Artículo de método

Aislamiento y cuantificación del virus de Epstein-Barr de la línea celular P3HR1

DOI:

10.3791/64279

⸱

28 de septiembre de 2022

 ,  , 
1Department of Experimental Pathology, Immunology and Microbiology, Faculty of Medicine, American University of Beirut, 2Center for Infectious Diseases Research (CIDR), Faculty of Medicine, American University of Beirut

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo permite el aislamiento de partículas del virus de Epstein-Barr de la línea celular humana P3HR1 al inducir el ciclo lítico viral con forbol 12-miristato 13-acetato. Posteriormente, el ADN se extrae de la preparación viral y se somete a PCR en tiempo real para cuantificar la concentración de partículas virales.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El virus de Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como Herpesvirus humano 4 (HHV-4), es el primer virus tumoral humano aislado. Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por EBV. Con los recientes avances en biología molecular e inmunología, la aplicación de modelos experimentales in vitro e in vivo ha proporcionado una visión profunda y significativa de la patogénesis del VEB en muchas enfermedades, así como de la tumorigénesis asociada al VEB. El objetivo de este trabajo de experimento visualizado es proporcionar una visión general del aislamiento de partículas virales de EBV de células de la línea celular P3HR1, seguido de la cuantificación de la preparación viral. Las células P3HR1, originalmente aisladas de un linfoma de Burkitt humano, pueden producir un virus P3HR1, que es una cepa de EBV tipo 2. El ciclo lítico del VEB puede ser inducido en estas células P3HR1 mediante el tratamiento con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), produciendo partículas virales del VEB.

Utilizando este protocolo para el aislamiento de partículas de EBV, las células P3HR1 se cultivan durante 5 días a 37 °C y 5% deCO2 en medio RPMI-1640 completo que contiene 35 ng / ml PMA. Posteriormente, el medio de cultivo se centrifuga a una velocidad de 120 x g durante 8 min para granular las células. El sobrenadante que contiene el virus se recoge y se hace girar a una velocidad de 16.000 x g durante 90 minutos para granular las partículas de EBV. El pellet viral se resuspende en un medio RPMI-1640 completo. Esto es seguido por la extracción de ADN y la PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar la concentración de partículas de VEB en la preparación.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El virus de Epstein-Barr (VEB) es el primer virus tumoral humano que se ha aislado1. EBV, formalmente conocido como Herpesvirus humano 4 (HHV-4) 2, es parte de la subfamilia de virus del herpes gamma de la familia de virus del herpes y es el prototipo del género Lymphocryptovirus . Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por el virus3. En la mayoría de los casos, la infección inicial ocurre dentro de los primeros 3 años de vida y es asintomática, sin embargo, si la infección ocurre más tarde durante la adolescencia, puede dar lugar a una enfermedad denominada mononucleosis infecciosa4. El VEB es capaz de infectar las células B en reposo induciéndolas a convertirse en linfoblastos B proliferativos en los que el virus establece y mantiene un estado de infección latente5. El VEB puede reactivarse en cualquier momento y, por lo tanto, provocar infecciones recurrentes6.

En los últimos 50 años, la asociación entre algunos virus y el desarrollo de neoplasias malignas humanas se ha vuelto cada vez más evidente, y hoy se estima que entre 15% y 20% de todos los cánceres humanos están relacionados con infecciones virales7. Los virus del herpes, incluido el VEB, son algunos de los ejemplos mejor estudiados de estos tipos de virus tumorales8. De hecho, el VEB puede causar muchos tipos de neoplasias malignas humanas, como el linfoma de Burkitt (BL), el linfoma de Hodgkin (LH), el linfoma difuso de células B grandes y las enfermedades linfoproliferativas en huéspedes inmunocomprometidos 9,10. También se ha demostrado que el VEB está asociado con el desarrollo de enfermedades autoinmunes sistémicas. Algunos ejemplos de estos trastornos autoinmunes son la artritis reumatoide (AR), la polimiositis-dermatomiositis (PM-DM), el lupus eritematoso sistémico (LES), la enfermedad mixta del tejido conectivo (MCTD) y el síndrome de Sjögren (SS)11. El VEB también está asociado con el desarrollo de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII)12.

Muchas de estas enfermedades se pueden estudiar o modelar utilizando cultivos celulares, ratones u otros organismos que están infectados con EBV. Es por ello que se necesitan partículas de VEB para infectar células u organismos, ya sea in vitro o in vivo modelos 13,14,15,16, de ahí la necesidad de desarrollar una técnica que permita el aislamiento de partículas virales a bajo coste. El protocolo descrito aquí proporciona pautas para una manera fácil de aislar de manera confiable las partículas de EBV de una línea celular relativamente accesible y cuantificar las partículas utilizando PCR en tiempo real, que es rentable y fácilmente disponible para la mayoría de los laboratorios. Esto es en comparación con varios otros métodos que se han descrito para aislar el VEB de diferentes líneas celulares17,18,19,20.

P3HR-1 es una línea celular BL que crece en suspensión y está infectada latentemente con una cepa de EBV tipo 2. Esta línea celular es un productor de VEB y puede ser inducida a producir partículas virales. El objetivo de este manuscrito es mostrar un método que permita el aislamiento de partículas de VEB de la línea celular P3HR-1, seguido de la cuantificación del stock viral que luego podría usarse para modelos experimentales de VEB in vitro e in vivo .

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Protocolo

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NOTA: El VEB debe considerarse un material potencialmente peligroso para el uso biológico y, por lo tanto, debe manejarse bajo contención de nivel 2 de bioseguridad o superior. Se debe usar una bata de laboratorio y guantes. Si existe la posibilidad de exposición a salpicaduras, también se debe considerar la protección ocular. El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica.

1. Contando las celdas P3HR1

  1. Centrifugación y resuspensión de células
    1. Transfiera la suspensión celular de una placa de cultivo de 100 mm (o matraz T-25) de un cultivo celular P3HR1 en curso con una confluencia del 80% a un tubo cónico de 15 ml. La densidad de siembra de las células P3HR-1 es de 1 x 106 células/ml. Mantener en medio de cultivo RPMI completo (79% medio de cultivo RPMI, 20% Suero Bovino Fetal, 1% antibiótico Pen-Strep) a 37 °C y 5%CO2, y paso cada 3-4 días.
    2. Centrífuga durante 8 min a 120 x g. Después de la centrifugación, deseche el sobrenadante, resuspenda el pellet celular en 1 ml de medio de cultivo RPMI completo y mezcle bien (esta solución se denominará suspensión A).
  2. Preparación de la suspensión de celdas para el conteo
    1. Preparar una suspensión celular B diluida mezclando 2 μL de suspensión celular A con 8 μL de medio de cultivo. Añadir 10 μL de azul de tripano al 0,4% a la suspensión B para obtener la suspensión C. Mezclar bien la preparación con un pipeteo suave.
  3. Recuento de células con un hemocitómetro
    1. Coloque un cubreobjetos de vidrio en el hemocitómetro y cargue 10 μL de suspensión C. Coloque el hemocitómetro bajo un microscopio óptico y cuente el número de células que no están teñidas de azul en cada uno de los cuatro cuadrantes de la cámara del hemocitómetro utilizando el objetivo del microscopio 40x (Figura 1).
    2. El azul de tripano tiñe las células muertas de azul; No cuente estas células, ni las células que están tocando cualquiera de los bordes superior, inferior, derecho o izquierdo de cada cuadrante del hemocitómetro.
    3. Calcule la concentración de células por ml utilizando la siguiente fórmula:
      figure-protocol-1
      NOTA: El número de cuadrantes contados es cuatro, y 10-4 ml es el volumen de los cuadrados en el hemocitómetro. Los cuatro cuadrantes que deben contarse están representados en verde en la Figura 1. Total de celdas contadas en la fórmula es la suma del número de celdas en los cuadrantes 1, 2, 3 y 4. Las celdas representadas en azul en la figura 1 deben contarse, mientras que las celdas en rojo no deben contarse ya que están tocando los bordes superior, derecho, inferior o izquierdo del cuadrante.

figure-protocol-2
Figura 1: Conteo celular usando una cámara de hemocitómetro. Cuatro cuadrantes se cuentan con un microscopio óptico; Estos cuadrantes están representados en verde. Total de celdas contadas en la fórmula indicada en el paso 1.3.3 del protocolo descrito aquí es la suma del número de celdas en los cuadrantes 1, 2, 3 y 4. Las celdas indicadas en azul deben contarse, mientras que las celdas en rojo no deben contarse, ya que tocan los bordes superior, derecho, inferior o izquierdo del cuadrante. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

2. Preparación del plato para el cultivo

  1. Coloque un volumen de suspensión celular A en un tubo cónico de 15 ml. El volumen requerido depende del recuento de células. Ajuste el volumen de tal manera que el número de células sea aproximadamente 2,2 x 106 células para una placa de cultivo de 100 mm.
  2. Agregue 5 ml de medio de cultivo completo al tubo y luego transfiera el contenido del tubo a una placa de cultivo de 100 mm. Añadir 80 μL de dimetilsulfóxido (DMSO) a la placa de cultivo.
    NOTA: DMSO es sensible a la luz, por lo tanto, debe almacenarse en un recipiente resistente a la luz o cubrirse con un material opaco como papel de aluminio.
  3. Agregue 350 μL de 1 mg/ml de forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) al tubo. La concentración final de PMA debe ser de 35 ng/mL, y la de DMSO debe ser de 0,08%.
    PRECAUCIÓN: El PMA es tóxico, corrosivo y cancerígeno, por lo tanto, debe manejarse con extremo cuidado. El PMA es sensible a la luz, por lo tanto, debe almacenarse en un recipiente resistente a la luz o cubrirse con un material opaco como papel de aluminio.
  4. Añadir 4,27 ml de medio de cultivo para que el volumen total sea de 10 ml. Mezcle el contenido del tubo inclinándolo y, a continuación, transfiera el contenido a una placa de cultivo de 100 mm. Dejar la placa en una incubadora de cultivo celular durante 5 días a 37 °C, 5%CO2.

3. Inducción y aislamiento de partículas del virus de Epstein-Barr

  1. Después de 5 días en la incubadora, centrifugar el contenido de la placa a 120 x g durante 8 minutos para granular las células. Recoja el sobrenadante libre de células que contiene virus y deseche el pellet celular.
  2. Centrifugar el sobrenadante a 16.000 x g durante 90 min a 4 °C para granular las partículas del virus. Desechar el sobrenadante y resuspender el pellet de virus en 5 mL de medio de cultivo.
    NOTA: La solución salina tamponada con fosfato (PBS) se puede utilizar para resuspender el pellet del virus en lugar del medio de cultivo.
  3. Alícuota la suspensión viral obtenida en 20 tubos, cada uno de los cuales contiene 250 μL de la suspensión viral. Conservar la suspensión a -80 °C.

4. Extracción de ADN de partículas virales

PRECAUCIÓN: Se debe tener mucho cuidado al manipular fenol, ya que es tóxico y corrosivo y tiene la capacidad de causar quemaduras graves. El fenol es sensible a la luz y se oxida al contacto con la luz o el aire. Guárdelo en un recipiente resistente a la luz o, alternativamente, cubra el tubo de fenol con un material opaco como papel de aluminio.

  1. Separación de proteínas del ADN
    1. Añadir 500 μL de fenol saturado con TrisCl a uno de los tubos de 250 μL. Añadir 100 μL de agua (para aumentar el volumen de la fase acuosa) y vortex bien para obtener una emulsión rosada. Centrífuga durante 15 min a 9650 x g.
  2. Precipitación de ADN
    1. Recoger el sobrenadante (fase transparente, acuosa) y transferirlo a un nuevo tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
    2. Añadir un equivalente a 1/10 del volumen de acetato de sodio frío del sobrenadante (3 M, pH 5.2) y mezclar pipeteando hacia arriba y hacia abajo. Añadir 1 μL de 20 mg/ml de glucógeno y mezclar por pipeteo.
      NOTA: Este paso es opcional, pero la adición de glucógeno mejora la precipitación del ADN y facilita la visualización del pellet de ADN.
    3. Agregue tres veces el volumen del sobrenadante de etanol frío al 100%. Conservar a -80 °C durante la noche.
      NOTA: El procedimiento se puede detener aquí para reanudarlo más adelante. La muestra puede almacenarse a -80 °C durante 1 h, o alternativamente durante la noche. El almacenamiento nocturno mejora la precipitación del ADN y, por lo tanto, se recomienda.
  3. Aislar el ADN viral
    1. Al día siguiente, centrifugar a 9650 x g durante 15 min a 4 °C y desechar el sobrenadante para obtener un pellet de ADN.
    2. Lave el pellet tres veces con 1 ml de etanol frío al 70%, centrifugar a 9650 x g durante 15 min y desechar el sobrenadante.
    3. Secar al aire el pellet durante unos 10 min. Resuspender el pellet en 10-50 μL de agua destilada libre de nucleasas (dependiendo del tamaño del pellet de ADN).
    4. Almacenar las muestras a -20 °C para su posterior procesamiento o a 4 °C durante la noche para garantizar la máxima disolución del ADN seguida de almacenamiento a -20 °C. Alternativamente, continúe directamente con el paso 5.

5. Comprobación de la concentración y pureza del ADN

  1. Después de limpiar el pedestal de un microespectrofotómetro con un limpiaparabrisas de tareas delicadas, cargue 1 μL de la preparación de ADN.
  2. Tenga en cuenta la concentración del ADN en la muestra. Compruebe las proporciones de absorbancia tanto en como figure-protocol-3 figure-protocol-4en . El ADN absorberá a 260 nm, las proteínas a 280 nm y las sustancias orgánicas como el fenol se absorberán a 230 nm. Una relación de 1,8-2 se considera suficiente para la PCR en tiempo real.

6. Cuantificación por reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real

  1. Preparación de las mezclas de reacción de PCR
    1. Coloque 5 μL de una mezcla de PCR en tiempo real verde SYBR en tubos de PCR de 0,2 ml. Añadir a cada tubo 1 μL de cebador directo de 7,5 pmol/μL y 1 μL de cebador inverso de 7,5 pmol/μL. Secuencia de cebador hacia adelante: 5'-CCCTAGTGGTTTCGGACACA-3'; Secuencia de cebador inversa: 5'-ACTTGCAAATGCTCTAGGCG-3'. El gen amplificado para determinar el número de copias del genoma del VEB es el gen del ARN pequeño 2 del virus de Epstein-Barr (EBER-2).
    2. A uno de los tubos, agregue 2 μL de agua libre de nucleasas y 1 μL de ADN viral del paso 4. El volumen total de la mezcla de reacción es de 10 μL.
      NOTA: Dependiendo de la concentración de ADN en la muestra, puede ser necesario un paso de dilución. Debe anotarse el factor de dilución F y se integrará en la fórmula del paso 6.3.
    3. Prepare otros tubos que se utilizarán como estándares con números conocidos de copias del genoma del VEB (1000, 2000, 5000, 10,000 y 54,000 copias).
  2. Ejecutar las mezclas de PCR comenzando con un paso inicial de activación a 95 °C durante 5 min, luego 40 ciclos a 95 °C y 58 °C (recocido) durante 15 s y 30 s, respectivamente.
  3. Genere una curva estándar de qPCR trazando los valores de Ct de los patrones contra el logaritmo del número de copias del genoma del VEB por tubo estándar. Empleando la ecuación de trazado de curva estándar, se deriva el número de copias del genoma del VEB en el tubo de PCR que contiene el ADN viral inducido. Luego, use la siguiente fórmula para calcular la concentración de la preparación viral inducida:
    figure-protocol-5
    Donde X es el número de copias del genoma del VEB derivadas de la curva estándar y F es el factor de dilución utilizado para configurar el ADN utilizado por reacción de PCR.

7. Comprobación de la actividad biológica/infectividad de las partículas virales

  1. Transfiera células BC-3 de una placa de cultivo de 100 mm con una confluencia del 80% a un tubo cónico de 15 ml. La densidad de siembra de las células P3HR-1 es de 1 x 106 células/ml. Mantener en medio de cultivo RPMI completo (79% medio de cultivo RPMI, 20% Suero Bovino Fetal, 1% antibiótico Pen-Strep) a 37 °C y 5%CO2, y paso cada 3-4 días.
  2. Cuente las células BC-3 de la misma manera que las células P3HR-1 se contaron siguiendo el paso 1. A una placa de 96 pocillos, agregue 105 celdas BC-3 a cada pocillo. Use tres, seis, nueve o 12 pozos para garantizar la importancia de los resultados y minimizar los errores.
  3. Añadir un volumen de material viral a cada pocillo, dependiendo de la concentración de la preparación viral determinada en el paso 6.3. El MOI puede variar, y la optimización de este protocolo revelará el mejor MOI para la infección (se recomienda un rango de MOI de 2-50). Asegúrese de que el volumen total de la mezcla presente en cada pocillo sea de 250 μL.
    1. Para determinar el volumen requerido, se debe conocer la concentración del stock viral y se debe seleccionar un MOI. Por ejemplo, si el MOI es 2, entonces el número de partículas virales agregadas debe ser el doble del número de células. Calcule el volumen V de la cepa viral requerida usando la fórmula: figure-protocol-6, siendo n el número de partículas virales necesarias, y C la concentración conocida de la cepa viral.
  4. Incubar el contenido de la placa de 96 pocillos durante 5 días. Después de 5 días, transfiera el contenido de cada pocillo a un tubo de 1,5 ml.
  5. Centrifugar los tubos a 120 x g durante 8 min para separar las células del medio de cultivo que contiene el virus. Someter los pellets celulares, así como los sobrenadantes, a la extracción de ADN seguida de la cuantificación por PCR en tiempo real para verificar la presencia de genomas virales en cada fracción, evaluando así la infectividad de las partículas virales.

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Resultados

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El objetivo de este procedimiento es aislar las partículas de VEB en una suspensión con título viral conocido, que posteriormente podría usarse para modelar la infección por VEB. Por lo tanto, es de suma importancia utilizar concentraciones óptimas de los diferentes reactivos para obtener el mayor rendimiento de EBV del procedimiento.

Se realizó un ensayo de optimización para determinar las concentraciones de PMA y DMSO que producirían el mayor número de partículas de EBV (

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La producción de partículas de VEB es necesaria para comprender la biología de este virus, así como sus enfermedades asociadas. Aquí describimos la producción de estas partículas a partir de la línea celular P3HR-1. Esta línea celular no es la única línea productora de VEB; de hecho, las partículas de EBV también se han aislado de las células B95-821,22, así como de la línea celular Raji18,19. El ciclo l...

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Divulgaciones

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Los autores declaran no tener conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación para este trabajo fue apoyada por subvenciones a ER del Fondo de Investigación Asmar, el Consejo Nacional Libanés de Investigación Científica (L-CNRS) y el Plan de Práctica Médica (MPP) de la Universidad Americana de Beirut.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mL ThermoScientificAB0620Deben esterilizarse en autoclave antes de su uso
0,2-10 y micro; L Puntas de filtro de microvolumenCorning4807Debe esterilizarse en autoclave antes
de usar 0.5-10 y micro; L PipetaBrandTech704770
10 mL Pipeta Serológica DesechableCorning4488
1000 µ L Puntas de pipeta filtradasQSPTF-112-1000-Q
100-1000 µ L PipetaEppendorf3123000063
100x20 mm Placas de CutureSarstedt83.1802
10-100 µ L PipetaBrandTech 704774
15 mL Tubos CónicosCorning430791
200 µ L Puntas de pipeta filtradasQSPTF-108-200-Q
20-200 µ L PipetaEppendorf3123000055
50 mL Tubos cónicosCorning430828
CFX96 Termociclador en tiempo real C-1000Bio-Rad184-1000
DMSOAmresco0231
Agua libre de DNasa/RNasaZymo ResearchW1001-1
EBER PrimersMacrogenN/AImprimaciones a medida
Control de ADN EBV (estándares)VircellMBC065
Etanol (grado reactivo de laboratorio)Fischer ChemicalE/0600DF/17
Suero fetal bovinoSigmaF9665
Fresco 21 MicroCentrífugaThermo Scientific10651805
Solución de glucógenoQiagen158930
HemocitómetroBOECOBOE 01
Microscopio de luz invertidaZeissAxiovert 25
iTaq Universal SYBR Green SupermixBio-Rad172-5121
Tubo de microcentrífugaCostar (Corning)3621Debe esterilizarse en autoclave antes
de usar P3HR-1 Cell LineATCCHTB-62
Penicilina-Estreptomicina SoluciónBiowestL0022
FenolVWR20599.297
Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA)Sigma-AldrichP8139
Llenadora de pipetasThermo Scientific9501
Toallitas de precisiónKimtech7552
RPMI-1640 Medio de cultivoSigmaR7388
Centrífuga SL 16RThermo Scientific 75004030
Acetato de sodioRiedel-de Haë n (Honeywell)25022
EspectrofotómeroDeNovixDS-11
Tris-HClSigmaT-3253
Solución azul de tripánSigmaT8154
Incubadora de CO2 con camisa de aguaThermo Scientific4121

Referencias

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