El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.
Artículo de método
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El presente protocolo describe un procedimiento de radiología intervencionista establecido para la inyección intratímica en ratones para evitar el riesgo de cirugía abierta y mejorar la precisión de las inyecciones percutáneas ciegas.
La inyección intratímica en modelos de ratón es una técnica importante para estudiar la función tímica e inmune, incluidos los trastornos genéticos y adquiridos de células T. Esto requiere métodos para la deposición directa de reactivos y / o células en el timo de ratones vivos. Los métodos tradicionales de inyección intratímica incluyen cirugía torácica o inyecciones percutáneas ciegas mínimamente invasivas, las cuales tienen limitaciones significativas. Los dispositivos de imágenes de ultrasonido de frecuencia ultra alta han hecho posibles las inyecciones percutáneas guiadas por imágenes en ratones, mejorando en gran medida la precisión de la inyección del enfoque de inyección percutánea y permitiendo la inyección de objetivos más pequeños. Sin embargo, las inyecciones guiadas por imágenes dependen de la utilización de un sistema ferroviario integrado, lo que lo convierte en un procedimiento rígido y lento. Aquí se presenta un método único, seguro y eficiente para inyecciones intratímicas percutáneas en ratones, eliminando la dependencia del sistema de rieles para las inyecciones. La técnica se basa en el uso de una unidad de micro-ultrasonido de alta resolución para obtener imágenes del timo del ratón de forma no invasiva. Usando una técnica de mano alzada, un radiólogo puede colocar una punta de aguja directamente en el timo del ratón bajo guía ecográfica. Los ratones se limpian y anestesian antes de la obtención de imágenes. Para un radiólogo experimentado experto en procedimientos guiados por ultrasonido, el período de aprendizaje para la técnica indicada es bastante corto, generalmente dentro de una sesión. El método tiene una baja tasa de morbilidad y mortalidad para los ratones y es mucho más rápido que las técnicas actuales asistidas mecánicamente para la inyección percutánea. Permite al investigador realizar de manera eficiente inyecciones percutáneas precisas y confiables de timos de cualquier tamaño (incluidos órganos muy pequeños como el timo de ratones envejecidos o inmunodeficientes) con un estrés mínimo en el animal. Este método permite la inyección de lóbulos individuales si se desea y facilita experimentos a gran escala debido a la naturaleza de ahorro de tiempo del procedimiento.
El timo tiene un papel esencial en el desarrollo de las células T y la inmunidad. La deficiencia de células T, que puede ser causada por la involución tímica, trastornos genéticos, infecciones y tratamientos contra el cáncer, entre otros factores, conduce a una alta mortalidad y morbilidad 1,2. Los modelos de ratón son indispensables en la investigación de inmunología básica y traslacional y se han utilizado durante décadas para estudiar la biología tímica y el desarrollo de células T, así como para desarrollar tratamientos para aquellos que sufren de disfunción tímica y deficiencia de células T
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Todos los procedimientos se realizaron de acuerdo con las pautas de cuidado animal en el Centro para el Descubrimiento y la Innovación (protocolo IACUC 290). Para el presente estudio, ratones C57BL/6 (hembra, 4-6 semanas de edad), ratones C57BL/6 (hembra, 6 meses de edad), ratones hembra J:NU, ratones hembra NOD scid gamma (NSG) y B6; Se utilizaron ratones CAG-luc, -GFP como modelo de ratón joven, modelo de ratón envejecido, modelo de desnudo atímico, modelo inmunodeficiente y fuente de células de bioluminiscencia, respectivamente. Los ratones se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de materiales). Este procedimiento generalmente requerirá do....
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La implementación exitosa de esta técnica se basa en algunos pasos clave a seguir. En primer lugar, se debe garantizar una identificación fiable de la propia glándula del timo. En ratones jóvenes, esto es sencillo debido al gran tamaño de la glándula (Figura 3A). En ratones más viejos o ratones inmunodeficientes, puede ser más desafiante; sin embargo, todavía es muy factible con equipos de ultrasonido modernos (Figura 3B, C). En segundo lugar, e.......
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Una inyección a mano alzada guiada por ultrasonido es una técnica altamente precisa para administrar materiales de estudio al timo de una manera eficiente y aséptica. Después de la esterilización inicial de la piel en el lugar de la inyección, la esterilidad se mantiene durante el procedimiento debido al uso de guantes estériles, cubiertas de sonda de ultrasonido estériles y gel de ultrasonido estéril. En contraste con el abordaje percutáneo ciego 10,17 o confiando en incisiones quirúrgicas para la visualización directa .......
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Los autores no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.
Nos gustaría agradecer a Raymond H. Thornton por su perspicaz y completo trabajo inicial sobre esta técnica. Este estudio fue financiado por subvenciones del Instituto Nacional del Cáncer (NCI 1R37CA250661-01A1), la Asociación de Investigación de Leucemia Infantil, la Escuela de Medicina Hackensack Meridian y la Fundación HUMC / Tackle Kids Cancer.
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| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Aquasonic 100 Gel de ultrasonido | Parker Laboratories (Fairfield, NJ, EE. UU.) | 01-01 | Gel de transmisión de ultrasonido estéril |
| B6; CAG-luc, -GFP | ratón The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) | 025854 | Fuente de células de bioluminiscencia |
| Jeringas de insulina BD con aguja | Becton Dickinson (Franklin Lakes, NJ, EE. UU.) | 328431 | Aguja ultrafina - 12,7 mm, 30 G |
| Ratón C57BL/6 - envejecido | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) | 000664 | 6 meses de edad; Ratón C57BL/6 modelo envejecido |
| joven | The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) | 000664 | de 4 a 6 semanas; modelo joven |
| Chloraprep One-step 0.67 mL | CareFusion (El Paso, TX, EE. UU.) | 260449 | aplicador de gluconato de clorhexidina |
| Curity Cotton Aplicador con punta de algodón Cardinal | Health (Dublín, OH, EE. UU.) | A5000-2 | Estéril, 6" |
| D-Luciferina | Gold Biotechnology (St Louis, MO, EE. UU.) | LUCK-1G | |
| Isoflurano | Henry Schein (Melville, NY, EE. UU.) | 1182097 | |
| IVIS Lumina X5 | PerkinElmer (Melville, NY, EE. UU.) | N/A | Sistema de imagen de bioluminiscencia in vivo |
| J:NU | ratón The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) | 007850 | Modelo de desnudo atímico |
| Kendall Cinta de papel hipoalergénica | Cardinal Health (Dublín, OH, EE. UU. | )1914C | |
| Kimtech Guantes quirúrgicos de nitrilo | Kimberly-Clark Professional (Irving, TX, EE. UU.) | 56892 | Guantes estériles |
| Nair Loción removedora de vello | Church and Dwight (Trenton, NJ, EE. UU.) | N/A | Agente depilatorio |
| NOD scid gamma (NSG) | ratón The Jackson Laboratory (Bar Harbor, ME, EE. UU.) | 005557 | Modelo inmunodeficiente |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS), 1x | Corning (Corning, NY, EE. UU.) | 21-040- | |
| Puralube Vet Ointment | Med Vet International | PH-PURALUBE-VET | Vainas de ungüento ocular |
| Sheathing Technologies (Morgan Hill, CA, EE. UU.) | 10040 | Cubiertas de sonda de ultrasonido estériles | |
| Cámara de inducción Sure-Seal | Braintree Scientific (Braintree, MA, EE. UU.) | EZ-17 85 | Cámara de inducción de anestesia |
| Transductor MX550D | FUJIFILM VisualSonics ( Toronto, ON, Canadá) | n/a | Sonda de imagen Vevo 3100 (25-55 MHz, transmisión central: 40 MHz) |
| Azul de tripano, solución al 0,4% en PBS | MP Biomedicals (Solon, OH, EE. UU.) | 91691049 | |
| Sistema de imagen Vevo 3100 | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canadá) | n/a | Sistema de imágenes por ultrasonido |
| Vevo 3100 Lab Software | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canadá) | n/a | Versión 3.2.7 para imágenes y análisis |
| Vevo Compact Dual Anesthesia System | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canadá) | n/a | Unidad de anestesia de sobremesa basada en isoflurano |
| Vevo Imaging Station | FUJIFILM VisualSonics (Toronto, ON, Canadá) | n/a | Plataforma de procedimientos |
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