El presente protocolo describe el diseño, fabricación y caracterización de un sistema microfluídico capaz de alinear, inmovilizar y comprimir con precisión cientos de embriones de Drosophila melanogaster con una intervención mínima del usuario. Este sistema permite obtener imágenes de alta resolución y recuperar muestras para el análisis posterior a la estimulación y se puede escalar para adaptarse a otros sistemas biológicos multicelulares.
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Artículo de método
Mecanoestimulación de organismos multicelulares mediante un sistema de compresión microfluídica de alto rendimiento
En este artículo
Resumen
Resumen
Durante la embriogénesis, el movimiento celular coordinado genera fuerzas mecánicas que regulan la expresión y la actividad génica. Para estudiar este proceso, se han utilizado herramientas como la aspiración o la compresión de cubreobjetos para estimular mecánicamente embriones enteros. Estos enfoques limitan el diseño experimental, ya que son imprecisos, requieren manipulación manual y pueden procesar solo un par de embriones simultáneamente. Los sistemas microfluídicos tienen un gran potencial para automatizar tales tareas experimentales al tiempo que aumentan el rendimiento y la precisión. Este artículo describe un sistema microfluídico desarrollado para comprimir con precisión embriones enteros de Drosophila melanogaster (mosca de la fruta). Este sistema cuenta con microcanales con paredes laterales deformables accionadas neumáticamente y permite la alineación del embrión, la inmovilización, la compresión y la recolección posterior a la estimulación. Al paralelizar estos microcanales en siete carriles, se pueden aplicar patrones de compresión constantes o dinámicos a cientos de embriones de Drosophila simultáneamente. La fabricación de este sistema en un cubreobjetos de vidrio facilita la estimulación mecánica simultánea y la obtención de imágenes de muestras con microscopios de alta resolución. Además, la utilización de materiales biocompatibles, como PDMS, y la capacidad de fluir fluido a través del sistema hacen que este dispositivo sea capaz de experimentos a largo plazo con muestras dependientes de medios. Este enfoque también elimina el requisito de montaje manual que estresa mecánicamente las muestras. Además, la capacidad de recoger rápidamente muestras de los microcanales permite análisis posteriores a la estimulación, incluidos los ensayos -ómicos que requieren grandes números de muestra inalcanzables utilizando los enfoques tradicionales de estimulación mecánica. La geometría de este sistema es fácilmente escalable a diferentes sistemas biológicos, lo que permite que numerosos campos se beneficien de las características funcionales descritas en este documento, incluido el alto rendimiento de la muestra, la estimulación mecánica o la inmovilización y la alineación automatizada.
Introducción
Los sistemas vivos experimentan y responden constantemente a diversas entradas mecánicas a lo largo de su vida útil1. La mecanotransducción se ha relacionado con muchas enfermedades, incluyendo trastornos del desarrollo, pérdida muscular y ósea, y neuropatologías a través de vías de señalización directa o indirectamente afectadas por el ambiente mecánico2. Sin embargo, los genes y proteínas que están regulados por la estimulación mecánica3 en las vías de señalización mecanosensibles4 permanecen en gran parte desconocidos5, impidiendo la elucidación d....
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Protocolo
1. Preparación del molde de oblea de silicio
- Limpie la oblea de silicio (consulte la Tabla de materiales) primero con acetona y luego con alcohol isopropílico (IPA).
- Coloque la oblea de silicio en una placa caliente a 250 °C durante 30 minutos para la deshidratación (Figura 3A).
- Cubra la oblea de silicio con hexametildisilazano (HDMS) en un horno de vapor principal (consulte la Tabla de materiales) (temperatura de proceso: 150 °C, presión de proceso: 2 Torr, tiempo de proceso: 5 min, volumen de HDMS: 5 μL) (Figura 3B).
- ....
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Resultados
El sistema microfluídico se divide en dos subcompartimentos separados por paredes laterales PDMS deformables. El primer compartimento es el sistema líquido donde se introducen los embriones de Drosophila , se alinean, alinean y comprimen automáticamente. El segundo compartimento es un sistema de gas donde la presión del gas a ambos lados de los canales de compresión se controla a través de microcanales sin salida para controlar con precisión el ancho efectivo de los canales de compresión. El dispositivo.......
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Discusión
El artículo describe el desarrollo de un dispositivo microfluídico para alinear, inmovilizar y aplicar con precisión estimulación mecánica automáticamente a cientos de embriones completos de Drosophila . La integración del sistema microfluídico con un delgado cubreobjetos de vidrio permitió obtener imágenes de embriones con microscopía confocal de alta resolución durante la estimulación. El dispositivo microfluídico también permitió la recolección de los embriones justo después de la estimulación para ejecutar e.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen intereses financieros en los productos descritos en este manuscrito y no tienen nada más que revelar.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias (CMMI-1946456), la Oficina de Investigación Científica de la Fuerza Aérea (FA9550-18-1-0262) y el Instituto Nacional de Salud (R01AG06100501A1; R21AR08105201A1).
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 100 mL vasos de precipitados de plástico perforado de tres esquinas con placas de Petri de 60 mm | Fisher | 14-955-111B | Cafetero con orificios de aire |
| 100 mm P B < 100> 0-100 500um SSP Grado de prueba Oblea | Si Oblea Universitaria | 452 | |
| Punzones de biopsia | Ted Pella | 15110 | |
| Lejía | No específica | ||
| Juego de agujas romas | CML Supply | 901 | |
| Alineador de máscara de contacto | Quintel | Q4000 MA | |
| Tapete de corte | Dahle | Vantage 10670 | tamaño: 24" x 36" |
| Revelador | Kayaku Advance Materials | SU-8 2000 | |
| Escritura directa Litógrafo | Heidelberg | MLA100 | |
| Microscopio | disección Cualquier microscopio de disección disponible con luz transmitida | ||
| Placa de Petri | de vidrio Fisher | FB0875713A | |
| Portaobjetos de vidrio | Warner Instruments | 64-0710 (CS-24/60) | |
| Horno HMDS Vapor Prime Sí | Ingeniería | YES-3TA | |
| NaCl | No es específico de la marca | ||
| Horno | Labnet | I5110A | |
| la marca | |||
| Limpiador de plasma | Harrick Plasma | PDC-32G | |
| Fuente de presión portátil | hygger Silencioso | HGD946 | |
| Cole-Parmer | EW-68950-25 | Barnizador | |
| centrifugado | Laurell | WS-650-8B | |
| Tricloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silano (PFOCTS) | Sigma-Aldrich | 448931-10G | |
| Triton-X 100 | Fisher | AAA16046AP | |
| Tubing | Saint-Gobain | 02-587-1A | |
| Limpiador ultrasónico | Cole-Parmer | UX-08895-05 | |
| Bomba de vacío | Cole-Parmer | EW-07164-87 |
Referencias
- Wang, J. H. -C., Thampatty, B. P. An introductory review of cell mechanobiology. Biomechanics and Modeling in Mechanobiology. 5 (1), 1-16 (2006).
- Ingber, D. Mechanobiology and diseases of mechanotransduction. Annals of Medicine. 35 (8), 564-577 (2003).
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Reimpresiones y permisos
