara y el suministro deCO2 .
    3. Llene la camisa de agua del soporte de la placa con una cantidad adecuada de agua desionizada estéril (Figura 2A). Coloque la placa de 96 pocillos en el soporte de la placa y permita que las celdas se aclimaten durante al menos 5 minutos.
    4. Abra el software de visualización, ajuste la velocidad de fotogramas de la cámara a 75 fotogramas por segundo (fps) y la resolución de vídeo/imagen a 1024 × 1024 píxeles. Aplique las funciones de enfoque automático y brillo automático. Grabe videos e imágenes de hiPSC-CMs.
      NOTA: Evite la vibración de la mesa del microscopio durante la grabación.
    5. Abra el software del analizador para el análisis automático.

3. Medición del potencial de campo hiPSC-CM

  1. Preparación de placas recubiertas de matriz de membrana basal
    1. Coloque cuidadosamente una gota de 8 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de las placas de matriz de microelectrodos (MEA) de 48 pocillos. Consulte la Figura 3A para conocer el área de electrodo adecuada para la colocación de gotas. Este paso es crítico para mantener la monocapa hiPSC-CM concentrada en los electrodos. Evite tocar los electrodos en cualquier circunstancia.
    2. Agregue 3 ml de agua desionizada estéril al área que rodea los pozos (Figura 3A) de las placas MEA de 48 pocillos para evitar la evaporación de la solución de recubrimiento. Incubar placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 45-60 min.
      NOTA: No incubar durante demasiado tiempo para evitar que la matriz de la membrana basal se seque.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la mayor parte del medio de la matriz extracelular de la superficie del pozo sin tocar los electrodos utilizando una punta de pipeta de 200 μL dentro de la misma fila o columna.
    2. Sembrar 50.000 células por pocillo en una gota de 8 μL de medio de siembra hiPSC-CM sobre el área del electrodo de registro de cada pocillo de la misma fila o columna.
    3. Repita los dos últimos pasos hasta que todos los pocillos hayan sido chapados con celdas. Verifique bajo el microscopio que todos los pozos tengan la suspensión hiPSC-CM. Para la densidad deseada, consulte la figura 3B.
      NOTA: La unión de hiPSC-CM se verá comprometida si la matriz de la membrana basal está completamente seca, lo que hace que la unión celular sea subóptima.
    4. Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante 60 min.
    5. Agregue lenta y suavemente 150 μL de medio de siembra hiPSC-CM a cada pocillo de las placas MEA de 48 pocillos. Para añadir medio sin dispersar hiPSC-CM previamente sembrados, sostenga la placa en un ángulo de 45°, apoye la punta de la pipeta contra la pared de cada pocillo y suelte el medio lentamente.
      NOTA: Agregar medio demasiado rápido o con alta presión desalojará los cardiomiocitos adheridos. Evite el contacto directo con la suspensión de caída hiPSC-CM.
    6. Incubar las placas MEA de 48 pocillos en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
    7. Refresque el medio de siembra hiPSC-CM con 300 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición de MEA al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). En el día 10 después del recubrimiento, verifique la densidad de la monocapa hiPSC-CM de batido espontáneo bajo un microscopio con un aumento de 10x, que debe ser como se muestra en la Figura 3C.
    2. Coloque la placa MEA de 48 pocillos en el instrumento de grabación. La pantalla táctil permite observar el estado de temperatura (37 °C) y CO2 (5%).
    3. Abra el software del navegador. En la ventana de configuración experimental, seleccione Configuración cardíaca en tiempo real y Registros de potencial de campo. Aplicar configuraciones de batido espontáneas o de ritmo.
    4. En los parámetros de detección de latidos, establezca el umbral de detección en 300 μV, el período de latido mínimo en 250 ms y el período máximo de latido en 5 s. Seleccione Regresión polinómica para el cálculo de la duración potencial de campo (FPD).
    5. Compruebe si la señal de actividad eléctrica de referencia está madura y estable.
      NOTA: Las formas de onda maduras registradas por cada electrodo de la placa MEA de pocillos múltiples deben reflejar el potencial del campo cardíaco con características fácilmente identificables que coincidan con el pico de despolarización cardíaca y la fase de repolarización, como se muestra en la Figura 3D-F.
    6. Adquirir las actividades cardíacas basales durante 1-3 min. Si se necesita tratamiento farmacológico, agregue compuestos a los pocillos después del registro inicial. Coloque la placa en una incubadora durante al menos 30 minutos antes de la siguiente grabación.

4. Medición del potencial de acción de hiPSC-CM

  1. Prepare platos recubiertos con matriz de membrana basal colocando 500 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm (Figura 4A). Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las placas de 35 mm. Sembrar 50.000 células por pocillo en 500 μL de medio de siembra hiPSC-CM en la parte inferior de vidrio de platos de 35 mm.
    2. Incubar los platos de 35 mm en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche. Retire el medio de siembra hiPSC-CM y agregue 2 ml de medio de mantenimiento hiPSC-CM a los platos de 35 mm.
      NOTA: Se recomienda colocar una punta no filtrada de 200 μL sobre la pipeta de aspiración de 2 ml para eliminar el medio gastado y evitar tocar las células.
    3. Cambie el medio de cultivo hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición del potencial de acción al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Descongelar una alícuota de solución de pipeta intracelular y añadir MgATP a una concentración final de 3 mM.
    2. Extraiga las micropipetas de los capilares de vidrio de borosilicato utilizando un extractor de micropipetas.
      NOTA: Se prefiere una resistencia de 2-5 MΩ de las micropipetas.
    3. Reemplace el medio de mantenimiento hiPSC-CM con la solución de Tyrode y permita que las células se aclimaten a la solución de Tyrode durante 15 minutos (figura 4C). Inserte los sensores de temperatura en la cámara, coloque el plato de 35 mm en la cámara como se muestra en la Figura 4C y ajuste la temperatura a 37 °C (Figura 4D).
    4. Llene las micropipetas con solución intracelular e insértelas en el soporte conectado al cabezal del amplificador de abrazadera de conexión (Figura 4E). Abra el software de estimulación/adquisición, cargue el protocolo de grabación del potencial de acción y seleccione la configuración de pinza de voltaje.
    5. Inserte la micropipeta en la solución de baño, seleccione las hiPSC-CM individuales adecuadas y ajuste y baje la posición de la micropipeta junto a la célula seleccionada utilizando un micromanipulador. Cuando se inserte la punta de la pipeta en la solución de baño, compruebe la resistencia de la pipeta que se puede observar en el monitor del osciloscopio.
    6. Coloque la pipeta cerca de la celda y los pulsos de corriente disminuirán ligeramente para reflejar la creciente resistencia del sellado. Aplique una succión suave con presión negativa para aumentar la resistencia, que formará un gigasellado. Aplique la función Sellado .
    7. Aplique succión adicional para romper la membrana y obtener una configuración de grabación de celda completa. Una vez que la porción de membrana dentro del área de la pipeta se rompe por succión, la solución interna está en equilibrio con el citoplasma celular. En este punto, cambie del modo de abrazadera de voltaje (abrazadera en V) al modo de abrazadera de corriente o sin inyección de corriente (abrazadera C) utilizando el cuadro de diálogo del amplificador. Pulse el botón Grabar para generar y guardar los archivos de grabación de acción potencial.
      NOTA: El cambio de modo proporciona un registro continuo de los potenciales de acción espontánea de los hiPSC-CM a través de un protocolo de grabación sin disparador ni estimulación, que se puede monitorear en la salida V-mon del amplificador patch-clamp.

5. Medición del transitorio hiPSC-CM Ca2+

  1. Consulte el protocolo anterior para preparar cámaras celulares personalizadas para imágenes de Ca2+ 21. Para la preparación de la cámara celular recubierta de matriz de la membrana basal, coloque 200 μL de solución de recubrimiento de matriz extracelular en las cámaras celulares. Incubar las cámaras celulares en una incubadora de cultivo celular humidificado a 37 °C, 5% deCO2 durante la noche.
  2. Realizar la disociación enzimática de hiPSC-CMs como se describe en el paso 2.2.
  3. Siembra de hiPSC-CMs
    1. Retire la solución de recubrimiento de matriz extracelular de las cámaras celulares. Sembrar 20.000 células por pocillo en 200 μL de medio de siembra hiPSC-CM.
    2. Reemplace el medio de siembra hiPSC-CM con 200 μL de medio de mantenimiento hiPSC-CM 1 día después del recubrimiento. Cambie el medio de mantenimiento hiPSC-CM cada 2 días antes de grabar.
  4. Adquisición de datos
    1. Realice la medición transitoria de Ca2+ al menos 10 días después del recubrimiento (recomendado). Prepare la solución fresca de Tyrode como se describe en el paso 1.4. Prepare una solución de carga Fura-2 AM fresca como se describe en el paso 1.6.
    2. Aspirar el medio de mantenimiento hiPSC-CM y lavar dos veces con la solución de Tyrode. Aplicar 100 μL de solución de carga Fura-2 AM e incubar durante 10 min a RT.
    3. Reemplace la solución de carga Fura-2 AM con la solución de Tyrode y espere al menos 5 minutos para la desesterificación completa de Fura-2 AM.
    4. Agregue una gota de aceite de inmersión en el objetivo 40x de un microscopio de epifluorescencia invertido equipado con un objetivo de inmersión en aceite 40x (0.95 NA). Coloque la cámara celular en el adaptador de etapa del microscopio (Figura 5A).
    5. Instale los cables del controlador de temperatura en la cámara de baño y configúrela a 37 °C. Instale los electrodos de estimulación del campo eléctrico y ajuste los pulsos a 0,5 Hz con una duración de 20 ms.
    6. Encienda la fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad y configúrela en el modo de conmutación rápida de 340 nm y 380 nm de acuerdo con las instrucciones del instrumento.
    7. Aplique un tiempo de exposición de 20 ms para ambas longitudes de onda y un tiempo de grabación de 20 s en el software. Grabe el video reflejando los cambios en tiempo real de Ca2+ transitorio en hiPSC-CMs. Exporte los datos a una hoja de cálculo y analice los datos como se describió anteriormente23.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe cómo medir el movimiento de contracción, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+ de hiPSC-CM. En la Figura 1 se muestra un diagrama esquemático que incluye la digestión enzimática, la siembra celular, el mantenimiento y la conducción funcional del ensayo. La formación de la monocapa hiPSC-CM es necesaria para la medición del movimiento de contracción (Figura 2B). Un rastro representativo del movimien...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La tecnología iPSC humana se ha convertido en una plataforma poderosa para el modelado de enfermedades y la detección de medicamentos. Aquí, describimos un protocolo detallado para medir la contractilidad de hiPSC-CM, el potencial de campo, el potencial de acción y el transitorio Ca2+. Este protocolo proporciona una caracterización integral de la contractilidad y electrofisiología de hiPSC-CM. Estos ensayos funcionales han sido aplicados en múltiples publicaciones de nuestro grupo 12,13,18,24,25,26,27.

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

J.C.W. es cofundador de Greenstone Biosciences, pero no tiene intereses en competencia, ya que el trabajo presentado aquí es completamente independiente. Los otros autores declaran que no hay intereses en conflicto.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Blake Wu por corregir el manuscrito. Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 y NASA NNX16A069A (JCW), y AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Plato con fondo de vidrio de 35 mm con micropocillo de 20 mm #1.5 cubreobjetosCellvisD35-20-1.5-NPinza de parche
50x B27 suplementosLife Technologies17504-044hiPSC-CM medio
de cultivo placa de cultivo de 6 pocillosE & K ScientificEK-27160hiPSC-CM Cultivo
de 96 pocillos, fondo transparente, poliestireno negro, microplacas tratadas con TCCorning3603Medición del movimiento de contracción
AccutaseSigma-AldrichA6964Disociación enzimática
Axion's Integrated Studio (AxIS)Software de navegaciónAxion Biosystems
Capilares de vidrio de borosilicatoAparato HarvardBF 100-50-10,Abrazaderaparche
CaCl2 1 M en H2OSigma-Aldrich21115Tyrode' s solución
Portaobjetos de cámara de recuento de célulasThermoFisher ScientificC10228Recuento
de células CytoView Placas MEA de 48 pocillosAxion BiosystemsM768-tMEA-48BMEA
DMEM/F12Gibco/Life Technologies12634028Medio de matriz extracelular
DPBS, sin calcio, sin magnesioFisher Scientific14-190-250
EGTASigma-AldrichE3889Solución de pipeta intracelular
EPC 10 USB  amplificador de pinza de parcheWarner Instruments89-5000pinza de parche
Fura-2, AM, permeant de célulaThermoFisher ScientificF1221Ca2+ medición de transitorios
GlucosaSigma-AldrichG8270Tyrode' s solución
HEPESSigma-AldrichH3375Tyrode' s solución
hiPSCsStanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank
KClSigma-Aldrich529552Tyrode' s solution KnockOut
Serum ReplacementThermoFisher Scientific10828-028hiPSC-CM medio de siembra
KOH 8  MSigma-AldrichP4494Solución de pipeta intracelular
Lambda DG 4Sutter Instrument CompanyCa2+ medición transitoria; fuente de luz de conmutación de longitud de onda de ultra alta velocidad
Luna-FL contador de células de fluorescencia automatizadoWISBIOMEDLB-L20001Recuento de células
Maestro Pro  Sistema MEAAxion BiosystemsMEA
Matrigel Factor de crecimiento reducido (GFR) Matriz de membrana basalCorning356231Medio de matriz extracelular
MgATPSigma-AldrichA9187Solución de pipeta intracelular
MgCl2Sigma-AldrichM8266Tyrode' s solución
NaClSigma-AldrichS9888Tyrode' s solución
NaOH 10  MSigma-Aldrich72068Tyrode' s solución
NIS Elements AR
Pluronic F-127 (solución al 20% en DMSO)ThermoFisher ScientificP3000MPCa2+ medición transitoria
Medio RPMI 1640 LifeTechnologies11875-119hiPSC-CM
medio de cultivo Sony SI8000 Cell Motion Imaging SystemSony BiotechnologyContraction motion measurement
Extractor de micropipetas SutterSutter InstrumentsP-97Pinza de parche
Tinción azul de tripanoLife TechnologiesT10282Recuento de células
de de

References

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