Este protocolo permite el aislamiento de partículas del virus de Epstein-Barr de la línea celular humana P3HR1 al inducir el ciclo lítico viral con forbol 12-miristato 13-acetato. Posteriormente, el ADN se extrae de la preparación viral y se somete a PCR en tiempo real para cuantificar la concentración de partículas virales.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Aislamiento y cuantificación del virus de Epstein-Barr de la línea celular P3HR1
En este artículo
Resumen
Resumen
El virus de Epstein-Barr (EBV), formalmente designado como Herpesvirus humano 4 (HHV-4), es el primer virus tumoral humano aislado. Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por EBV. Con los recientes avances en biología molecular e inmunología, la aplicación de modelos experimentales in vitro e in vivo ha proporcionado una visión profunda y significativa de la patogénesis del VEB en muchas enfermedades, así como de la tumorigénesis asociada al VEB. El objetivo de este trabajo de experimento visualizado es proporcionar una visión general del aislamiento de partículas virales de EBV de células de la línea celular P3HR1, seguido de la cuantificación de la preparación viral. Las células P3HR1, originalmente aisladas de un linfoma de Burkitt humano, pueden producir un virus P3HR1, que es una cepa de EBV tipo 2. El ciclo lítico del VEB puede ser inducido en estas células P3HR1 mediante el tratamiento con forbol 12-miristato 13-acetato (PMA), produciendo partículas virales del VEB.
Utilizando este protocolo para el aislamiento de partículas de EBV, las células P3HR1 se cultivan durante 5 días a 37 °C y 5% deCO2 en medio RPMI-1640 completo que contiene 35 ng / ml PMA. Posteriormente, el medio de cultivo se centrifuga a una velocidad de 120 x g durante 8 min para granular las células. El sobrenadante que contiene el virus se recoge y se hace girar a una velocidad de 16.000 x g durante 90 minutos para granular las partículas de EBV. El pellet viral se resuspende en un medio RPMI-1640 completo. Esto es seguido por la extracción de ADN y la PCR cuantitativa en tiempo real para evaluar la concentración de partículas de VEB en la preparación.
Introducción
El virus de Epstein-Barr (VEB) es el primer virus tumoral humano que se ha aislado1. EBV, formalmente conocido como Herpesvirus humano 4 (HHV-4) 2, es parte de la subfamilia de virus del herpes gamma de la familia de virus del herpes y es el prototipo del género Lymphocryptovirus . Casi el 90-95% de la población adulta del mundo está infectada por el virus3. En la mayoría de los casos, la infección inicial ocurre dentro de los primeros 3 años de vida y es asintomática, sin embargo, si la infección ocurre más tarde durante la adolescencia, puede dar lugar a una enfermedad denomina....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
NOTA: El VEB debe considerarse un material potencialmente peligroso para el uso biológico y, por lo tanto, debe manejarse bajo contención de nivel 2 de bioseguridad o superior. Se debe usar una bata de laboratorio y guantes. Si existe la posibilidad de exposición a salpicaduras, también se debe considerar la protección ocular. El siguiente procedimiento debe llevarse a cabo en un gabinete de seguridad biológica.
1. Contando las celdas P3HR1
- Centrifugación y resuspensión de células
- Transfiera la suspensión celular de una placa de cultivo de 100 mm (o matraz T-25) de un cultivo celular P3HR1 en curso con una ....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
El objetivo de este procedimiento es aislar las partículas de VEB en una suspensión con título viral conocido, que posteriormente podría usarse para modelar la infección por VEB. Por lo tanto, es de suma importancia utilizar concentraciones óptimas de los diferentes reactivos para obtener el mayor rendimiento de EBV del procedimiento.
Se realizó un ensayo de optimización para determinar las concentraciones de PMA y DMSO que producirían el mayor número de partículas de EBV (
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
La producción de partículas de VEB es necesaria para comprender la biología de este virus, así como sus enfermedades asociadas. Aquí describimos la producción de estas partículas a partir de la línea celular P3HR-1. Esta línea celular no es la única línea productora de VEB; de hecho, las partículas de EBV también se han aislado de las células B95-821,22, así como de la línea celular Raji18,19. El ciclo l.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses.
Agradecimientos
La financiación para este trabajo fue apoyada por subvenciones a ER del Fondo de Investigación Asmar, el Consejo Nacional Libanés de Investigación Científica (L-CNRS) y el Plan de Práctica Médica (MPP) de la Universidad Americana de Beirut.
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de pared delgada de 0,2 mL Thermo | Scientific | AB0620 | Deben esterilizarse en autoclave antes de su uso |
| 0,2-10 y micro; L Puntas de filtro de microvolumen | Corning | 4807 | Debe esterilizarse en autoclave antes |
| de usar 0.5-10 y micro; L Pipeta | BrandTech | 704770 | |
| 10 mL Pipeta Serológica Desechable | Corning | 4488 | |
| 1000 µ L Puntas de pipeta filtradas | QSP | TF-112-1000-Q | |
| 100-1000 µ L Pipeta | Eppendorf | 3123000063 | |
| 100x20 mm Placas de Cuture | Sarstedt | 83.1802 | |
| 10-100 µ L Pipeta | BrandTech 704774 | ||
| 15 mL Tubos Cónicos | Corning | 430791 | |
| 200 µ L Puntas de pipeta filtradas | QSP | TF-108-200-Q | |
| 20-200 µ L Pipeta | Eppendorf | 3123000055 | |
| 50 mL Tubos cónicos | Corning | 430828 | |
| CFX96 Termociclador en tiempo real C-1000 | Bio-Rad | 184-1000 | |
| DMSO | Amresco | 0231 | |
| Agua libre de DNasa/RNasa | Zymo Research | W1001-1 | |
| EBER Primers | Macrogen | N/A | Imprimaciones a medida |
| Control de ADN EBV (estándares) | Vircell | MBC065 | |
| Etanol (grado reactivo de laboratorio) | Fischer Chemical | E/0600DF/17 | |
| Suero fetal bovino | Sigma | F9665 | |
| Fresco 21 MicroCentrífuga | Thermo Scientific | 10651805 | |
| Solución de glucógeno | Qiagen | 158930 | |
| Hemocitómetro | BOECO | BOE 01 | |
| Microscopio de luz invertida | Zeiss | Axiovert 25 | |
| iTaq Universal SYBR Green Supermix | Bio-Rad | 172-5121 | |
| Tubo de microcentrífuga | Costar (Corning) | 3621 | Debe esterilizarse en autoclave antes |
| de usar P3HR-1 Cell Line | ATCC | HTB-62 | |
| Penicilina-Estreptomicina Solución | Biowest | L0022 | |
| Fenol | VWR | 20599.297 | |
| Forbol 12-miristato 13-acetato (PMA) | Sigma-Aldrich | P8139 | |
| Llenadora de pipetas | Thermo Scientific | 9501 | |
| Toallitas de precisión | Kimtech | 7552 | |
| RPMI-1640 Medio de cultivo | Sigma | R7388 | |
| Centrífuga SL 16R | Thermo Scientific 75004030 | ||
| Acetato de sodio | Riedel-de Haë n (Honeywell) | 25022 | |
| Espectrofotómero | DeNovix | DS-11 | |
| Tris-HCl | Sigma | T-3253 | |
| Solución azul de tripán | Sigma | T8154 | |
| Incubadora de CO2 con camisa de agua | Thermo Scientific | 4121 |
Referencias
- Epstein, M. A., Achong, B. G., Barr, Y. M. Virus particles in cultured lymphoblasts from Burkitt's lymphoma. Lancet. 1 (7335), 702-703 (1964).
- Sample, J., et al. Epstein-Barr virus types 1 and 2 differ in their EBNA-3A, EBNA-3B, and EBNA-3C genes. <....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
