El análisis del líquido sinovial bajo microscopía de luz transmitida, polarizada y compensada se utiliza para evaluar la naturaleza inflamatoria o no inflamatoria de una muestra a través de pasos simples. Es particularmente útil en la osteoartritis para detectar cristales de calcio e identificar un subconjunto más grave de osteoartritis.
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Análisis del líquido sinovial para identificar la osteoartritis
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Resumen
Resumen
El análisis del líquido sinovial (SF) es importante para diagnosticar la osteoartritis (OA). Las características macroscópicas y microscópicas, incluido el recuento total y diferencial de glóbulos blancos (WBC), ayudan a definir la naturaleza no inflamatoria de SF, que es un sello distintivo de OA. En pacientes con OA, los leucocitos en muestras de SF generalmente no exceden las 2000 células por microlitro, y el porcentaje de células inflamatorias, como los neutrófilos, es muy bajo o está ausente. Los cristales de calcio son frecuentes en SF recogidos de pacientes con OA. Aunque su papel en la patogénesis de la OA sigue sin estar claro, se han asociado con un proceso inflamatorio leve y una progresión más grave de la enfermedad. Recientemente, se han descrito cristales de calcio tanto en las etapas tempranas como tardías de la OA, lo que indica que pueden desempeñar un papel vital en el diagnóstico de diferentes subconjuntos clínicos de OA y tratamiento farmacológico. El objetivo general del análisis de SF en OA es doble: determinar el grado no inflamatorio de SF y resaltar la presencia de cristales de calcio.
Introducción
La osteoartritis (OA) es una enfermedad articular crónica compleja y multifactorial, con una prevalencia global agrupada estimada del 16% en sujetos de 15 años o más, y del 23% en sujetos de 40 años o másde 1. Se espera que la incidencia de OA aumente debido al envejecimiento de la población y al aumento de los factores de riesgo, como la obesidad y el síndrome metabólico2.
Entre los principales problemas asociados con la OA se encuentran la dificultad para diagnosticar la enfermedad en sus primeras etapas y los tratamientos actualmente disponibles limitados al manejo del dolor y los medicamentos sintomáticos de acción lenta (SYSADOA) como los glicosaminoglicanos. El diagnóstico de OA se basa en los síntomas clínicos y los hallazgos de imágenes. Sin embargo, la falta de correlación entre las dos evaluaciones puede causar años de retraso en el diagnóstico de OA y el inicio del tratamiento2. La OA se caracteriza por procesos degenerativos e inflamación de bajo grado, que pueden investigarse fácilmente mediante el análisis del líquido sinovial (SF). SF es un dializado plasmático viscoso rico en ácido hialurónico, que lubrica el espacio articular, proporciona nutrientes y oxígeno al cartílago y elimina los desechos metabólicos. SF también actúa como un amortiguador, protegiendo así las articulaciones durante el estrés y la tensión3.
El análisis de SF es un método simple y confiable que siempre debe realizarse durante la evaluación inicial de pacientes con síntomas musculoesqueléticos y derrames articulares3. Las recomendaciones del Colegio Americano de Reumatología, la Sociedad Británica de Reumatología y otros incluyen el análisis de SF entre las pruebas diagnósticas para enfermedades reumáticas que deben realizarse principalmente en la evaluación de la monoartritis aguda 4,5. Los recuentos leucocitarios totales y diferenciales obtenidos del análisis de SF proporcionan una instantánea del proceso patológico que ocurre en la articulación, clasificando así el grado de inflamación. La identificación de cristales patógenos, como los cristales de urato monosódico (MSU) y pirofosfato de calcio (CPP), bajo luz polarizada, es vital en el diagnóstico y tratamiento de la artritis cristalina (por ejemplo, gota y pseudogota). Además, la presencia de microorganismos sugiere un diagnóstico de artritis séptica.
Los cristales de calcio son frecuentes en muestras recogidas de pacientes con OA6. Se han notificado cristales básicos de fosfato de calcio (BCP) y PPC en aproximadamente el 22% y el 23% de las muestras de SF, respectivamente, de pacientes con OA6. Aunque su papel sigue sin estar claro, estos cristales se han asociado con formas más graves de OA7 y se consideran un epifenómeno del proceso patológico en sí. Se han detectado cristales de calcio en el 100% de las muestras de tejido de pacientes con OA sometidos a reemplazo de rodilla8. Además, se ha planteado la hipótesis de que los cristales de calcio pueden estar implicados en la patogénesis de la OA debido a sus efectos inflamatorios, demostrados por varios estudios9 y mediados, al menos en parte, por el inflamasoma NLRP310.
Más recientemente, se han descrito cristales de calcioen las etapas 6 tempranas y tardías de la OA, lo que indica que pueden desempeñar un papel vital en el diagnóstico de diferentes subconjuntos clínicos de OA y tratamiento farmacológico.
El objetivo general del análisis de SF es doble: determinar el grado inflamatorio de SF y diagnosticar la artritis cristalina o séptica mediante la identificación de cristales o microorganismos específicos. Es una herramienta particularmente útil, simple y confiable para diagnosticar la OA, debido al patrón no inflamatorio típico con un porcentaje muy bajo o ausencia de neutrófilos.
Ventajas sobre técnicas alternativas
El análisis de SF consiste en procedimientos simples que incluyen recuentos de leucocitos totales y diferenciales y búsqueda de cristales. El recuento manual de células realizado por técnicos de laboratorio expertos 3,11 sigue siendo el estándar de oro para el análisis citológico de los fluidos sinoviales y otros fluidos corporales. Sin embargo, debido a la limitación de tiempo y a la variabilidad inter e intraobservador de este método, los contadores celulares automatizados han reemplazado gradualmente el conteo manual en grandes laboratorios clínicos de rutina donde los analizadores de sangre y orina han sido adaptados para permitir el análisis de SF11,12. Sin embargo, el conteo manual presenta algunas ventajas en entornos específicos: (1) en el ambulatorio, para obtener un valor total y diferencial de leucocitos en el tiempo; (2) identificar tipos de células como células mononucleares citofagocíticas (Reiter) o células no hematopoyéticas como sinoviocitos, que los contadores automatizados no pueden reconocer; (3) cuando la muestra es demasiado pequeña para ser manipulada por el instrumento; (4) crear registros de laboratorios locales que sean fácilmente accesibles para fines de investigación. Otra ventaja del conteo manual se ve en la tinción supravital, un método que permite la diferenciación de células muy rápidamente e inmediatamente después de la preparación del portaobjetos de vidrio. Por el contrario, las tinciones tradicionales, como los procedimientos de Wright y May-Grünwald-Giemsa, requieren frotis de SF secados al aire y tiempo para teñir las células13. Aunque no son adecuados para análisis de rutina sensibles al tiempo, estos métodos de tinción revelan poblaciones celulares más detalladas en la muestra, incluidos eritrocitos, basófilos, eosinófilos, leucocitos polimorfonucleares, linfocitos y plaquetas.
Finalmente, el análisis rutinario de SF para cristales se realiza utilizando una técnica simple basada en microscopía de luz polarizada, que proporciona resultados rápidos14. Los métodos alternativos, como el barrido y la microscopía electrónica, producen resultados más precisos y sensibles, pero su uso en la práctica clínica diaria no es factible debido a los altos costos y la preparación y el análisis de muestras que consumen mucho tiempo.
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Protocolo
El presente protocolo cumple con las directrices del Comité de Ética del Hospital Universitario de Padua. La SF se recogió con el consentimiento del paciente de las articulaciones de la rodilla de los pacientes que recibieron artrocentesis terapéutica para derrame articular en su presentación inicial a la clínica o en respuesta a un brote artrítico. Las contraindicaciones para el procedimiento fueron: coagulopatía, medicamentos anticoagulantes, lesiones cutáneas, dermatitis o celulitis que recubre la articulación. Todas las muestras de SF fueron desidentificadas.
1. Preparación del líquido sinovial
- Transfiera las muestras de SF recogidas durante la artrocentesis de articulaciones inflamadas15 a un tubo que contenga anticoagulante (preferiblemente EDTA; ver Tabla de materiales) y a un segundo tubo que no contenga aditivo (Figura 1).
- En casos sospechosos de infección, transfiera asépticamente una porción de la muestra de SF (~ 1 ml) a botellas de cultivo para pruebas microbiológicas.
NOTA: La infección puede sospecharse como resultado de características clínicas (tumor grave, dolor, calor, functio laesa y, a veces, fiebre) y apariencia macroscópica del SF (turbidez, color). En este caso, el médico prescribe un análisis microbiológico, que es realizado por un laboratorio de microbiología. - Realice el análisis de SF (pasos 2-5) tan pronto como se recoja la muestra.
2. Examen macroscópico
NOTA: La evaluación macroscópica de muestras de SF consiste en evaluaciones subjetivas, cualitativas y semicuantitativas. No hay escalas estándar de referencia y no se utilizan muestras de control.
- Anote el volumen de SF expresado en mililitros. Defina el color de la muestra, que puede variar de amarillo pálido a amarillo oscuro. Registre la presencia de sangre.
- Defina el grado de claridad observando la muestra a contraluz y determinando la facilidad de lectura de una página impresa a través del tubo fluido (Figura 2A).
- Evalúe la viscosidad goteando la muestra de una pipeta desechable. Una cadena larga o formación de gota indica viscosidad buena o mala, respectivamente (Figura 2B).
- Evalúe la presencia de materiales particulados, incluidos fragmentos de tejido o fibrina, observando la muestra a través del tubo y a contraluz.
3. Examen microscópico
NOTA: El análisis microscópico SF consiste en un examen citológico, que incluye el recuento total y diferencial de glóbulos blancos (WBC) y la búsqueda de cristales.
- Determine el recuento total de células siguiendo los pasos que se indican a continuación.
- Determinar el número total de leucocitos en el SF recolectados en el tubo EDTA usando un hemocitómetro (ver Tabla de materiales).
- Extraiga 0,5 μL del SF del tubo EDTA utilizando una pipeta Malassez-Potain (marca 0,5; ver Tabla de materiales) (Figura suplementaria 1). Con la misma pipeta, extraer 9,5 μL de solución de azul de metileno al 0,1% (marca 11). La dilución final es 20 veces.
- Mezclar la pipeta por inversión suave, desechar las primeras gotas y verter el líquido sinovial + solución de azul de metileno en la cámara de conteo.
- Cuente las celdas en dos cuadrados consecutivos de nueve, y multiplique el número obtenido por 100 (fórmula simplificada; Figura complementaria 2). Exprese los glóbulos blancos como el número de leucocitos por milímetro cúbico.
NOTA: Fórmula simplificada: Leucocitos (N/mm3) = el número de células contadas en dos cuadrados consecutivos x 100. - Clasificar el SF según el número total de leucocitos siguiendo los informes publicados previamente16,17 (Tabla 1).
- Realizar recuento diferencial de células.
- Determinar el porcentaje de células polimorfonucleares (PMN), monocitos y linfocitos mediante tinción supravital o tradicional13,18.
- Para la tinción supravital, coloque una pequeña gota de SF en el centro de un portaobjetos listo para usar pre-recubierto con violeta de cresilo y azul de metileno (Figura suplementaria 3; ver Tabla de materiales).
- Cubra con un cubreobjetos y coloque una gota de aceite de inmersión de microscopio.
- Prepare un frotis de SF secado al aire para la tinción tradicional (menos adecuado para el análisis de rutina). Ponga una pequeña gota de SF al final de un tobogán limpio. Usando una segunda diapositiva o un cubreobjetos, extiéndalo a lo largo de la diapositiva con un movimiento hacia adelante. Deje que la mancha se seque al aire.
- Tinción de la muestra según un procedimiento estándar de May-Grünwald-Giemsa18.
- Examine la diapositiva debajo del objetivo de inmersión en aceite (1,000x).
- Contar 100 células consecutivas y distinguir entre células polimorfonucleares, monocitos y linfocitos (Figura 3, Figura complementaria 4).
- Exprese el número total en cada categoría como un porcentaje.
NOTA: Para obtener resultados precisos, los exámenes citológicos deben realizarse tan pronto como se recolecte el SF o dentro de las 24-48 h posteriores a la artrocentesis, cuando se almacene adecuadamente (4 °C).
4. Detección de cristales
- Determinar la presencia de cristales patológicos utilizando un microscopio de luz polarizada equipado con un filtro polarizador adicional y un compensador rojo19 (ver Tabla de materiales).
- Realice la preparación de la diapositiva para la detección de cristales.
- Limpie cuidadosamente un portaobjetos de vidrio con papel óptico o papel blando embebido con etanol. Aplique una pequeña gota de SF en el portaobjetos de vidrio.
- Cubra con un cubreobjetos y coloque el portaobjetos bajo el microscopio.
- Identifica los cristales.
- Enfoque el portaobjetos bajo el microscopio utilizando un objetivo de aumento de baja potencia. Examine cuidadosamente la diapositiva bajo un campo brillante con un objetivo de 40x. Mire dentro y fuera de las celdas.
- Identifique los cristales de acuerdo con su tamaño y forma (por ejemplo, romboidales, en forma de aguja, en forma de varilla).
- Inserte el filtro polarizador entre la fuente de luz y la muestra. Gire el polarizador hasta que su eje óptico sea perpendicular al analizador (colocado por encima de los objetivos) para crear un fondo oscuro.
- Una vez que se haya identificado un cristal birrefringente, inserte el compensador entre el polarizador y la muestra y muévalo paralelo o perpendicular al eje óptico del cristal.
- Observe el color revelado por el cristal (Tabla 2).
NOTA: Los cristales MSU aparecen en forma de aguja, brillantemente birrefringentes en el campo oscuro, y muestran un color amarillo / naranja cuando su eje es paralelo al compensador. Por el contrario, son azules cuando se colocan perpendiculares (signo negativo) (Tabla 2; Figura 4). Los cristales de CPP son cristales en forma de bastón o romboide, débilmente birrefringentes bajo luz polarizada, y muestran un color azul o amarillo cuando están alineados paralelos o perpendiculares al eje del compensador (signo positivo), respectivamente (Tabla 2; Figura 5).
5. Tinción de rojo alizarina
- Prepare una solución al 2% de rojo de alizarina S (pH 4.1-4.3), filtre la solución a través de un filtro de 0.22 μm y guárdela lejos de la luz.
- Para preparar el portaobjetos, mezcle una gota de SF con el mismo volumen de solución roja de alizarina (1:1) en un portaobjetos limpio. Cubra con un cubreobjetos y examine con un aumento de 400x.
- Identifique los cristales bajo el microscopio.
NOTA: La prueba es positiva cuando los precipitados brillantes de color rojo oscuro son visibles bajo luz transmitida, con una forma redonda y capas concéntricas. Bajo luz polarizada, aparecen fuertemente birrefringentes20 (Figura 6).
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Resultados
Las articulaciones grandes afectadas por la OA a menudo están hinchadas y producen cantidades significativas de SF, que se drenan a través de la artrocentesis15. Las características macroscópicas de la SF evaluadas inmediatamente después de la artrocentesis incluyen esencialmente la cantidad, el color, la claridad y la viscosidad17. A pesar de su baja especificidad, proporcionan datos preliminares sobre el grado de inflamación. El color depende de la celularidad SF...
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Discusión
En la OA, el análisis de SF ayuda a definir las características de la enfermedad a través de pasos simples: recuentos leucocitarios totales y diferenciales y búsqueda de cristales, incluyendo CPP y BCP. Además, la detección de cristales de MSU puede resaltar comorbilidades importantes.
A pesar de los bajos costos y la ejecución simple, la sensibilidad de las pruebas y la confiabilidad de los resultados pueden verse afectadas debido a analistas inexpertos, principalmente en lo que respecta a la...
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Divulgaciones
Todos los autores no revelan conflictos de intereses.
Agradecimientos
Los autores desean reconocer al profesor Leonardo Punzi por su valiosa tutoría en el campo del análisis del líquido sinovial y al Hospital Universitario de Padua por su apoyo.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Rojo de alizarina S | Merck | A5533 | Para BCP búsqueda de cristal |
| Cámara Burker | Merck | BR718905 | Para el recuento total de glóbulos blancos |
| Cubreobjetos | Merck | C7931 | Para examen microscópico |
| Tubos de EDTA | BD | 368861 | Para la colección SF |
| Toboganes de vidrio | Merck | S8902 | Para búsqueda de cristal |
| Filtro lambda (compensador) | Cualquiera | Consulte a la compañía de microscopios | para la identificación de cristales |
| Pipeta Malassez-Potain | Artiglass | 54830000 | Para dilución de líquido sinovial Solución de azul de |
| metileno | Merck | 3978 | Para recuento total de glóbulos blancos |
| Microscopio polarizado | Leica, Nikon, otros | Según el modelo y la empresa Para un | análisis completo del líquido sinovial |
| Lente polarizadora | Any | Consulte a la compañía de microscopios | para la identificación de cristales |
| Testsimplet | Waldeck | 14386 | Tinción supravital para la diferenciación celular |
Referencias
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Reimpresiones y permisos
