Este protocolo describe un método integral para evaluar la activación de caspasas (caspasa-1, caspasa-3, caspasa-7, caspasa-8, caspasa-9 y caspasa-11) en respuesta a modelos de infección, insultos estériles y cáncer tanto in vitro como in vivo (en ratones) para determinar el inicio de vías de muerte celular, como piroptosis, apoptosis, necroptosis y PANoptosis.
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Artículo de método
Evaluación de la activación de la caspasa para evaluar la muerte celular inmune innata
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunidad innata proporciona la primera línea crítica de defensa en respuesta a patógenos e insultos estériles. Un componente mecanicista clave de esta respuesta es el inicio de la muerte celular programada inmune innata (PCD) para eliminar las células infectadas o dañadas y propagar las respuestas inmunes. Sin embargo, el exceso de PCD se asocia con inflamación y patología. Por lo tanto, comprender la activación y regulación de la PCD es un aspecto central de la caracterización de las respuestas inmunes innatas y la identificación de nuevos objetivos terapéuticos en todo el espectro de la enfermedad.
Este protocolo proporciona métodos para caracterizar la activación innata de PCD inmune mediante el monitoreo de caspasas, una familia de proteasas dependientes de cisteína que a menudo se asocian con diversas vías de PCD, incluyendo apoptosis, piroptosis, necroptosis y PANoptosis. Los informes iniciales caracterizaron la caspasa-2, la caspasa-8, la caspasa-9 y la caspasa-10 como caspasas iniciadoras y la caspasa-3, caspasa-6 y caspasa-7 como caspasas efectoras en la apoptosis, mientras que estudios posteriores encontraron que las caspasas inflamatorias, caspasa-1, caspasa-4, caspasa-5 y caspasa-11, impulsan la piroptosis. Ahora se sabe que existe una amplia diafonía entre las caspasas y otras moléculas innatas inmunes y de muerte celular a través de las vías de PCD previamente definidas, identificando una brecha de conocimiento clave en la comprensión mecanicista de la inmunidad innata y PCD y conduciendo a la caracterización de PANoptosis. PANoptosis es una vía PCD inflamatoria inmune innata única regulada por complejos PANoptosomas, que integran componentes, incluidas las caspasas, de otras vías de muerte celular.
Aquí, se proporcionan métodos para evaluar la activación de las caspasas en respuesta a diversos estímulos. Estos métodos permiten la caracterización de las vías de PCD tanto in vitro como in vivo, ya que las caspasas activadas experimentan una escisión proteolítica que puede visualizarse mediante western blot utilizando anticuerpos óptimos y condiciones de blotting. Se ha establecido un protocolo y un flujo de trabajo de western blotting que permiten evaluar la activación de múltiples caspasas de la misma población celular, proporcionando una caracterización integral de los procesos de PCD. Este método se puede aplicar en todas las áreas de investigación en desarrollo, homeostasis, infección, inflamación y cáncer para evaluar las vías de PCD a lo largo de los procesos celulares en la salud y la enfermedad.
Introducción
El sistema inmune innato actúa como la primera línea de defensa durante la infección y en respuesta a estímulos estériles, como lesiones tisulares y alteraciones en la homeostasis. Los sensores inmunes innatos en la superficie celular y en el citoplasma responden a patrones moleculares asociados a patógenos o daños (PAMP o DAMP, respectivamente) para desencadenar vías de señalización inflamatoria y respuestas celulares. Uno de los procesos clave de la respuesta inmune innata es la inducción de la muerte celular para eliminar las células infectadas o dañadas e impulsar más respuestas inmunes innatas y adaptativas. La muerte celular programada (PCD) es un proceso altame....
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Protocolo
El uso y los procedimientos de los animales fueron aprobados por el Comité de Uso y Cuidado de Animales del St. Jude Children's Research Hospital.
1. Preparación de las soluciones
- Prepare los medios acondicionados para L929.
- Placa 1 × 106 células L929 (ver Tabla de materiales) en un matraz de cultivo de tejidos de 182cm2 que contiene 50 ml de medios de cultivo L929 (ver Tabla 1 para la preparación del medio).
- Cultivar las células en una incubadora humidificada a 37 °C con 5% deCO2.
- Después de 7 días, recoja el sobrenada....
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Resultados
La PANoptosis se ha observado en respuesta a numerosas infecciones bacterianas, virales y fúngicas y otros estímulos inflamatorios, así como en células cancerosas 44,48,49,50,51,52,53,54,56,57,58,60,61,62
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Discusión
El monitoreo de la escisión y activación de la caspasa proporciona una de las imágenes más completas de la activación innata de PCD inmune como parte de la respuesta inmune innata. El protocolo descrito aquí demuestra una estrategia para monitorizar la activación de caspasas en respuesta a infecciones por IAV, HSV1 y F. novicida y el desencadenante estéril LPS+ATP, pero muchos otros estímulos pueden inducir PCD y podrían ser utilizados en este método, como se ha demostrado en varias publicaciones 44,48,49,50,51,.......
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Divulgaciones
T.-D.K. es consultor de Pfizer.
Agradecimientos
Agradecemos a los miembros del laboratorio de Kanneganti por sus comentarios y sugerencias, y agradecemos a J. Gullett, PhD, por el apoyo de edición científica. El trabajo en nuestro laboratorio está respaldado por las subvenciones AI101935, AI124346, AI160179, AR056296 y CA253095 (a T.-D.K.) y por las Caridades Asociadas Libanesas Sirias Americanas (a T.-D.K.). El contenido es responsabilidad exclusiva de los autores y no representa necesariamente los puntos de vista oficiales de los Institutos Nacionales de Salud.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 0,45 μ m filter | Millipore | SCHVU05RE | |
| jeringa de 10 mL | BD Biosciences | 309604 | |
| gel de poliacrilamida al 12% con 10 pocillos | Bio-Rad | 4561043 | |
| placa de 12 pocillos | Corning | 07-200-82 | |
| aguja de 18 G | BD Biosciences | 305195 | |
| aguja de 25 G | BD Biosciences | 305122 | |
| tubo de 50 mL | Fisher Scientific | 50-809-218 | |
| 70 μ Filtro de células M | Corning | 431751 | |
| placas de cultivo de tejidos de 150 mm | Corning | 430597 | |
| matraz de cultivo de tejidos de 182 cm2 | Genesee Scientific | 25-211 | |
| Accesorio bandeja trans blanca | Cytiva | 29-0834-18 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-1 | AdipoGen | AG-20B-0042-C100 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-11 | Novus Biologicals | NB120-10454 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-3 | Tecnología de señalización celular | 9662 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-7 | Tecnología de señalización celular | 9492 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-8 | Tecnología de señalización celular | 4927 | |
| Anti– anticuerpo caspasa-9 | Tecnología de señalización celular | 9504 | |
| Anti– anticuerpo de caspasa-3 escindido | Tecnología de señalización celular | 9661 | |
| anti– anticuerpo caspasa-7 escindido | Tecnología de señalización celular | 9491 | |
| anti– anticuerpo caspasa-8 escindido | Tecnología de señalización celular | 8592 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP de ratón | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 315-035-047 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-conejo | Jackson ImmunoResearch Laboratories | 111-035-047 | |
| Anticuerpo secundario conjugado con HRP anti-rata | Laboratorios de Investigación Inmunológica Jackson | 112-035-003 | |
| Anti– β-Anticuerpo de actina (C4) HRP | Santa Cruz | sc-47778 HRP | |
| ATP | InvivoGen | tlrl-atpl | |
| BBL Tripticasa Caldo de soja | BD Biosciences | 211768 | |
| Bead | Chemglass Life Sciences | CLS-4598-009 | |
| Biofotómetro D30 | Eppendorf | 6133000010 | |
| BME | Sigma | M6250 | |
| Azul de bromofenol | Sigma | BO126 | |
| Raspadores de células | CellTreat Scientific Products | 229315 | |
| Generador de imágenes de quimioluminiscencia (Amersham 600) | Cytiva | 29083461 | |
| CO2 cámara | VetEquip | 901703 | |
| Cubetas | Fisher Scientific | 14-955-129 | |
| Tijeras de disección | Thermo Fisher Scientific | 221S | |
| DMEM | Thermo Fisher Scientific | 11995-073 | |
| DTT | Sigma | 43815 | |
| Aparato de eelectroforesis | Bio-Rad | 1658004 | |
| Ethanol | Pharmco 111000200 | ||
| Suero fetal bovino | Biowest | S1620 | |
| Papel de filtro | Bio-Rad | de 1703965 | |
| Fisher Scientific | 22-327379 | ||
| Francisella novicida (cepa U112) | BEI Resources | NR-13 | |
| Liberador de gel | Bio-Rad | 1653320 | |
| Gentamicina | Gibco 15750060 | ||
| Glicerol | Sigma | G7893 | |
| Glicina | Sigma | G8898 | |
| HCl | Sigma | H9892 | |
| Bloque de calor | Fisher Scientific | 23-043-160 | |
| Virus del herpes simple 1 (cepa HF) | ATCC | VR-260 | |
| Glucosa alta DMEM | Sigma | D6171 | |
| Anti&ndash humano; anticuerpo caspasa-1 | R& D Sistemas | MAB6215 | |
| anti&ndash humano anticuerpo caspasa-8 | Enzo | ALX-804-242 | |
| Incubadora humidificada | Thermo Fisher Scientific | 51026282 | |
| Software de análisis de imágenes | ImageJ | v1.53a | |
| IMDM | Thermo Fisher Scientific | 12440-053 | |
| Virus de la influenza A (A/Puerto Rico/8/34, H1N1 [PR8]) | construido por Hoffmann et al. | ||
| Células L929 | ATCC | Línea celular CCL-1 | para la creación de L-cisteína de medios condicionados L929 |
| Thermo Fisher Scientific | BP376-100 | ||
| Luminata Forte Sustrato HRP occidental | Millipore | WBLUF0500 | sustrato HRP de sensibilidad estándar |
| Celdas MDCK Línea | ATCC | CCL-34 | para determinar el título viral de IAV |
| Microcentrífuga de metanol | Sigma | 322415 | |
| Thermo | Fisher Scientific | 75002401 | |
| Aminoácidos no esenciales | Gibco | 11140050 | |
| Leche en polvo descremada | Kroger | ||
| NP-40 solución | Sigma | 492016 | |
| PBS | Thermo Fisher Scientific | 10010023 | |
| Penicilina y estreptomicina | Sigma | P4333 | |
| Placa de Petri | Fisher Scientific | 07-202-011 | |
| PhosSTOP | Roche | PHOSS-RO | |
| Fuente de alimentación | Bio-Rad | 164-5052 | |
| Comprimido inhibidor de la proteasa | Sigma | S8820 | |
| Membrana de PVDF | Millipore | IPVH00010 | |
| Agitador oscilante | Labnet | S2035-E | |
| SDS | Sigma | L3771 | |
| Cloruro de sodio | Sigma | S9888 | |
| Desoxicolato de sodio | Sigma | 30970 | |
| Hidróxido de sodio | Sigma | 72068 | |
| Piruvato de sodio | Gibco | 11360-070 | |
| Placa de Petri cuadrada | Fisher Scientific | FB0875711A | |
| Tampón de extracción | Thermo Fisher Scientific | 21059 | |
| Super Signal Femto Sustrato HRP | Thermo Fisher Scientific | 34580 | de alta sensibilidad |
| Centrífuga de sobremesa | Thermo Fisher Scientific | 75004524 | |
| Sistema semiseco Trans-Blot | Bio-Rad | 170-3940 | |
| Tris | Sigma | TRIS-RO | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | |
| Lipopolisacárido ultrapuro (LPS) de E. coli 0111:B4 | InvivoGen | tlrl-3pelps | |
| Línea | Vero ATCC | CCL-81 | para determinar el título viral de HSV1 |
Referencias
- Alnemri, E. S., et al. Human ICE/CED-3 protease nomenclature. Cell. 87 (2), 171(1996).
- Man, S. M., Kanneganti, T. D. Converging roles of caspases in inflammasome activation, cell death and innate immunity. Nature Reviews Immunology. 16 (1), 7-21....
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Reimpresiones y permisos
