Artículo de método

Detección de objetivos basada en aptámeros facilitada por una reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex de 3 etapas

DOI:

10.3791/64342

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6 de octubre de 2022

 ,  , 
1Aptagen LLC

En este artículo

Resumen

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El protocolo actual demuestra el uso de un ensayo de amplificación exponencial rápido, de 3 etapas, basado en aptámeros para detectar objetivos. La preparación de la muestra, la amplificación de la señal y el desarrollo del color están cubiertos para implementar este sistema para reconocer la presencia de teofilina sobre la de cafeína.

Resumen

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Los aptámeros son moléculas de reconocimiento de objetivos que se unen con alta afinidad y especificidad. Estas características se pueden aprovechar para controlar otras moléculas con capacidad de generación de señales. Para el sistema descrito en este documento, el reconocimiento de objetivos a través de un dominio aptámero, Stem II de una ribozima de cabeza de martillo modificada, activa la ribozima autoescindida estabilizando la construcción inicialmente no estructurada. El ARN cis-escindido actúa en la unión de Stem III y Stem I, creando dos productos de escisión. El producto de escisión más largo prepara una reacción de amplificación exponencial isotérmica (EXPAR) de los dos G-cuádruples catalíticamente activos similares. Esos productos de amplificación resultantes catalizan la reducción de la peroxidasa, que se acopla a la reducción de un sustrato colorimétrico con una salida que el ojo desnudo puede detectar. El sistema de 3 partes descrito en el presente estudio mejora las modalidades de detección, como los ensayos inmunoabsorbentes ligados a enzimas (ELISA) al producir una señal visualmente detectable para indicar la presencia de teofilina tan baja como 0.5 μM en tan solo 15 minutos.

Introducción

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Los aptámeros son típicamente ADN o ARN monocatenario seleccionados a través de un proceso evolutivo con alta afinidad y especificidad de unión a los objetivos deseados1. Además de la capacidad de unión, los aptámeros pueden vincularse y controlar motivos con funciones de salida de señal2,3, amplificando dicha señal y mejorando la sensibilidad del sistema. El sistema de reacción de amplificación exponencial isotérmica G-quadruplex (GQ-EXPAR) es un sistema de tres partes (Figura 1) que desarrolla una señal visual a medida que se agregan componentes sucesivos a un solo recipiente de reacción para producir una salida visual4. Este sistema permite la detección de un objetivo específico, aquí teofilina, en una muestra dada dentro de los 15 minutos utilizando un flujo de trabajo simplificado para permitir la detección rápida y específica de un objetivo de interés. Este método debe considerarse para muestras en las que la cuantificación específica de la concentración objetivo sea menos preocupante que la alta especificidad de la respuesta en un corto período de tiempo.

Un riboswitch alostérico, una molécula de ARN que cambia de estructura (ribozima) que sufre autoescisión, produce la señal inicial. Esta construcción se basa en la ribozima cabeza de martillo, con un dominio aptámero introducido en Stem II como regulador de la actividad de escisión. Su función de autoescisión se activa cuando su dominio aptámero se estabiliza al unirse a su objetivo5. De lo contrario, el conmutador está inactivo en su estado nativo.

La reacción de amplificación exponencial posterior (EXPAR) utiliza la liberación de la cadena de ARN autoescindida desde la primera etapa para preparar una reacción de amplificación isotérmica6. El producto de amplificación de EXPAR tiene actividad peroxidasa7, actuando como base para la última etapa del sistema. Cuando algunos sustratos se oxidan junto con la descomposición del peróxido, producen una salida fluorescente que se puede medir en varios instrumentos. Otros sustratos comunes pueden ser sustituidos para producir un producto coloreado para la detección visual. EXPAR y la actividad peroxidasa de sus productos de amplificación actúan como un potenciador de señal de 2 etapas, aumentando la sensibilidad a mayores niveles en comparación con las estrategias convencionales 7,8.

La detección de teofilina versus cafeína se utiliza como un ejemplo de la especificidad de esta plataforma de detección, ya que difieren en un solo grupo metilo (Figura 2). Esta demostración del sistema produce una salida colorimétrica para la detección visual de al menos 500 nM de teofilina.

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Protocolo

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Consulte la Tabla suplementaria 1 (la tabla de configuración de reacción) para la preparación del tubo, incluidos los volúmenes y concentraciones específicos de los componentes de reacción. El protocolo que se muestra aquí utiliza un kit de plataforma de detección preensamblado como se describe en la Tabla de materiales. Todos los componentes deben mantenerse en hielo a menos que se indique lo contrario.

1. Preparación de ribozima

NOTA: El componente primario de detección es una ribozima alostérica (regulada por aptámero) que reconoce la teofilina (ver Tabla complementaria 2).

  1. Recoja 5 U de polinucleótido quinasa T4 (0,5 μL, consulte la Tabla de materiales) en un tubo de PCR, que se utilizará para activar los productos de escisión de ribozima.
    NOTA: Este componente se agrega primero para que el usuario pueda ver la dispensación correcta de la enzima.
  2. Agregue 1 μL de tampón de ribozima 5x preparado previamente (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra (tubo de PCR).
  3. Con el fin de demostrar visualmente la especificidad, añadir 1,5 μL de teofilina 2 mM (objetivo) o 2 mM de cafeína (control) (véase la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra como muestras de ensayo.
    NOTA: Para establecer una curva estándar, se recomienda comenzar con un analito de 3.125 mM y probar diluciones de cinco veces hasta 0.001 mM.
  4. Mezcle bien cada tubo de muestra pipeteando 5-10 veces.
  5. Añadir 2 μL de ARN de 600 nM que contengan un dominio aptámero específico para el objetivo (ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra para obtener una concentración final de 240 nM en 5 μL de solución problema, luego mezclar rápidamente por pipeteo y colocar en un bloque frío para minimizar la señal de fondo.
    NOTA: es importante preparar inicialmente todas las reacciones sin ribozima, ya que la reacción de autoescisión comenzará inmediatamente cuando la ribozima se combine con el tampón de ribozima y puede producir antecedentes significativos.
  6. Una vez preparados todos los tubos de reacción, incubar cada muestra (5 μL) a temperatura ambiente (23 °C) durante exactamente 3 min con un temporizador. Devolver inmediatamente los tubos de muestra a hielo (4 °C) después de la incubación.

2. GQ-EXPAR

  1. Agregue 3.5 μL de mezcla de enzima nickasa-polimerasa (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezcle bien.
    NOTA: Las concentraciones requeridas de enzimas dependen de las secuencias de reconocimiento, los tipos de enzimas y las temperaturas de reacción, cuya combinación se determinó empíricamente.
  2. Agregue 31.5 μL de mezcla de reacción EXPAR que contenga plantilla, nucleótidos y tampón de reacción (consulte la Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y pipeta a mezclar.
    NOTA: Las concentraciones de los componentes se optimizan en función de las enzimas y secuencias de los productos de la polimerasa.
  3. Una vez preparadas todas las muestras, incubar cada muestra preparada (40 μL) a 55 °C durante exactamente 5 min con un temporizador. Si es posible, incubar en un termociclador, aunque una tapa calentada es innecesaria.
  4. Devolver inmediatamente los tubos de muestra al hielo (4 °C) después de la etapa de incubación.

3. Desarrollo del color

  1. Añadir 2 μL de solución de hemina (25 uM, ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezclar bien.
  2. Añadir 58 μL de la solución TMB disponible en el mercado (ver Tabla de materiales) a cada tubo de muestra y mezclar bien.
  3. Incubar la reacción de desarrollo del color (100 μL) a temperatura ambiente durante al menos 3 min y hasta 30 min.
    NOTA: (Opcional) El desarrollo del color se puede detener agregando 20 μL de ácido sulfúrico 2 M.
  4. Lea las muestras cualitativamente a ojo, o cuantifique los resultados utilizando un lector de placas de absorbancia a 450 nm si las reacciones de desarrollo de color se detienen con ácido sulfúrico.

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Resultados

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La plataforma de detección representada en la Figura 1 convierte el reconocimiento de objetivos aptámeros en diferencias visualmente distintas entre las preparaciones de la muestra (objetivo vs. no objetivo, Figura 2) en un corto período de tiempo. Una ribozima alostérica identificada por Soukup et al.5 sirvió como punto de partida para crear una secuencia menos ruidosa con respuesta al objetivo sobre las muestras control y negativas. La ...

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Discusión

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El método presentado aquí aprovecha la transición entre una estructura secundaria inicialmente desordenada en una ribozima alostérica y la estabilidad adicional conferida a través de la unión del objetivo al dominio aptámero para activar la ribozima de cabeza de martillo cis-escindida. La estabilidad de la ribozima se ajustó para minimizar la actividad catalítica en ausencia del objetivo, al tiempo que permite la unión del objetivo para restaurar la estructura activa. Además, se debe tener cuidado para equilibrar los amo...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Aptagen, LLC fabrica y comercializa un kit de demostración GQ-EXPAR para aquellos que desean experiencia directa con un sistema de detección basado en aptámeros.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Esta investigación fue apoyada por la financiación de investigación y desarrollo de Aptagen LLC.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Solución de diclorhidrato de 3,3',5,5'-tetrametilbencidina (TMB) con H2O2, "Solución de sustrato de micropozo MaxSignal TMB"PerkinElmerFOOD-1806-1000Reactivo de desarrollo de color. Minimice la exposición a la luz y al ambiente. Anteriormente número de catálogo de BIOO Scientific 1806.
Se suministra en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 3-2.
5'- TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TTC CCT CCC TCC CTC CCA GA-Biotina-3'Integrated DNA Technologies (IDT)PlantillaADN QtQ47 optimizada a medida para que EXPAR produzca G-quadruplex, cebado por G-quadruplex. Esto se utiliza para la parte "exponencial" de EXPAR, para aumentar rápidamente la cantidad de DNAzyme utilizada para el desarrollo del color del Paso 3. La plantilla incluye una biotina 3' para evitar la extensión involuntaria de la ADN polimerasa Bst 2.0 durante la parte EXPAR.
del tubo 2-2 del kit de demostración Apta-beacon.
5'-GGG AAC UAU ACA ACC UAG GGC GAC CCU GAU GAG CCU UAU ACC AGC AAG GCC CUU GGC AGA CGU UGA AAC GGU GAA AGC CGU AGG UUG CCC UAG GUU GUA UAG UU-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Secuencia deribozima alostérica personalizada con reconocimiento de teofilina (ribozima de autoescisión regulada por el dominio de aptámero de ARN para teofilina) modificada de Soukup et al.
Soukup, G. A., Emilsson, G. A. y Breaker, R. R. (2000) Alteración del reconocimiento molecular de aptámeros de ARN por selección alostérica, Journal of molecular biology 298, 623-632.
Suministrado en el kit de demostración de apta-beacon como tubo 1-3.
5'-TCC CTC CCT CCC TCC CAG TCC AGA CTC TAC GGC TTT CAC CGT TTC AAC G-Biotina-3'Integrated DNA Technologies (IDT)Plantilla deADN P3tQ49 optimizada a medida para EXPAR para producir G-quadruplex, cebada por el producto de escisión P3. Esto se utiliza en el Paso 2 para traducir el producto de escisión en DNAzyme utilizado para el desarrollo del color del Paso 3. La plantilla incluye una biotina 3' para evitar la extensión involuntaria de la ADN polimerasa Bst 2.0 durante la parte EXPAR.
del tubo 2-2 del kit de demostración Apta-beacon.
5x Ribozyme BufferAptagen, LLCN/A 5xcomposición: 600 mM Tris-HCl (pH 7,5), 150 mM MgCl2, 25 mM TDT. Utilizado en el paso 1.
suministrado en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 1-4.
Apta-beaconTM (GQ-EXPAR, TMB) Kit de demostraciónAptagen, LLCGQ-EXPAR-TMBEl kit de demostración muestra la especificidad del ensayo colorimétrico mediante la detección de objetivos de moléculas pequeñas difíciles, teofilina frente a cafeína, que solo difieren en un solo grupo metilo.
Bst 2.0 ADN polimerasaNew England BiolabsM0537SPolimerasa de amplificación isotérmica con actividad de desplazamiento de hebra. Parte de la mezcla de níquesa-polimerasa, preparada a 9.375 U/uL.
Parte del tubo 2-1 del kit de demostración Apta-beacon.
Tampón 3.1New England BiolabsB6003SVIALcombinado con 2 uL de tampón de amplificación isotérmica 10X y 27,5 uL de agua libre de nucleasas para producir tampón EXPAR 1.11X en la mezcla EXPAR. Este producto reemplaza el B7203SVIAL utilizado anteriormente que formó parte del desarrollo inicial del sistema (misma composición, excepto BSA no recombinante).
Parte del kit de demostración Apta-beacon Tube 2-2.
CafeínaSigma-AldrichC0750-100GContraobjetivo de aptámero (control), preparado con agua libre de nucleasas.
Se suministra en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 1-1.
dNTPsNew England BiolabsN0447SParte de la mezcla de reacción EXPAR.
Parte del tubo 2-2 del kit de demostración Apta-beacon.
Mezcla de reacción EXPARAptagen, LLCN/A0,44 mM dNTPs, 0,38 μ M P3tQ49, 0,38 μ M QtQ47, 44,44 mM Tris-HCl (pH 8,4), 63,5 mM NaCl, 31,5 mM KCl, 6,35 mM MgCl2, 1,27 mM MgSO4, 6,35 mM (NH4)2SO4, 63,5 μ g/ml BSA, 0.0635 % Tween 20.
Parte del Kit de Demostración Apta-beacon Tubo 2-2.
HeminSigma-AldrichH9039Resuspendido en DMF a una concentración final de 25 uM.
Suministrado en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 3-1.
Tampón de amplificación isotérmicaNew England Biolabs B0537SVIALcombinado con 2 uL de tampón 10x 3.1 y 27.5 µ L de agua libre de nucleasas para producir 1.11x EXPAR Buffer en EXPAR Mix.
Parte del Tubo 2-2 del Kit de Demostración Apta-beacon.
MgCl2Amresco (VWR)E525-500MLCofactor de ribozima cabeza de martillo, necesario para la autoescisión.
Parte del kit de demostración Apta-beacon Tubo 1-3.
Termociclador MJ PTC-100MJ Research, Inc.PTC-100Termociclador para controlar las temperaturas de incubación. Se puede utilizar cualquier termociclador o bloque caliente.
N, N-dimetilformamida (DMF)Sigma-Aldrich227056-100MLSe utiliza para resuspender la hemina y maximizar la vida útil en el congelador.
Parte del kit de demostración Apta-beacon Tubo 3-1.
Mezcla de níquesa-polimerasaAptagen, LLCN/ANt.BstNBI (9.375 unidades/μ L) y ADN polimerasa Bst 2.0 (0.5 unidades/μ L).
suministrado en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 2-1.
Nt.BstNBINew England BiolabsR0607SEnzima de corte para permitir la amplificación isotérmica continua. Parte de la mezcla de níquea-polimerasa, preparada a 0,5 U/uL.
Parte del tubo 2-1 del kit de demostración Apta-beacon.
T4 Kinase BufferNew England Biolabs B0201SVIALTampón para la enzima necesaria para eliminar el fosfato cíclico.
Parte del kit de demostración Apta-beacon Tubo 1-4.
Polinucleótido quinasa T4New England BiolabsM0201SElimina el fosfato cíclico después de la escisión para permitir que el producto de escisión prepare la reacción de amplificación isotérmica.
Se suministra en el kit de demostración Apta-beacon como tubos de PCR.
Tecan GENios FLTecanGenios-FL TWTLector de placas para medir la señal de absorbancia de los resultados del Paso 3.
Objetivo de aptámero TheophyllineSigma-AldrichT1633-50G, preparado con agua libre de nucleasas.
Se suministra en el kit de demostración Apta-beacon como tubo 1-2.
Tris-HClAmerican BioanalyticalAB14043-01000Tampón de unión a aptámeros.
Parte del tubo del kit de demostración de Apta-beacon 1-4.
de

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ellington, A. D., Szostak, J. W. In vitro selection of RNA molecules that bind specific ligands. Nature. 346 (6287), 818-822 (1990).
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