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Neuroscience

Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità

Published: August 23, 2022 doi: 10.3791/64313
Automatic Translation
1, 1,2
1State Key Laboratory of Quality Research in Chinese Medicine and Institute of Chinese Medical Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade, 2Department of Pharmaceutical Sciences, Faculty of Health Sciences, University of Macau, Avenida da Universidade

Summary

Questo protocollo dimostra la microiniezione di lipopolisaccaride nella regione ventricolare del cervello in un modello larvale di zebrafish per studiare la risposta neuroinfiammatoria risultante e la neurotossicità.

Abstract

La neuroinfiammazione è un attore chiave in vari disturbi neurologici, comprese le malattie neurodegenerative. Pertanto, è di grande interesse ricercare e sviluppare modelli alternativi di neuroinfiammazione in vivo per comprendere il ruolo della neuroinfiammazione nella neurodegenerazione. In questo studio, è stato sviluppato e convalidato un modello larvale di zebrafish di neuroinfiammazione mediata da microiniezione ventricolare di lipopolisaccaride (LPS) per indurre una risposta immunitaria e neurotossicità. Le linee transgeniche di zebrafish elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state utilizzate per la quantificazione in tempo reale della vitalità dei neuroni cerebrali mediante imaging live a fluorescenza integrato con l'analisi dell'intensità di fluorescenza. Il comportamento locomotore delle larve di zebrafish è stato registrato automaticamente utilizzando un registratore di tracciamento video. Il contenuto di ossido nitrico (NO) e i livelli di espressione dell'mRNA delle citochine infiammatorie tra cui l'interleuchina-6 (IL-6), l'interleuchina-1β (IL-1β) e il fattore di necrosi tumorale umano α (TNF-α) sono stati studiati per valutare la risposta immunitaria indotta da LPS nella testa larvale del pesce zebra. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale di LPS, sono stati osservati perdita di neuroni e deficit di locomozione nelle larve di zebrafish. Inoltre, la neuroinfiammazione indotta da LPS ha aumentato il rilascio di NO e l'espressione di mRNA di IL-6, IL-1β e TNF-α nella testa delle larve di zebrafish 6 giorni dopo la fecondazione (DPF) e ha portato al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra. In questo studio, l'iniezione di zebrafish con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml a 5 dpf è stata determinata come condizione ottimale per questo test farmacologico di neuroinfiammazione. Questo protocollo presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per la microiniezione di LPS nel ventricolo cerebrale per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS in una larva di zebrafish, che è utile per studiare la neuroinfiammazione e potrebbe anche essere utilizzata come test di screening farmacologico in vivo ad alto rendimento.

Introduction

La neuroinfiammazione è stata descritta come un fattore antineurogeno cruciale coinvolto nella patogenesi di diverse malattie neurodegenerative del sistema nervoso centrale (SNC)1. A seguito di insulti patologici, la neuroinfiammazione può provocare varie conseguenze avverse, tra cui l'inibizione della neurogenesi e l'induzione della morte delle cellule neuronali 2,3. Nel processo alla base della risposta all'induzione dell'infiammazione, citochine infiammatorie multiple (come TNF-α, IL-1β e IL-6) sono secrete nello spazio extracellulare e agiscono come componenti cruciali nella morte neuronale e nella soppressione della neurogenesi 4,5,6.

La microiniezione di mediatori dell'infiammazione (come IL-1β, L-arginina ed endotossine) nel cervello può causare riduzione delle cellule neuronali e neuroinfiammazione 7,8,9. Il lipopolisaccaride (LPS, Figura 1), un'endotossina patogena presente nella parete cellulare dei batteri Gram-negativi, può indurre neuroinfiammazione, esacerbare la neurodegenerazione e ridurre la neurogenesi negli animali10. L'iniezione di LPS direttamente nel SNC del cervello del topo ha aumentato i livelli di ossido nitrico, citochine pro-infiammatorie e altri regolatori11. Inoltre, l'iniezione stereotassica di LPS nell'ambiente cerebrale locale può indurre un'eccessiva produzione di molecole neurotossiche, con conseguente compromissione della funzione neuronale e successivo sviluppo di malattie neurodegenerative 10,12,13,14,15. Nel campo delle neuroscienze, le osservazioni microscopiche dal vivo e nel tempo dei processi cellulari e biologici negli organismi viventi sono cruciali per comprendere i meccanismi alla base della patogenesi e dell'azione farmacologica16. Tuttavia, l'imaging dal vivo di modelli murini di neuroinfiammazione e neurotossicità è fondamentalmente limitato dalla limitata profondità di penetrazione ottica della microscopia, che preclude l'imaging funzionale e l'osservazione dal vivo dei processi di sviluppo17,18,19. Pertanto, lo sviluppo di modelli alternativi di neuroinfiammazione è di grande interesse per facilitare lo studio dello sviluppo patologico e del meccanismo alla base della neuroinfiammazione e della neurodegenerazione, mediante live imaging.

Il pesce zebra (Danio rerio) è emerso come un modello promettente per studiare la neuroinfiammazione e la neurodegenerazione grazie al suo sistema immunitario innato evolutivamente conservato, alla trasparenza ottica, alle grandi dimensioni della frizione embrionale, alla trattabilità genetica e all'idoneità per l'imaging in vivo 19,20,21,22,23 . I protocolli precedenti hanno iniettato direttamente LPS nel tuorlo e nel ventricolo posteriore del pesce zebra larvale senza valutazione meccanicistica, o semplicemente aggiunto LPS all'acqua del pesce (terreno di coltura) per indurre una risposta immunitaria sistemica letale24,25,26,27. Qui, abbiamo sviluppato un protocollo per la microiniezione di LPS nei ventricoli cerebrali, per innescare una risposta immunitaria innata o neurotossicità nelle larve di zebrafish 5 giorni dopo la fecondazione (DPF). Questa risposta è evidenziata dalla perdita di cellule neuronali, dal deficit del comportamento locomotore, dall'aumento del rilascio di ossido di nitrito, dall'attivazione dell'espressione genica infiammatoria e dal reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra a 24 ore dopo l'iniezione.

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Protocol

Le linee di zebrafish selvatico AB e zebrafish transgenico elavl3:mCherry, ETvmat2:GFP e mpo:EGFP sono state ottenute dall'Istituto di scienze mediche cinesi (ICMS). L'approvazione etica (UMARE-030-2017) per gli esperimenti sugli animali è stata concessa dal Comitato etico per la ricerca sugli animali, Università di Macao, e il protocollo segue le linee guida istituzionali per la cura degli animali.

1. Embrioni di zebrafish e allevamento larvale

  1. Generare embrioni di zebrafish (200-300 embrioni per accoppiamento) mediante accoppiamento naturale a coppie come precedentemente riportato28.
  2. Preparare il brodo medio di acqua d'uovo (E3) (60×) sciogliendo 34,8 g di NaCl, 1,6 g di KCl, 5,8 g di CaCl 2·2H 2 O e 9,78 g di MgCl 2·6H 2 O in ddH 2 O fino ad un volume finale di 2 L e regolare il pH a 7,2 utilizzando NaOH e HCl. Per preparare la concentrazione di lavoro del mezzo E3 (1×), diluire il brodo 60 volte in ddH2O. Conservare a 28,5 °C quando non in uso.
  3. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per trasferire gli embrioni di zebrafish in un piatto contenente terreno E3. Allevare gli embrioni a 28,5 °C in un'incubatrice e monitorarne lo sviluppo e la salute. Rimuovere gli embrioni morti e sostituire quotidianamente il mezzo E3 sporco con il terreno fresco.
  4. Per gli esperimenti di imaging del pesce zebra, utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per raccogliere embrioni post-fecondazione (HPF) 0-2 ore (circa 200 uova) in circa 15 ml di terreno 1× E3 contenente 0,003% di N-feniltiourea (PTU).
    NOTA: PTU può inibire la formazione di melanofori durante l'embriogenesi29. Il trattamento degli embrioni con PTU durante l'embriogenesi può migliorare la rilevazione del segnale in microscopia o l'espressione della fluorescenza30.
  5. Mantenere gli embrioni di zebrafish nelle condizioni di cui sopra fino a quando gli embrioni raggiungono lo stadio larvale di sviluppo desiderato.

2. Preparazione per la microiniezione

  1. Prepararsi per l'iniezione tirando i capillari di vetro usando un estrattore di micropipette (vedere Tabella dei materiali), seguendo il protocollo in cinque fasi per la trazione del tubo capillare di vetro (Tabella 1).
  2. Aprire la punta dell'ago (capillari di vetro a parete sottile [3,5 pollici] con filamento, OD 1,14 mm) alla dimensione appropriata ad angolo usando una pinza (Figura 2A).
  3. Riempire l'ago con 0,1 ml di olio minerale per assicurarsi che non ci siano bolle.
  4. Rimuovere il tappo a vite dell'ago in acciaio dell'apparecchio di microiniezione. Allineare il foro dell'ago di vetro con l'ago in acciaio e quindi serrare il tappo a vite. Montare l'apparecchio di microiniezione con ago caricato in un micromanipolatore (vedere Tabella dei materiali).
  5. Regolare la posizione dell'apparecchio di microiniezione in modo che il micromanipolatore possa spostare in modo flessibile l'apparecchio al microscopio. Scaricare un certo volume di olio di paraffina per far entrare l'ago d'acciaio nel tubo di vetro capillare.
  6. Far cadere la soluzione di iniezione (come 1× PBS o 5 mg/mL LPS) su un vetrino sterilizzato con etanolo al 70% e regolare l'apparecchio di microiniezione in modo che la punta venga inserita nella goccia liquida. Caricare ~2 μL di soluzione iniettabile nell'ago.
  7. Impostare il micromanipolatore (impostazioni di regolazione fine di su, giù, sinistra e destra) in modo che la punta dell'ago dell'apparecchio di microiniezione si trovi nello stesso campo visivo delle larve ad alto ingrandimento (Figura 2B).

3. Montaggio di zebrafish per microiniezioni

NOTA: Lo sviluppo cerebrale del pesce zebra avviene entro 3 dpf e matura a 5 dpf con un sistema nervoso centrale ben sviluppato31,32. Pertanto, le larve di 5 dpf sono già adatte per lo studio del danno neuronale mediato da LPS e delle risposte comportamentali e infiammatorie.

  1. Iniettare le larve di zebrafish entro circa 30 minuti dal raggiungimento dello stadio di interesse, per mantenere la coerenza dei tempi di iniezione.
  2. Per anestetizzare le larve di zebrafish, combinare la tricaina con acqua pulita dell'acquario (concentrazione finale dello 0,02% p/v di tricaina).
  3. Sciogliere una soluzione di agarosio al 2% in ddH2O usando un forno a microonde. Versare l'agarosio fuso in un piatto di plastica. Il piatto in plastica rivestito di agarosio al 2% può essere conservato a 4 °C per un massimo di 2 settimane.
  4. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per trasportare le larve anestetizzate al centro del piatto di plastica rivestito di agarosio al 2%. Orientare le larve montate con il cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago.

4. Iniettare il ventricolo cerebrale

  1. Regolare l'ingrandimento del microscopio in modo che la struttura ventricolare cerebrale del pesce zebra sia chiaramente visualizzata nel campo visivo (Figura 2B).
  2. Posizionare l'ago con attenzione sopra il tectum cerebrale (Figura 2C).
  3. Forare lentamente la pelle del cervello del pesce zebra con la punta dell'ago usando il micromanipolatore.
  4. Premere il pedale per espellere 1 nL di 1x PBS o diverse concentrazioni di LPS (1,0, 2,5 e 5,0 mg/ml) (vedere Tabella dei materiali). Le immagini di iniezione ventricolare di successo in cui il ventricolo cerebrale è stato iniettato con 1 nL di colorante blu Evans all'1% (diluito in PBS) sono mostrate come esempio (Figura 2D). Trasferire le larve al mezzo E3 pulito immediatamente dopo l'iniezione. Dopo 24 ore, raccogliere le larve per l'imaging microscopico, il saggio comportamentale della locomotiva e la determinazione di altri indicatori.

5. Imaging

  1. Preparare una soluzione di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% in mezzo E3 e riscaldarla in un forno a microonde per formare un liquido trasparente.
  2. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica pulita per trasportare le larve su un vetrino e rimuovere quanta più acqua possibile.
  3. Utilizzare una pipetta di trasferimento di plastica per aggiungere una goccia di agarosio a basso punto di fusione all'1,5% alle larve.
    NOTA: Raffreddare l'agarosio a basso punto di fusione nella pipetta per un po 'prima di aggiungere in modo da non ferire le larve.
  4. Utilizzare un ago da siringa da 1 mL per orientare le larve. Attendere che l'agarosio si raffreddi e si solidifichi prima di iniziare l'imaging.
  5. Osservare e fotografare la regione neuronale in tutto il cervello del pesce zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e Tg(elavl3:mCherry), così come il reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra Tg(mpo:EGFP) al microscopio stereoscopico a fluorescenza (vedi Tabella dei materiali).
    NOTA: le impostazioni del microscopio a fluorescenza utilizzate per l'imaging sono mostrate di seguito. Tg(ETvmat2:EGFP) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 450-490 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500-550 nm, ingrandimento visivo: 100x); Tg(elavl3:mCherry) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 541-551 nm, lunghezza d'onda di emissione: 590 nm, ingrandimento visivo: 100x); Tg(mpo:EFGP) cervello di zebrafish (lunghezza d'onda di eccitazione: 450-490 nm, lunghezza d'onda di emissione: 500-550 nm, ingrandimento visivo: 63x).
  6. Misurare e analizzare l'intensità e la lunghezza della fluorescenza della regione del neurone Ra nel pesce zebra Tg(ETvmat2:EGFP) e l'intensità di fluorescenza dei neuroni cerebrali del pesce zebra Tg(elavl3:mCherry) utilizzando il software ImageJ. Contare manualmente i neutrofili nella regione del cervello del pesce zebra Tg (mpo: EFGP).

6. Determinazione dei marcatori di espressione genica

  1. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale LPS, procedere con la determinazione dei marcatori di espressione genica. Per fare ciò, anestetizzare le larve di zebrafish con lo 0,02% di tricaina (come menzionato nel passaggio 3.2).
  2. Utilizzare due siringhe da 1 mL per separare le parti della testa delle larve (40 larve per gruppo) senza le regioni dell'occhio e del sacco vitellino (Figura 2E).
  3. Estrarre l'RNA dalle porzioni larvali della testa.
    1. Per l'estrazione dell'RNA, omogeneizzare la porzione della testa con 200 μL di reagente di estrazione dell'RNA (vedi Tabella dei materiali) usando una smerigliatrice tissutale (vedi Tabella dei materiali) ad una velocità di rotazione di 11.000 giri / min per 5 s.
    2. Eseguire l'estrazione dell'RNA utilizzando il metodo cloroformio-isopropanolo. Per fare ciò, aggiungere 40 μL di cloroformio, agitare vigorosamente i tubi e incubarli a temperatura ambiente per 10 minuti. Centrifugare i campioni a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C.
    3. Trasferire la fase acquosa in un tubo fresco (circa 100 μL) e aggiungere 100 μL di isopropanolo. Incubare per 10 minuti e quindi centrifugare a 12.000 x g per 10 minuti a 4 °C. Rimuovere il surnatante.
    4. Aggiungere 200 μL di etanolo al 75% per lavare il pellet di RNA. Vortice brevemente i campioni e quindi centrifugare a 7500 x g per 5 minuti a 4 °C. Scartare il surnatante e lavare nuovamente il pellet di RNA.
    5. Asciugare all'aria il pellet di RNA per 5-10 minuti, quindi aggiungere 30 μL di acqua priva di RNasi per sciogliere il pellet di RNA. Controllare la purezza (rapporto di assorbanza a 260 nm e 280 nm) e l'integrità dell'RNA utilizzando uno spettrofotometro a microvolume (vedi Tabella dei materiali).
  4. Sintetizzare il cDNA dall'RNA estratto nel passo 6.3, usando la trascrittasi inversa con primer casuali (vedi Tabella dei materiali).
    1. Aggiungere 1 μL di primer casuali, 1 μL di dNTPs, 1 μg di RNA e acqua distillata (volume totale a 12 μL) in una provetta priva di nucleasi. Riscaldare la miscela a 65 °C per 5 minuti e raffreddare rapidamente sul ghiaccio.
    2. Aggiungere 1 μL di 0,1 M DTT, 1 μL di inibitore della RNasi, 4 μL di tampone di primo filamento 5× e 1 μL di trascrittasi inversa M-MLV (volume totale: 20 μL) alla provetta. Mescolare delicatamente e incubare il tubo a 25 °C per 2 minuti, quindi a 42 °C per 50 minuti. Inattivare la reazione riscaldando a 70 °C per 15 minuti.
  5. Eseguire la PCR in tempo reale su un sistema qPCR (vedi Tabella dei materiali) utilizzando un kit RT-qPCR disponibile in commercio (vedi Tabella dei materiali) per determinare l'espressione dei geni bersaglio (IL-1β, IL-6 e TNF-α). La miscela di reazione (20 μL) conteneva 10 μL di verde SYBR, 0,4 μL di colorante di riferimento ROX, 0,8 μL ciascuno degli inneschi diretti e inversi, 6 μL di ddH 2 O e2μL di cDNA modello (1 μg). Eseguire l'amplificazione PCR nelle condizioni: 95 °C per 30 s, seguiti da 40 cicli di 95 °C per 5 s e 60 °C per 34 s, e con uno stadio di dissociazione di 95 °C per 15 s, 60 °C per 60 s e 95 °C per 15 s.
  6. Normalizzare i livelli di mRNA dei geni bersaglio a quelli di un gene housekeeping, fattore di allungamento 1 α (Ef1α). Calcolare i livelli di espressione per ciascun gene bersaglio con il metodo 2−ΔΔCT33. Le sequenze di primer di ciascun gene sono descritte nella Tabella 2.
  7. Per la determinazione dell'ossido nitrico, omogeneizzare la porzione di testa (ottenuta al punto 6.2) in 100 μL di PBS freddo utilizzando una smerigliatrice tissutale. Centrifugare il PBS risultante e la sospensione della porzione di testa a 12.000 x g per 15 minuti a 4 °C. Raccogliere i lisati ed eseguire il saggio di concentrazione di nitriti34 utilizzando un kit disponibile in commercio (vedere la tabella dei materiali).

7. Saggio comportamentale della locomotiva zebrafish

  1. A 24 ore dopo l'iniezione ventricolare cerebrale LPS, trasferire individualmente le larve di zebrafish nei pozzetti di una micropiastra quadrata a 96 pozzetti. Aggiungere 300 μL di terreno E3 a ciascun pozzetto e quindi incubare le larve per 4 ore per acclimatarsi alla piastra di prova.
  2. Trasferire la micropiastra caricata con larve nella scatola di tracciamento del pesce zebra (vedere Tabella dei materiali). Accendere la sorgente luminosa e quindi incubare le larve nella scatola di prova per 30 minuti per acclimatare l'ambiente.
  3. Monitora e registra il comportamento del pesce zebra utilizzando un sistema di tracciamento video automatizzato. Registra 12 sessioni (5 minuti ciascuna, totale 1 ora) per ogni zebrafish. Definisci la distanza totale (costituita da distanze inattive, piccole e grandi) come la distanza (in mm) che ciascun pesce ha spostato durante un periodo di tracciamento di 60 minuti.

8. Analisi statistica

  1. Eseguire analisi statistiche utilizzando software di analisi standard (vedi Tabella dei materiali).
  2. Eseguire analisi statistiche delle differenze tra due gruppi utilizzando ANOVA unidirezionale ordinario. Calcolare il coefficiente di correlazione di Pearson per valutare la forza delle correlazioni. P < 0,05 è stato considerato significativo in tutte le analisi.

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Representative Results

Il flusso di lavoro qui descritto presenta una metodologia nuova, rapida ed efficiente per indurre neuroinfiammazione e neurotossicità mediate da LPS nelle larve di zebrafish. In questo protocollo descritto, 5 dpf zebrafish sono stati iniettati con LPS (Figura 1) nei ventricoli cerebrali utilizzando un microiniettore (Figura 2A-C). L'iniezione riuscita nel sito del ventricolo cerebrale è stata verificata utilizzando la colorazione blu di Evans all'1% (Figura 2D). La testa del pesce zebra è stata separata dagli occhi e dal corpo utilizzando siringhe (Figura 2E) per escludere qualsiasi influenza dell'espressione infiammatoria delle citochine e del rilascio di ossido nitrico nel corpo del pesce zebra sulla determinazione della neuroinfiammazione e della neurotossicità nel cervello.

Lo stesso volume di PBS (come LPS) è stato iniettato nell'area ventricolare del cervello del pesce zebra come controllo simulato. Non sono state osservate differenze significative tra i gruppi di controllo e quelli operati di sham nei neuroni, in particolare dal gruppo anteriore dei nuclei del rafe (Ra) (Figura 3A-C), dalla densità integrata di fluorescenza dei neuroni cerebrali (Figura 3D,E), dalla distanza totale di movimento del pesce zebra (Figura 4A,B), dalla produzione di NO e dall'espressione di mRNA di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 4A-D) e reclutamento di neutrofili nel cervello larvale del pesce zebra (Figura 6A,B). Questi risultati hanno dimostrato che una corretta microiniezione non causa alcuna neurotossicità e neuroinfiammazione nel pesce zebra.

Dopo il trattamento per 24 ore, l'iniezione ventricolare cerebrale di LPS ha indotto neurotossicità nel pesce zebra. LPS (1-5 mg/ml) ha indotto una significativa perdita di neuroni Ra nel cervello del pesce zebra larvale Tg (ETvmat2: GFP) rispetto ai gruppi di controllo e sham (Figura 3A-C). La linea transgenica elav13:mCherry zebrafish delinea le cellule neuronali con la proteina fluorescente rossa nucleare35. Come mostrato nella Figura 3D,E, 2,5-5 mg / mL LPS ha portato a cambiamenti significativi nella densità integrata di fluorescenza dei neuroni cerebrali in questa linea di pesce zebra larvale. Tuttavia, il gruppo di iniezione LPS 1 mg / mL non ha mostrato alcun effetto sulla densità integrata di fluorescenza dei neuroni cerebrali rispetto ai gruppi di controllo e sham. Inoltre, 5 mg/ml di LPS hanno indotto un deficit di locomozione (Figura 4A) e diminuito la distanza totale di movimento del pesce zebra in un periodo di tracciamento di 60 minuti (Figura 4B). I risultati hanno dimostrato che 1-2,5 mg / mL LPS potrebbe indurre la perdita di neuroni ma nessun deficit significativo di locomozione.

Inoltre, l'iniezione ventricolare cerebrale di LPS può anche attivare la risposta infiammatoria nel cervello del pesce zebra. La produzione di NO (Figura 5A) e l'espressione di mRNA di citochine pro-infiammatorie (TNF-α, IL-6 e IL-1β) (Figura 5B-D) nella testa delle larve di zebrafish sono aumentate con un trattamento LPS di 2,5-5 mg/ml rispetto all'espressione nei gruppi di controllo e sham. Dopo iniezione di LPS da 1-5 mg/ml, è stato osservato il reclutamento di neutrofili nel cervello larvale del pesce zebra (Figura 6A), con conseguente aumento significativo del numero di neutrofili nella regione cerebrale del pesce zebra Tg (mpo: EGFP) (Figura 6B).

Passo Tempo di funzionamento (sec) Livello di calore Azione
T1 L> H80-89 P1L005
T2 1.6-3 H00
T3 L> H00 P2L001c
T4 3 H00 BELLO
T5 0 H00

Tabella 1: Protocollo in cinque fasi per la trazione di tubi capillari in vetro.

Nome del primer Sequenza
IL-1β in avanti 5'-CATTTGCAGGCCGTCACA-3'
IL-1β inverso 5'-GGACATGCTGAAGCGCACTT-3'
IL-6 in avanti 5'-TCAACTTCTCCAGCGTGATG-3'
IL-6 retromarcia 5'-TCTTTCCCTTTTTTCCTCCTG-3'
TNF-α avanti 5'-GCTGGATCTTCAAAGTCGGGTGTA-3'
TNF-α inverso 5'-TGTGAGTCTCAGCACACTTCCATC-3'
Ef1α avanti 5'-GCTCAAACATGGGCTGGTTC-3'
Ef1α inverso 5'-AGGGCATCAAGAAGAGTAGTACCG-3'

Tabella 2: Primer utilizzati in tempo reale qPCR.

Figure 1
Figura 1: Struttura generale del lipopolisaccaride (LPS). Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 2
Figura 2: Configurazione della microiniezione, postura del corpo e posizione del pesce zebra e separazione della porzione di testa. (A) Selezione dell'ago di vetro: utilizzare una pinzetta per tagliare la punta di un ago pre-tirato al microscopio, per ottenere un ago con un'apertura simile a quella mostrata nella figura. (B) Regolare la lunghezza focale del microscopio in modo che l'area ventricolare cerebrale delle larve di zebrafish possa essere osservata ad alto ingrandimento (delineata in nero). I cerchi azzurri indicano il sito di iniezione. (C) Le larve montate devono essere orientate con il cervello rivolto verso l'alto per l'accesso all'ago (tectum cerebrale indicato da cerchio rosso). (D) Dimostrazione di iniezione ventricolare riuscita con blu di Evans nel cervello delle larve di zebrafish. (E) Porzione della testa di zebrafish senza le regioni dell'occhio e del sacco vitellino. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 3
Figura 3: L'iniezione ventricolare cerebrale di LPS abla i neuroni dopo 24 ore nelle larve di zebrafish. (A) (Inizio pagina) Immagini rappresentative al microscopio a fluorescenza di vmat2:GFP zebrafish dopo trattamento con diverse concentrazioni di LPS (parentesi rosse indicano nuclei di rafe [Ra] neuroni; barra di scala = 265,2 μm). (In basso) La regione neuronale di Ra è stata ampliata per migliorare la visualizzazione morfologica. (B,C) Intensità media di fluorescenza e lunghezza della regione del neurone Ra nelle larve di zebrafish vmat2:GFP. (D,E) Morfologia rappresentativa (barra di scala = 265,2 μm) e intensità media di fluorescenza dei neuroni cerebrali del pesce zebra Tg(elavl3:mCherry). I dati sono espressi come percentuale del gruppo di controllo. *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 4
Figura 4: L'iniezione ventricolare cerebrale di LPS induce deficit di locomozione dopo 24 ore nelle larve di zebrafish. (A) Modelli rappresentativi di tracce di locomozione del pesce zebra. Nella mappa di tracciamento digitale, il movimento ad alta velocità è rappresentato da linee rosse (> 6,6 mm/s); il movimento a media velocità è rappresentato da linee verdi (3,3−6,6 mm/s); Il movimento a bassa velocità è rappresentato da linee nere (< 3,3 mm/s). (B) Analisi quantitativa della distanza totale media percorsa dal pesce zebra in 60 min. *P < 0,05 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 5
Figura 5: L'iniezione ventricolare cerebrale di LPS aumenta i mediatori pro-infiammatori. (A) I livelli di ossido nitrico sono stati misurati utilizzando il reagente di Griess. (B-D) I livelli di espressione genica di interleuchina-6 (IL-6), interleuchina-1β (IL-1β) e fattore di necrosi tumorale α (TNF-α) nella testa del pesce zebra sono stati studiati mediante qPCR. *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

Figure 6
Figura 6: La microiniezione ventricolare cerebrale LPS porta al reclutamento di neutrofili nel cervello del pesce zebra dopo 24 ore. (A) Migrazione dei neutrofili (area all'interno del cerchio rosso) nella testa delle larve dopo iniezione ventricolare cerebrale LPS (barra della scala = 851,1 μm). (B) Il numero di neutrofili nelle teste delle larve dopo iniezione ventricolare cerebrale LPS. *P < 0,05 e **P < 0,01 rispetto al gruppo di controllo. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.

File supplementare 1: Dati grezzi Fare clic qui per scaricare questo file.

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Discussion

Una quantità crescente di dati epidemiologici e sperimentali implica infezioni batteriche e virali croniche come possibili fattori di rischio per le malattie neurodegenerative36. L'infezione innesca l'attivazione dei processi infiammatori e delle risposte immunitarie dell'ospite37. Anche se la risposta agisce come meccanismo di difesa, l'infiammazione iperattivata è dannosa per la neurogenesi e l'ambiente infiammatorio non consente la sopravvivenza dei neuroni neonatali38. Di conseguenza, provoca danni alle funzioni neuronali dell'ospite e alla vitalità. Gli studi indicano che l'infiammazione svolge un ruolo significativo nella fisiopatologia della neurodegenerazione39.

Come endotossina patogena frequentemente studiata, LPS è stata implicata nell'inibizione della neurogenesi e della neurodegenerazione. L'attivazione LPS dei processi infiammatori compromette significativamente la neurogenesi, in parte attraverso la produzione di NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β40. Un numero crescente di prove dimostra che LPS causa deficit comportamentali e perdita neuronale e influenza la progressione della neurogenesi quando iniettato centralmente in modelli di roditori neurodegenerativi10,38. I modelli di zebrafish sono stati ampiamente utilizzati come modelli sperimentali alternativi per studiare le risposte immunitarie41 e selezionare nuovi farmaci anti-infiammatori. Il sistema immunitario innato e adattativo del pesce zebra è simile a quello dei mammiferi42. Inoltre, alcuni studi hanno identificato diverse citochine infiammatorie e recettori presenti nei mammiferi nel SNC43 del pesce zebra. Studi precedenti suggeriscono che immergere embrioni/larve di zebrafish in LPS o iniettare LPS nel tuorlo delle larve di zebrafish può indurre la risposta immunitaria e aumentare i fattori pro-infiammatori associati all'infiammazione44,45. Tuttavia, l'effetto specifico dell'LPS sul tessuto nervoso del pesce zebra e sull'induzione della neuroinfiammazione non è ancora noto.

Sebbene i modelli di roditori abbiano molti vantaggi rispetto ad altri modelli animali, i loro limiti in termini di imaging in vivo in tempo reale e screening farmacologico sono evidenti. L'imaging in vivo è ampiamente utilizzato per studiare i meccanismi alla base dello sviluppo del sistema nervoso e dei cambiamenti patologici del cervello come strumento potente e non invasivo46,47. Grazie alla trasparenza ottica degli embrioni e delle larve di zebrafish, sono adatti per esperimenti di imaging dal vivo di osservazione cerebrale48,49. In particolare, le piccole dimensioni dei pesci zebra e la loro capacità di produrre migliaia di embrioni significano che lo screening farmacologico ad alto rendimento può essere effettuato utilizzando embrioni o larve di zebrafish50,51. Inoltre, con gli sviluppi della scienza e della tecnologia, le microiniezioni robotiche possono essere erogate in modo preciso ed efficace e possono essere utilizzate per iniettare grandi quantità di embrioni o larve52,53. L'applicazione del sistema di iniezione microrobotica alla ricerca neuronale, per l'iniezione tempestiva di materiali in un gran numero di embrioni o larve, faciliterà lo screening su larga scala di biomolecole e composti farmacologici.

In questo studio, il pesce zebra a 5 dpf è stato iniettato con LPS ad una concentrazione di 2,5-5 mg/ml; Questo è stato determinato come la condizione ottimale per lo sviluppo del modello di neuroinfiammazione. Per quanto ne sappiamo, questa metodologia non è stata descritta in letteratura. Di conseguenza, la microiniezione ventricolare cerebrale di LPS nelle larve di zebrafish è stata in grado di causare perdita di neuroni e deficit di locomozione. Inoltre, i nostri risultati hanno dimostrato che la neuroinfiammazione indotta da LPS aumenta i livelli di mediatori proinfiammatori come NO, TNF-α, IL-6 e IL-1β e porta al reclutamento di neutrofili nel cervello larvale del pesce zebra a 24 ore dopo l'iniezione. In altri modelli animali, l'iniezione di LPS può anche promuovere lo sviluppo di infiammazione e causare alterazioni neuropatologiche nel cervello13,54. I risultati di questo studio migliorano la nostra comprensione dei percorsi neuroinfiammatori. In questo metodo, va notato che l'apertura degli aghi per la microiniezione non dovrebbe essere troppo grande per evitare danni cerebrali causati da operazioni meccaniche e una ragionevole quantità di forza dovrebbe essere applicata per evitare di danneggiare le larve. Inoltre, è importante separare la testa dagli occhi e dal corpo del pesce zebra per la determinazione dei fattori infiammatori e dell'ossido nitrico, in quanto ciò contribuirà a ottenere risultati direzionali che riflettono specificamente la neuroinfiammazione indotta dall'iniezione ventricolare cerebrale LPS.

Un leggero svantaggio di questo metodo è che, a causa delle piccole dimensioni delle larve di zebrafish, la quantità di biomolecole come l'mRNA totale ottenuto per omogeneizzazione ed estrazione è inferiore a quella del modello murino. Tuttavia, il pesce zebra è in grado di deporre le uova frequentemente con diverse centinaia di uova ogni settimana. L'aumento del numero di larve di zebrafish utilizzate in ciascun gruppo può fornire quantità sufficienti di biomolecole estratte per diversi saggi biochimici. In conclusione, questo metodo induce neurotossicità e una risposta immunitaria nel cervello del pesce zebra larvale. A causa della trasparenza del pesce zebra, i cambiamenti nel cervello del pesce zebra vivo larvale possono essere meglio compresi tramite imaging in vivo . La tecnica qui descritta è uno strumento eccellente per valutare in modo rapido ed efficiente possibili farmaci anti-neuroinfiammatori.

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Disclosures

Gli autori non dichiarano alcun interesse finanziario concorrente.

Acknowledgments

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni del Science and Technology Development Fund (FDCT) di Macao SAR (Ref. No. FDCT0058/2019/A1 e 0016/2019/AKP), Comitato di ricerca, Università di Macao (MYRG2020-00183-ICMS e CPG2022-00023-ICMS) e National Natural Science Foundation of China (n. 81803398).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Agarose Sigma-Aldrich A6361
Agarose, low gelling temperature Sigma-Aldrich A9414
Drummond Nanoject III Programmable Nanoliter Injector Drummond Scientific 3-000-207
Fluorescence stereo microscopes Leica M205 FA
GraphPad Prism software GraphPad Software Ver. 7.04
Lipopolysaccharides from Escherichia coli O111:B4 Sigma-Aldrich L3024
Manual micromanipulator World Precision Instruments M3301
Mineral oil Sigma-Aldrich M5904
Mx3005P qPCR system Agilent Technologies Mx3005P
Nanovue plus spectrophotometer Biochrom 80-2140-46
Nitrite concentration assay kit Beyotime Biotechnology S0021M
Phosphate-buffered saline Sigma-Aldrich P4417
Programmable Horizontal Pipette Puller World Precision Instruments PMP-102
PTU (N-Phenylthiourea) Sigma-Aldrich P7629
Random primers Takara 3802
SuperScript II Reverse Transcriptase Invitrogen 18064014
SYBR Premix Ex Taq II kit Accurate Biology AG11701
The 3rd Gen Tgrinder Tiangen OSE-Y30
Thin wall glass capillaries (4”) with filament, OD 1.5 mm World Precision Instruments TW150F-4
Tricaine (3-amino benzoic acid ethyl ester) Sigma-Aldrich A-5040
TRNzol Universal reagent Tiangen DP424
Zebrafish tracking box ViewPoint Behavior Technology

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Neuroscienze Numero 186 Cervello microiniezione ventricolare zebrafish lipopolisaccaride neuroinfiammazione neurotossicità
Microiniezioni ventricolari cerebrali di lipopolisaccaride in larve di zebrafish per valutare la neuroinfiammazione e la neurotossicità
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He, Y., Lee, S. M. Y. Brain Ventricular Microinjections of Lipopolysaccharide into Larval Zebrafish to Assess Neuroinflammation and Neurotoxicity. J. Vis. Exp. (186), e64313, doi:10.3791/64313 (2022).

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