La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental murino de dermatitis alérgica de contacto (ACD). El CHS se basa en la sensibilización con hapteno reactivo mediante la pintura de la piel afeitada del pecho y el abdomen, con un posterior desafío de la piel del oído con un hapteno diluido, causando una reacción de hinchazón que se evalúa de varias maneras.
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Artículo de método
Hipersensibilidad de contacto como modelo murino de dermatitis alérgica de contacto
En este artículo
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Resumen
Resumen
La hipersensibilidad de contacto (CHS) es un modelo experimental de dermatitis alérgica de contacto (ACD) que se puede estudiar en ratones. Este estudio tiene como objetivo presentar un método de laboratorio objetivo que pueda ayudar a estudiar la reacción chS en ratones, que puede medirse y cuantificarse mediante diversas pruebas. Para inducir CHS, en el día "0", los ratones fueron sensibilizados en un punto previamente afeitado por pintura de piel abdominal con el hapteno 2,4,6-trinitroclorobenceno (TNCB) en una mezcla de acetona-etanol, mientras que los ratones de control negativo fueron sensibilizados simuladamente con la mezcla de vehículo solo de acetona-etanol. En el día "4", el grosor basal del oído se midió con un micrómetro antes de la elicitación de CHS (desafío) pintando ambos oídos con TNCB diluido tanto en el grupo de prueba como en el de control. Después de 24 h, la hinchazón del oído se midió con un micrómetro. CHS es un ejemplo de una respuesta inmune mediada por células T que causa hinchazón en el tejido inflamado, alcanzando su punto máximo 24 horas después del desafío de la piel con el mismo hapteno. Un aumento en el edema del oído se correlacionó con el aumento del peso del oído, la actividad de la mieloperoxidasa (MPO), la concentración de citoquinas proinflamatorias en los extractos de oído, el aumento del engrosamiento de la dermis edematosa en el examen histológico y la permeabilidad vascular del oído. También hubo un aumento en la concentración de anticuerpos IgG1 específicos de TNP en los sueros del grupo de prueba en comparación con los ratones de control. Además, el CHS se puede transferir con éxito con las células efectoras de CHS obtenidas de donantes previamente sensibilizados con TNCB. Las células efectoras de CHS se administraron por vía intravenosa en ratones receptores ingenuos, que posteriormente fueron desafiados con el mismo hapteno diluido. La hinchazón del oído se midió con un micrómetro 24 h más tarde.
Introducción
La dermatitis alérgica de contacto (ACD) es una enfermedad inflamatoria común de la piel en los países industrializados causada por una reacción de hipersensibilidad tipo IV resultante de la exposición a sustancias químicas de bajo peso molecular llamadas haptenos. Las sustancias que causan sensibilización por contacto en los seres humanos incluyen iones de metales pesados (cromo, níquel, hierro, cobalto), trementina, fragancias, colorantes y conservantes presentes en cosméticos (por ejemplo, p-fenilendiamina), algunos medicamentos (por ejemplo, neomicina, benzocaína), antibióticos β-lactámicos (es decir, penicilina), productos químicos producidos por las plantas (pen....
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Protocolo
Todos los experimentos presentados en este artículo se llevaron a cabo de acuerdo con las directrices del 1er Comité Ético Local de Pruebas con Animales en Cracovia. Todos los procedimientos descritos se realizaron de acuerdo con las recomendaciones locales, especialmente con respecto al uso de ketamina / xilazina como anestésico, el uso de ambos lados de las orejas para aplicar la sustancia / hapteno, el corte de la oreja y la recolección de sangre mediante la extracción del globo ocular. Para el presente estudio se utilizaron BALB/c (haplotipo H-2d), CBA/J (H-2k) y C57BL/6 (H-2b), ratones machos y hembras de 6-12 semanas de edad (ver....
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Resultados
Para la inducción de CHS, los animales fueron sensibilizados mediante pintura cutánea (abdominal) con 150 μL de TNCB al 5% o sensibilizados simuladamente con el vehículo solo. En el día "4", las respuestas de hinchazón del oído de ambos oídos fueron inducidas por pintura de contacto (desafío) con 10 μL de TNCB al 0,4% en ambos ratones previamente sensibilizados en contacto con TNCB (grupo de prueba) y en ratones del grupo control (sensibilizados simuladamente). Los datos presentados muestran que los ratones sens.......
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Discusión
El CHS se induce a través de haptenos, que se unen a antígenos autoproteicos en la piel, creando neoantígenos. El CHS está mediado por el reclutamiento extravascular local de células T efectoras chS específicas del antígeno circulante, lo que resulta en hinchazón en el tejido desafiado, alcanzando su punto máximo 24 h después de la exposición de la piel secundaria al mismohapteno 6. La hinchazón del tejido es causada principalmente por la infiltración de leucocitos y la deposición de fibr.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
Este estudio fue apoyado por la subvención SUBZ. A020.22.060 de la Universidad de Medicina de Wroclaw, Polonia, y por subvenciones del Ministerio de Ciencia y Educación Superior N N401 545940 a MS e IP2012 0443 72 a MMS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Etanol al 70% | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 65350-M | para la desinfección de superficies |
| Placas de fondo plano de 96 pocillos, polipropileno | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria | 655101 | para medición de MPO y azul Evans: las placas deben estar hechas de polipropileno, que tiene una capacidad de unión más baja, por lo que las proteínas o el ADN no se unirán a |
| acetona (reactivo ACS, ≥ 99.5%) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 179124 | |
| Papel de aluminio | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | Z185140 | |
| Balanza analítica | Sartorius Weighing Technology GmbH, Goettingen, Alemania | PRACTUM224-1s, 29105177 | |
| Procesador de tejidos automatizado | MediMeas Instruments, Sarsehri, Haryana, India | MTP-E-212 | preparar automáticamente las muestras de tejido fijándolas, deshidratándolas, aclarándolas e infiltrándolas con parafina |
| BD Vacutainer SST II Advance (tubo con gel para la obtención de suero) | Becton Dickinson (BD), Franklin Lakes, NJ, EE.UU | BD | |
| Kit de ácido bicinconínico para la determinación de proteínas | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | BCA1-1KT | |
| Biotina Rata Anti-Ratón IgG1 | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU | . 553441 | |
| BSA (albúmina sérica bovina) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | A9418 | ensayos y análisis de proteínas, 2 mg/mL |
| Filtro de células, tamaño de poro 70 μ m | BIOLOGIX, China | 15-1070 | adecuado para tubos de 50 mL |
| Coverslip | VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos | 631-1583 | 24 mm, pero es posible utilizar diferentes tamaños |
| Capacidad de pipetas desechables: 5 mL, 10 mL, 25 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | Z740301, Z740302, Z740303 | |
| DPBS (Dulbecco′ Solución salina tamponada con fosfato) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU. | 14190144 | sin calcio, sin magnesio, cultivo de células de mamíferos |
| DPX Mountant para histología | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 6522 | medios de montaje para H-E, se pueden utilizar otros p. ej., bálsamo |
| de Canadá Dumont 5 pinzas - rectas | Animalab, Poznan, Polonia | 11251-10FST | instrumentos quirúrgicos para procedimientos en ratones (deben estar esterilizados) |
| Dumont 7 pinzas - dobladas | Animalab, Poznan, Polonia | 11272-50FST | Instrumentos quirúrgicos para procedimientos en ratones (deben estar esterilizados) |
| Solución de eosina Y, alcohólica | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | HT110116 Eppendorf | |
| Tubos Safe-Lock 1,5 mL | Eppenforf, Alemania | 3,01,20,086 | polipropileno |
| Eppendorf Tubos Safe-Lock, 2,0 mL | Eppenforf, Alemania | 3,01,20,094 | polipropileno, fondo redondo (las perlas de homogeneización se pueden mover fácilmente) |
| Etanol 100% (alcoholol absoluto) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.07017 | |
| Etanol 96% | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.59010 | |
| Evans azul | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | E2129 | |
| FBS (suero fetal bovino) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU. | ||
| Solución de formol, tamponada neutra, 10% | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | HT501128 | |
| Formamida 99,5% (GC) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | F7503 | |
| Congelador -20 ° C | Bosch, Alemania | GSN54AW30 | |
| Nevera +4 ° C / congelador -20 &° C | Bosch, Alemania | KGV36V10 | Cultivo de células de mamíferos, calificado, Brasil, 10 x 50 mL |
| Portaobjetos de vidrio microskope, SuperFrost Plus | VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos | 631-0108, 631-0446, 631-0447, 631-0448, 631-0449 | Portaobjetos que eliminan la necesidad de aplicar materiales adhesivos o recubrimientos de proteínas, para evitar la pérdida de secciones de tejido durante la tinción. |
| Almohadilla gráfica Prisma | GraphPad Software Inc. | v. 9.4.0 | |
| Jabón gris | Pollena Ostrzeszó w, Producent Chemii Gospodarczej Sp. Z.o.o. , Sp. K., Polonia | Bialy jelen barra de jabón | gris Barra de jabón Natural Hipoalergénico. Producto generalmente disponible |
| H2SO4 (ácido sulfúrico) 1 mol/l (1 M) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.60313 | |
| Harris solución de hematoxilina | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | HHS16 | |
| VWR, Avantor, EE. UU. | 612-5719 | cámara de conteo manual, que es más precisa | |
| Bromuro de hexadeciltrimetilamonio | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | H5882 | |
| QIAGEN Hilden, Alemania | Tissue Lyser LT, SN 23.1001/05234 | Homogeneizador con perlas de acero inoxidable (diámetro 5 mm) para tubos de centrífuga de 2 mL | |
| Estreptavidina de peroxidasa de rábano picante (estreptavidina HRP) | Vector Laboratories, Inc., Burlingame, CA, EE. UU | SA-5004-1 | |
| Solución de peróxido de hidrógeno (H202) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | H1009 | |
| Incubadora Heracell 150i | Thermo Electron LED Gmbh, Alemania | 41071068 | 37 oC en la atmósfera de 5 % CO2, y 65 0C para la desparafinación las secciones para histología |
| Ketamina 100 mg/mL, solución inyectable | Biowet Pulawy Sp. z o.o., Pulawy, Polonia | cat.# no disponible | |
| KH2PO4 (fosfato de dihidrógeno potásico) Base anhidra al 99,995% | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 1.05108 | |
| Centrífuga de laboratorio | Heraeus Megafuge 1.0R, Thermo Scientific, Alemania | B00013899 | velocidad a 300 x g, con refrigeración a 4 0C |
| Centrífuga de laboratorio | Heraeus Fresco 21, Thermo Scientific, Alemania | 75002425 | velocidad hasta 3.000 x g, con refrigeración hasta 4 0C |
| Mascarilla (FFP2) | VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos | 111-0917 | para trabajar con diclorhidrato de ortodianisina |
| Unidad de cría de ratones de la Cátedra de Ciencias Biomédicas, Facultad de Ciencias de la Salud, Facultad de Medicina de la Universidad Jagellónica, Cracovia, Polonia | CBA/J, C57BL/6 | ||
| micrómetro | Mitutoyo, Tokio, Japón | 193-111 | dígitos micrómetro exterior, tope de trinquete, rango de 0-25 mm, graduación de 0,001 mm, precisión de +/-0,002 mm, https://shop.mitutoyo.pl/web/mitutoyo/pl_PL/all/all/Mikrometr%20analogowy%20/PR/193-111/index.xhtml |
| microplaca, 96 pocillos, microlon, alta adherencia (para prueba ELISA) | Greiner Bio-One GmbH, Kremsmünster, Austria | 655061 | con superficies de unión Maxi-Sorp para obtener resultados fiables y reproducibles en ensayos colormétricos |
| Microscopio con objetivos | Leica Microsystems CMS GmbH, Alemania | DM1000, 294011-082007 | La histología presentada en el artículo se realizó bajo el sistema de imágenes ThermoFisher Scientific EVOS M5000, con los objetivos: FL 20X LWDPH, 0.40NA/3.1WD y FL 40X LWDPH 0.65NA/1.79WD |
| Mieloperoxidasa de leucocitos humanos (estándar MPO) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | M6908 | |
| Na2HPO4 x 7 H2O (fosfato de sodio dibásico heptahidratado) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | S9390 | |
| Aceite de oliva | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 75343 | puro, natural |
| OptEIA Mouse IFN-γ Conjunto de ELISA | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, Nueva Jersey, EE. UU. | 555138 | |
| Clorhidrato de ortodianisina | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | D3252 | |
| Cera de parafina | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 76242 | perlas, sólido ceroso |
| PBS (solución salina tamponada con fosfato) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU. | 20012027 | pH 7.2, cultivo de células de mamíferos |
| Medidor de pH | Elmetron, Polonia | CP-401 | |
| Pipetas, volumen variable con puntas | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | Paquete de 3 EP3123000900-1EA | , opción 1, 0,5-10 uL/10-100 uL/100-1000 uL, incluye epT.I.P.S. |
| Cuchilla de afeitar | VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos | PERS94-0462 | Cuchillas rascadoras y de corte, de un solo filo, lomo de aluminio, 100 cuchillas por caja, envueltas individualmente |
| Microtomo rotatorio | MRC Laboratory-Instruments, Essex, CM20 2HU UK | HIS-202A Tijeras | |
| - rectas, afiladas / afiladas | Animalab, Poznan, Polonia | 14060-10FST | Instrumentos quirúrgicos para procedimientos en ratones (deben estar esterilizados) |
| Tapón de rosca (tapa abierta) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 27056 | tapón de polipropileno negro, para usar con 22 Frasco de ml con rosca 20-400 |
| Espectrofotómetro | BioTek Instruments, EE. UU. | 201446 | Espectrofotómetro universal de microplacas: λ rango: 200 - 999 nm, rango de medición de absorbancia: 0,000 - 4,000 Abs |
| Plato de tinción 20 portaobjetos con gradilla | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | S6141 | p. ej. 20 platos de tinción de portaobjetos completos con cubiertas, gradilla de portaobjetos y asa |
| Punzón de biopsia desechable estéril de 6 mm | Integra LifeSciences, Princeton, Nueva Jersey, EE. UU. | 33-36 | |
| Tijeras quirúrgicas | Animalab, Poznan, Polonia | 52138-46 | Instrumentos quirúrgicos para procedimientos en ratones (deben estar esterilizados) |
| Casetes de procesamiento de tejidos | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | Z672122 | Procesamiento de tejidos/incrustación de casetes con tapa |
| Juego de reactivos de sustrato TMB | Becton Dickinson (BD Biosciences), Franklin Lakes, NJ, EE. UU. | 555214 | |
| TNCB (2,4,6-trinitroclorobenceno) | Tokyo Chemical Industry CO., LTD, Japón | C0307 | |
| TNP-BSA (albúmina sérica bovina conjugada con 2,4,6-trinitrofenil) | Biosearch Technologies LGC, Petaluma, CA, EE. UU | T-5050 | |
| T-PER (reactivo de extracción de proteínas tisulares) | ThermoFisher Scientific, Waltham, Massachusetts, EE. UU | 78510 | |
| Tubos 15 mL estériles | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | CLS430055 (Corning) | polipropileno, fondo cónico |
| Tubos 50 mL, estériles | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | CLS430290 (Corning) | polipropileno, fondo cónico |
| Tween 20 | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | P1379 | |
| Viales, tapa de rosca, vidrio transparente (solo vial) 22 mL | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 27173 | para la preparación de hapteno, atornillado para que no se evapore |
| Baño de agua | AJL Electronic, Polonia | LW102 | |
| Dispensador de cera (parafina) | VWR, Radnor, Pensilvania, Estados Unidos | 114-8737 | |
| Xilacina (xilapán 20 mg/mL) solución inyectable | Vetoquinol Biowet Sp. z o.o., Gorzow Wielkopolski, Polonia | cat.# no disponible | |
| Xileno (grado histológico) | Merck KGaA, Darmstadt, Alemania | 534056 |
Referencias
- Nosbaum, A., Vocanson, M., Rozieres, A., Hennino, A., Nicolas, J. F. Allergic and irritant contact dermatitis. European Journal of Dermatology. 19 (4), 325-332 (2009).
- Hertl, M., et al. Predominance of epiderma....
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Reimpresiones y permisos
Erratum
Formal Correction: Erratum: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis
Posted by JoVE Editors on 1/19/2023. Citeable Link.
An erratum was issued for: Contact Hypersensitivity as a Murine Model of Allergic Contact Dermatitis. The Protocol and Representative Results sections were updated.
Step 3.2.1 of the Protocol has been updated from:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone-ethanol mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
to:
On day "4", prepare 0.4% hapten: TNCB in an acetone: olive oil mixture (ratio 1:1). Prepare the solution just before use in a glass vial and protect it from light by covering the vial with aluminum foil.
Figure 1 of the Representative Results has been updated from:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 1: Induction of CHS. Sensitization, challenge, and ear measurement. Abbreviations: CHS = contact hypersensitivity reaction; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
Figure 2 of the Representative Results has been updated from:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
to:
Figure 2: Adoptive transfer of the CHS-effector cells. Abbreviations: ALNs =axillary and inguinal lymph nodes; CHS = contact hypersensitivity reaction; i.v. = intravenously; SPLs = spleens; TNCB = 2,4,6-trinitrochlorobenzene. Please click here to view a larger version of this figure.
