Designa en bioreaktor för att förbättra datainsamling och modellera genomströmning av konstruerad hjärtvävnad

Summary

Tredimensionell hjärtvävnad som biokonstruerats med hjälp av stamcellshärledda kardiomyocyter har dykt upp som lovande modeller för att studera friskt och sjukt humant myokardium in vitro samtidigt som man rekapitulerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen. Detta manuskript beskriver ett protokoll för tillverkning och analys av högteknologisk hjärtvävnad genererad från humana inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter.

Abstract

Hjärtsvikt är fortfarande den vanligaste dödsorsaken i världen, vilket skapar ett stort behov av bättre prekliniska modeller av det mänskliga hjärtat. Vävnadsteknik är avgörande för grundvetenskaplig hjärtforskning; In vitro human cellodling eliminerar skillnaderna mellan arterna i djurmodeller, medan en mer vävnadsliknande 3D-miljö (t.ex. med extracellulär matris och heterocellulär koppling) simulerar in vivo-förhållanden i större utsträckning än traditionell tvådimensionell odling på petriskålar av plast. Varje modellsystem kräver dock specialutrustning, till exempel specialdesignade bioreaktorer och funktionsbedömningsenheter. Dessutom är dessa protokoll ofta komplicerade, arbetsintensiva och plågas av att de små, ömtåliga vävnaderna misslyckas.

Denna artikel beskriver en process för att generera ett robust humant konstruerat hjärtvävnadsmodellsystem (hECT) med hjälp av inducerade pluripotenta stamcellshärledda kardiomyocyter för longitudinell mätning av vävnadsfunktion. Sex hECT:er med linjär bandgeometri odlas parallellt, där varje hECT är upphängd i ett par kraftavkännande polydimetylsiloxanstolpar (PDMS) fästa vid PDMS-rack. Varje inlägg är täckt med en svart PDMS stabil postspårare (SPoT), en ny funktion som förbättrar användarvänligheten, genomströmningen, vävnadsretentionen och datakvaliteten. Formen möjliggör tillförlitlig optisk spårning av stolpavböjningar, vilket ger förbättrade ryckkraftsspårningar med absolut aktiv och passiv spänning. Kapsylgeometrin eliminerar vävnadsfel på grund av att hECT:er glider av stolparna, och eftersom de involverar ett andra steg efter PDMS-racktillverkning kan SPoTs läggas till befintliga PDMS-efterbaserade konstruktioner utan större förändringar i bioreaktortillverkningsprocessen.

Systemet används för att demonstrera vikten av att mäta hECT-funktionen vid fysiologiska temperaturer och visar stabil vävnadsfunktion under datainsamlingen. Sammanfattningsvis beskriver vi ett state-of-the-art modellsystem som reproducerar viktiga fysiologiska förhållanden för att främja biotrohet, effektivitet och noggrannhet hos konstruerad hjärtvävnad för in vitro-applikationer .

Introduction

Konstruerade hjärtvävnadsmodeller finns i en mängd olika geometrier och konfigurationer för att rekapitulera olika aspekter av den ursprungliga hjärtnischen som är svåra att uppnå med traditionell tvådimensionell cellodling. En av de vanligaste konfigurationerna är den linjära vävnadsremsan^, med flexibla ankare i varje ände för att inducera självorganisering av vävnaden och förse vävnaden med en definierad förspänning och en avläsning av de resulterande ryckkrafterna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11, 12,13,14,15,16,17,18,19,20,21
^,22,23,24,25,26,27. Den genererade kraften kan bestämmas på ett robust sätt genom optisk spårning av vävnadsförkortningen och med hjälp av elastisk strålteori för att beräkna kraften från de uppmätta avböjningarna och fjäderkonstanten för ankarna 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11^, 12,13,14,15,16,17,18,19,20^,
21,22,25,26,28.

Hjärtvävnadsteknik är dock fortfarande ett område under utveckling, och vissa utmaningar kvarstår. Specialiserad utrustning, såsom specialtillverkade bioreaktorer och funktionsbedömningsanordningar, krävs för varje modellsystem 10,29,30,31. Storleken och komplexiteten hos mikromiljön för dessa konstruktioner begränsas ofta av låg genomströmning på grund av arbetsintensiva protokoll, ett stort antal celler och vävnadsbräcklighet. För att ta itu med detta har vissa grupper vänt sig till tillverkning av mikrovävnader som endast innehåller hundratals eller tusentals celler för att underlätta analyser med hög genomströmning som är användbara för läkemedelsupptäckt. Denna reducerade skala komplicerar dock den exakta bedömningen av funktion¹², eliminerar viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen (såsom närings-/syrediffusionsgradienter och komplex arkitektur³⁶) och begränsar mängden material som är tillgängligt för efterföljande molekylär och strukturell analys (vilket ofta kräver poolning av vävnaderna). Tabell 1 sammanfattar några av konfigurationerna av linjära vävnadsremsmodeller i litteraturen 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15^, 16,17,18,19,20^,
21,22,23,24,25,26,37,38,39,40.

Grupp		Celler per vävnad	Vävnader per platta	Plattans format		Funktion för förankring		Funktionell datainsamlingsmetod		Delat mediabad?	Funktionellt mått- på plats?
Yoshida (ECT)38		4 miljoner	6	Modifierad 6-hålsplatta*		Kraftgivare		Direkt kraftmätning		Nej	Nej
Chan (hESC-CM-ECT)26		310 k-lopp	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-inlägg		Direkt kraftmätning		Ja	Nej
Feinberg (dyn-EHT)16		1,5 miljoner	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-kabel		vävnadens form		Nej	Ja
RADISIC (BioWire)39, 40		110 km-lopp	8			Tråd av polymer		Trådens form		Ja	Ja
Costa (enkel hECT)1, 2		1-2 miljoner	4**	10 cm petriskål**		PDMS-inlägg		Optisk avböjning (kant-/objektspårning)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT)3–9		500 K-1 miljon	6	6 cm petriskål		PDMS-inlägg		Optisk avböjning (kant-/objektspårning)		Ja	Ja
Costa (multi-hECT med SPoT)		1 miljon	6	6 cm petriskål		PDMS-stolpar med svarta lock		Optisk avböjning (objektspårning)		Ja	Ja
Passier (EHT)17		245 k-lopp	36	Tallrik med 12 brunnar		PDMS-stolpar med svarta lock		Optisk avböjning (objektspårning)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic13, 18		1 miljon	12	6 cm petriskål		PDMS-stolpar med lock		Optisk avböjning (kantdetektering)		Ja	Ja
Vunjak-Novakovic (MilliPillar)14		550 km-lopp	6	anpassad 6-brunns maträtt		PDMS-stolpar med lock		optisk avböjning (objektspårning); Kalcium avbildning		Nej	Ja
Eschenhagen (EHT)10, 19–21		1 miljon	12	Tallrik med 12 brunnar		PDMS-stolpar med lock		optisk avböjning (kantdetektering av efterböjning); Kalcium avbildning		Nej	Ja
Zandstra (CaMiRi)22		25-150 km-lopp	96	Platta med 96 brunnar		PDMS-stolpar med krokar		Optisk avböjning (kantdetektering)		Nej	Ja
Murry23, 24		900 km-lopp	24	Tallrik med 24 brunnar		PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet		Magnetisk sensor		Nej	Ja
Reich (μTUG)11, 12, 25		odefinierad	156	Skål med 156 brunnar		PDMS-stolpar med lock, integrerad magnet		Optisk spårning (fluorescerande pärla)		Ja	Ja

Tabell 1: Karakteristika för några linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen. Linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller varierar i storlek, genomströmning, förankringsfunktionsdesign och underlättande av delade mediumbad, samt kraven på ett separat muskelbadsystem för funktionell karakterisering. * Forskarna använde ett kommersiellt tillgängligt konstruerat vävnadssystem baserat på måtten på en standard 6-hålsplatta. ** Ett modulärt system där bioreaktorer med en enda vävnad förankras i valfri plastodlingsskål i önskat antal och på önskad plats.

Denna artikel beskriver det senaste protokollet för tillverkning av vår etablerade modell av linjär humaniserad hjärtvävnad (hECT)1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 och metoder för att bedöma hECT:s kontraktila funktion. Varje bioreaktor med flera vävnader rymmer upp till sex hECT:er i ett gemensamt mediumbad och består av två "rack"-bitar gjorda av silikonelastomeren polydimetylsiloxan (PDMS) monterad på en styv polysulfonram. Varje PDMS-rack innehåller sex flexibla integrerade kraftavkännande stolpar som är 0,5 mm i diameter och 3,25 mm långa, och tillsammans ger två rack sex par stolpar, som var och en rymmer en hECT. Inversion av bioreaktorn hjälper till att övervinna eventuella hinder för visualisering av hECT:erna underifrån på grund av vattenkondensation från odlingsmediet eller distorsioner från menisken i luft-vätskegränssnittet. Varje sammandragning av en hECT orsakar avböjning av de integrerade ändstolparna, och den optiska mätningen av avböjningssignalen bearbetas till en kraft- kontra tidsspårning som representerar hECT:s sammandragningsfunktion 1,2,3,4,5,6,7,8,9,15,27 . Jämfört med de bioreaktorer med en enda vävnad som vanligtvis används för vävnader av denna storlek, förbättrar designen med flera vävnader den experimentella genomströmningen och möjliggör studier av parakrin signalering mellan intilliggande vävnader med potentiellt olika cellulär sammansättning. Detta system har validerats i publicerade studier som beskriver tillämpningar inom sjukdomsmodellering ^4,8, parakrin signalering ^6,7, heterocellulär odling ^5,9 och terapeutisk screening ^7,9.

I detta system är hECT:erna utformade för att vara cirka 6 mm långa och 0,5 mm i diameter för att underlätta robust optisk spårning av kraftmätningar med lågt brus. Dessutom balanseras aspekter av vävnadskomplexitet såsom diffusionsgradienter och cellulär organisation med ett hanterbart behov av 1 miljon celler per vävnad. Med standard CCD-kamerateknik genererar krafter så svaga som 1 μN (vilket motsvarar mindre än 5 μm efterböjning) en tydlig signal, vilket säkerställer att även extremt svag kontraktil funktion, som observerats med vissa hECT-sjukdomsmodeller, kan mätas exakt. Detta underlättar också den detaljerade analysen av ryckkraftskurvan, vilket möjliggör analys med högt innehåll av upp till 16 kontraktilitetsmått⁴¹, inklusive utvecklad kraft, kontraktionshastigheter (+dF/dt) och relaxation (−dF/dt) och variationsfrekvens i svävningshastigheten.

Detta protokoll börjar med instruktioner för tillverkning av bioreaktorkomponenterna. Särskild uppmärksamhet ägnas åt stegen för att maximera hECT-utbytet, minska den tekniska variationen i vävnadsfunktionen och optimera kvaliteten och djupet i vävnadsbedömningen. De flesta studier av hjärtvävnadsteknik rapporterar inte vävnadsförlust under tillverkning och långtidstestning, även om det är en välkänd utmaning inom området och^{minskar genomströmningen} och effektiviteten i studierna. De vävnadstekniska metoder som beskrivs här har förfinats under årens lopp för att säkerställa retention av alla hECT:er i de flesta bioreaktorer (oavsett hur PDMS-racken är tillverkade). Men även en förlust av vävnader på 5–20 % kan avsevärt påverka den statistiska styrkan, särskilt i mindre experiment som begränsas av antalet tillgängliga kardiomyocyter (t.ex. på grund av differentieringsutmaningar med vissa sjuka cellinjer⁴ eller på grund av den höga kostnaden för kommersiellt inköpta kardiomyocyter), eller av behandlingstillståndet (t.ex. begränsad tillgänglighet eller höga kostnader för olika behandlingsföreningar).

Detta protokoll beskriver tillverkningen av stabila postspårare (SPoTs), en ny funktion i PDMS-racken, som fungerar som lock i ändarna av de kraftavkännande stolparna som håller hECTs²⁷. Det demonstreras hur lockets geometri avsevärt minskar hECT-förlusten från att falla eller dra av stolparna, vilket öppnar nya möjligheter för att odla hECT med en större variation av styvheter och spänningar, vilket är utmanande att odla på otäckta stolpar. Dessutom ger SPoTs ett objekt med hög kontrast för att förbättra den optiska spårningen av hECT-kontraktionen genom en konsekvent och väldefinierad form²⁷. Detta följs av en beskrivning av odling av humana inducerade pluripotenta stamceller (iPSC) och kardiomyocytdifferentiering baserat på tidigare publicerade protokoll ^3,42,43 och en förklaring av hECT-tillverkning, odling och funktionella mätningar.

Den här artikeln tar också upp behovet av att mäta vävnadsfunktion vid fysiologisk temperatur. Humant myokardium (frisk och sjuk vävnad hos foster och vuxna) samt hjärtvävnad från ett brett spektrum av djurarter (inklusive råttor, katter, möss, illrar och kaniner)^44,45, uppvisar en markant ökning av den frekvensmatchade ryckkraften vid temperaturer på 28 °C–32 °C jämfört med fysiologisk temperatur – ett fenomen som kallas hypotermisk inotropi^{45. 46}. veckor Effekterna av temperatur på den konstruerade myokardvävnadens funktion är dock fortfarande understuderade. Många nyare konstruerade hjärtvävnadsmodeller i litteraturen är utformade för att bedömas funktionellt vid 37 °C för att approximera fysiologiska förhållanden 13,14,37. Såvitt vi vet har dock de temperaturberoende effekterna på den kraft som genereras av konstruerad hjärtvävnad inte undersökts systematiskt. Detta protokoll beskriver en stimuleringselektroddesign som minimerar värmeförlusten under testningen, samt möjliggör införlivande av ett isolerat värmeelement i installationen för funktionella mätningar, vilket kan hålla hECT:erna vid fysiologisk temperatur utan att kompromissa med steriliteten²⁷. Vi rapporterar sedan några av de observerade effekterna av temperatur på hECT-funktionen, inklusive på den utvecklade kraften, spontan slagfrekvens, +dF/dt och −dF/dt. Sammantaget ger denna artikel de detaljer som krävs för att tillverka detta kraftavkännande bioreaktorsystem för att tillverka mänsklig hjärtvävnad och för att bedöma deras kontraktila funktion, och en uppsättning data presenteras som ger en grund för jämförelse för mätningar vid rumstemperatur och vid 37 °C²⁷.

Protocol

Detta protokoll använde en avidentifierad iPSC-linje, SkiPS 31.3 (ursprungligen omprogrammerad med hjälp av dermala fibroblaster från en frisk 45-årig man)⁴⁷, och var därför undantagen från specifikt godkännande från Institutional Review Board, i enlighet med institutionens riktlinjer för humanforskningsetiska kommittéer. Utför all cell- och hECT-manipulation under aseptiska förhållanden i ett HEPA-filtrerat biologiskt säkerhetsskåp av klass II eller arbetsbänk med laminärt flöde. Sterilisera alla icke-sterila lösningar genom filtrering genom ett 0,22 μm filter och håll alla celler och hECT i en inkubator vid 37 °C, 95 % relativ luftfuktighet och 5 % CO₂ .

1. Tillverkning av bioreaktorer

1. Bioreaktorkomponenter och tillverkning av mastergjuten aluminium
   OBS: CAD-filer (Computer-aided design) finns i tilläggsfil 1. Protokollet kan pausas var som helst mellan dessa steg. Det rekommenderas att anlita en professionell maskinist för att tillverka huvudformarna som beskrivs i detta avsnitt, eftersom höga toleranser (≤5 μm) och en slät yta krävs för exakt stolpgeometri och för korrekt presspassning av polysulfonramarna till basplattorna av polytetrafluoreten (PTFE) (syftar till en tät friktionspassning, men inte för hårt).
   1. Använd en CNC-fräs (Computer Numerical Control) för att bearbeta bottenplattan ur PTFE enligt schemat i figur 1A. HECT:erna kommer att bildas i de sex jämnt fördelade brunnarna (vita pilar).
   2. Använd en CNC-fräs för att bearbeta rackets negativa mastergjutning av polydimetylsiloxan (PDMS) av aluminium enligt schemat i figur 1B, med tre ramstöd (gröna asterisker). Borra sex jämnt fördelade hål (magenta pilspetsar) med en diameter på 0,5 mm för att skapa PDMS-stolparna.
   3. Använd en CNC-fräs och bearbeta bioreaktorramen av polysulfoner enligt schemat i figur 1C. Ramstöden (gröna asterisker) motsvarar ramstöden som syns i rackgjutningen (Figur 1B, gröna asterisker).
   4. Använd en CNC-fräs och bearbeta den gjutna aluminiumhållaren av aluminium enligt schemat i figur 1D. Varje fack innehåller en triangulär hylla (orange triangel) som är 0,25 mm hög för att ge ett dödutrymme för PDMS att flöda genom hålen i PDMS-rackgjutningarna (Figur 1B, magenta pilspetsar).
2. Gjutning av PDMS-racket från aluminiumnegativmasterna
   1. Använd en termoplastisk 3D-skrivare för modellering av smält avsättning och skriv ut två PDMS-rackgjutningsapparatfästen (kompletterande File 1). Använd följande utskriftsinställningar: en skikthöjd på 0,1 mm, en vägg-/botten-/topptjocklek på 1 mm, en fyllnadsdensitet på 90 % med trianglar, en utskriftstemperatur på 230 °C, en byggplattetemperatur på 70 °C och ett brätte för vidhäftning.
   2. Placera fyra negativa mastergjutningar av aluminium i gjuthållaren (Figur 2AI) så att stolphålen är i linje med dödutrymmet mittemot triangelhyllorna (se figur 1D). Linda in apparaten i en rektangulär bit av 0.5 mm tjock silikonplåt (Figur 2B, vita pilar) som en packning för att förhindra läckage av vätskan PDMS och kläm fast den mellan två parallella 3D-printade fästen med en skruvklämma.
   3. Tillsätt 0,5 ml PDMS-härdare till 5 ml PDMS-elastomerbas (förhållande 1:10, enligt tillverkarens instruktioner) i en grund behållare och blanda kraftigt i 5 minuter. Avgasa PDMS-blandningen i en vakuumkammare och applicera ett starkt vakuum (0,1-1 kPa) i 20-60 minuter vid rumstemperatur eller tills bubblorna försvinner.
   4. Häll PDMS-blandningen på gjutapparaten och överfyll för att säkerställa att varje slits täcker hela spåret (figur 2AII). Om så önskas, lägg till små, färgade glaspärlor på PDMS-rackens kropp (Figur 2AII), motsatt sidan med stolparna (Figur 2B), för den unika identifieringen av varje PDMS-rack. Sätt tillbaka gjutapparaten i vakuumkammaren (se till att den är horisontellt jämn) och applicera ett starkt vakuum i minst 12 timmar. Låt PDMS härda i rumstemperatur i cirka 48 timmar bort från damm för att möjliggöra fullständig härdning och maximal styrka hos de ömtåliga stolparna. Undvik att använda en ugn eftersom det förvränger de 3D-printade komponenterna.
      OBS: Protokollet kan pausas här.
3. Borttagning av PDMS-rack från de negativa mastergjutna aluminiumerna
   1. Ta bort clamp, fästen och silikonplåt från gjutapparaten. Använd ett rakblad i rostfritt stål, trimma bort PDMS-filmen ovanpå gjutapparaten och ramstöden och använd försiktigt fingrarna för att separera PDMS-ställen från sidorna av gjuthållaren. Sätt in ett trubbigt rakblad i rostfritt stål i dödutrymmet mellan gjutgodset och gjuthållaren och bänd isär dem (Figur 2CI, II), se till att PDMS som fyller dödutrymmet förblir med gjuthållaren (eftersom denna är fäst vid stolparna). Använd ett vasst blad i rostfritt stål, skär bort de återstående PDMS-filmerna och skär dödutrymmet PDMS från spetsarna på stolparna (Figur 2C III-V).
   2. KRITISKT STEG: Frigör PDMS-racket från gjutningen (Figur 2D). Börja med sidan mittemot stolparna, använd fingrarna för att långsamt separera PDMS-racket från gipset, arbeta på varannan sida tills stolparna är fria från mastergjutningarna.
   3. Upprepa föregående steg tills alla PDMS-rack och alla stolpar har frigjorts. Använd ett vasst rakblad för att trimma bort eventuellt kvarvarande överflödigt PDMS från racken. Resultatet är ett PDMS-rack (Figur 2E) med sex intakta stolpar (orange pilspetsar) och färgade pärlor (blå pil) för identifiering.
      OBS: Protokollet kan pausas här.
4. Tillverkning av stabil posttracker (SPoT)
   1. Använd en termoplastisk 3D-skrivare för modellering av smält avsättning och skriv ut komponenterna i SPoT-gjutapparaten (kompletterande File 2 och figur 3AI, II). Använd följande utskriftsinställningar: en lagerhöjd på 0,1 mm, en vägg-/botten-/topptjocklek på 1 mm, en fyllnadsdensitet på 80 % med trianglar, en utskriftstemperatur på 230 °C, en byggplattetemperatur på 70 °C och ett brätte för vidhäftning.
   2. Säkerställ en säker presspassning mellan de 3D-utskrivna bitarna, såväl som mellan PDMS-racken och den treuddiga jiggen, och bekräfta att PDMS-racken passar tätt med stolparna som precis når botten av brunnarna utan att böjas. Trimma/fila plasten vid behov.
   3. Tillsätt 0,5 ml svart PDMS del A till 0,5 ml av del B (förhållande 1:1, enligt tillverkarens instruktioner) till en liten våg (eller en liknande liten, grund behållare) och blanda noggrant tills den är enhetlig i färgen. Avgasa den blandade svarta PDMS:en i en vakuumkammare under starkt vakuum i 20 minuter. Häll den avgasade svarta PDMS:en på den 3D-utskrivna basen för att fylla hålen och knacka för att säkerställa att inga bubblor finns kvar. Skrapa bort så mycket överflödig PDMS från basen som möjligt.
   4. Snäpp fast den treuddiga biten på basen och placera PDMS-ställen i spåren på den treuddiga jiggen (Figur 3AII, turkos rektangel), se till att ändarna på stolparna doppar sig i den svarta PDMS i de cirkulära brunnarna (Figur 3B, C). Härda den svarta PDMS:en i rumstemperatur och skyddad från damm i 48 timmar.
      OBS: Protokollet kan pausas här.
   5. Skjut ut den treuddiga delen, minimera spänningen på stolparna. Använd en liten pincett för att skrapa bort den tunna filmen av svart PDMS som omger varje SPoT; Sätt sedan in en böjd pincett med fin spets i SPoT-brunnen för att frigöra den från den 3D-utskrivna basen (Figur 3D).
   6. Inspektera SPoTs (Figur 3E) och klipp bort eventuell kvarvarande svart PDMS-film från gjutningsprocessen som inte togs bort i steg 1.4.5 med en fin Vannas-sax. Se till att de färdiga stolparna har rätt längd genom att montera PDMS-ställena på polysulfonramen och sedan skjuta den på den svarta bottenplattan (Figur 4A).
      OBS: Protokollet kan pausas här.
   7. Para ihop PDMS-racken och lägg till dem i ramen med hjälp av ramflikarna (Figur 4A). Autoklavera i en påse med en PTFE-basplatta i minst 30 minuters cykel (<122 °C för att minska skevhet).

Figur 1: hECT-bioreaktorkomponenter. (A) Ovanifrån (vänster) och sidan (höger) av PTFE-basplattan med sex jämnt fördelade brunnar för att bilda hECT (vita pilar). (B) Sidovy (vänster) och ovanifrån view (höger) av de negativa mastergjutna aluminiumerna för PDMS-racken med sex jämnt fördelade stolpar (magenta pilspetsar) och tre luckor för att fästa på bioreaktorramen (gröna asterisker). (C) Sidovy (vänster) och undersidan view (höger) av polysulfonramarna för PDMS-racken med tre jämnt fördelade ramstöd (gröna asterisker) som motsvarar ramstöden i PDMS-rackgjutningen (panel B). (D) Ovanifrån view (överst) och sidan view (botten) av aluminiumgjuthållaren med fyra slitsar för PDMS-rackgjutningarna, var och en med en 0.25 mm hög triangulär hylla (hyllan längst till vänster markerad i orange). Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: hECT = human engineered cardiac tissue; Ø = diameter; PTFE = polytetrafluoreten, PDMS = polydimetylsiloxan, R = radie. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 2: Tillverkning av PDMS-racken. (A) CAD-renderingar visar en sned bild av gjutningsapparaten. (I) En negativ PDMS-rackmastergjutning sätts in i var och en av de fyra skårorna på gjuthållaren med hålen som bildar PDMS-stolparna (magenta pilspetsar) placerade över dödutrymmet mittemot den triangulära hyllan (figur 1D, orange triangel). (II) PDMS hälls i varje hålrum i det negativa mastergjutet. (III) Färgade pärlor läggs till det ohärdade PDMS som ett färgkodat identifieringssystem. (B) Foto som visar den monterade PDMS-rackgjutningsapparaten, som är fastspänd på vardera sidan med två 3D-printade fästen som hålls på plats av en skruvklämma och lindas med 0.5 mm tjock silikonplåt (vita pilar) för att täta de fastspända sidorna. De färgade pärlorna placeras så att de inte täcker hålen med en diameter på 0,5 mm som bildar stolparna (magenta pilspetsar). (C) När PDMS har härdats tas gipset bort från gipshållaren. (I) Ett trubbigt rakblad av rostfritt stål eller liknande tunt metallverktyg sätts in mellan gipset och gjuthållaren för att bända bort gipset från gjuthållaren (II). (III) Filmen (turkosa fästen) som bildas av PDMS som flyter genom stolparnas hål är fäst vid stolparnas spetsar och måste skäras bort med ett vasst blad (IV,V). (D) PDMS-racket är separerat från gjutet. (E) Foton som visar sneda (överst), sida (mitten) och nedre (nederst) vyer av PDMS-racket med en glaspärla inbäddad i kroppen för identifiering (blå pil). Stolparnas spetsar (orange pilspetsar) har markerats med svart bläck. Skalstreck = 1 cm. Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: CAD = datorstödd konstruktion; PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 3: SPoT-tillverkning. (A) CAD-renderingar som anger nyckeldimensioner för (I) basen och (II) treuddiga delen av SPoT-gjutjiggen. Måtten på de cirkulära SPoT-formulären (AI, svarta pilar) anges som 0,2 mm djupa x 1,2 mm i diameter, och var och en innehåller den svarta PDMS:en för en enskild SPoT. Hyllan på 11,1 mm x 27 mm som syns i toppen view (AII, topp, turkos rektangel) är nedtryckt med 0,4 mm (som ses i sidovyn nedan) för att hålla PDMS-stället på plats under härdning. (B) CAD-rendering som visar monteringen av SPoT-gjutningsapparaten. (C) Ett foto av den monterade SPoT-gjutningsapparaten. (D) Efter att PDMS har härdat skjuts den treuddiga jiggen ut under PDMS-racken och SPoTs frigörs från sina brunnar med en fin pincett. (E) Foton av PDMS-racket utan (överst) och med (nederst) SPoTs. Indrag visar förstorade vyer av inläggen. Skalstreck = 1 cm (E), 2,5 cm (inzoomade bilder i av E). Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: CAD = datorstödd konstruktion; Ø = diameter; PDMS = polydimetylsiloxan, R = radie; SPoT = stabil post tracker. Klicka här för att se en större version av denna figur.

2. Cellodling

1. Odling av iPSC:er
   ANM.: Olika cellinjer kan kräva justeringar av passageutspädning och frekvens och/eller titrering av medietillsatserna.
   1. Bestryk en cellkulturbehandlad 6-hålsplatta med kvalificerad basalmembranmatris (utspädd i 1:1 Dulbecco's Modified Eagle Medium:Ham's F12 Nutrient Solution [DMEM/F12] enligt tillverkarens instruktioner) och inkubera plattan vid 37 °C i minst 30 minuter. Bered 500 ml iPSC-odlingsmedium enligt tillverkarens anvisningar och tillsätt 5 ml stamlösning av penicillin-streptomycin (10 000 IE/ml till 10 000 μg/ml).
   2. För att passera iPSC, aspirera mediet från brunnarna och tvätta varje brunn en gång med 1 ml fosfatbuffrad saltlösning (PBS). Tillsätt 1 ml iPSC-dissociationslösning per brunn och inkubera i en huv med laminärt flöde i 1 min.
   3. Aspirera iPSC-dissociationslösningen och inkubera cellerna vid 37 °C (utan medium) i 5 minuter. Tillsätt 1 ml 2 μM tiazovivin i iPSC-medium för att neutralisera iPSC-dissociationslösningen.
   4. Använd en 2 ml serologisk pipett för att dissociera kolonierna i klumpar om ungefär 10 celler och tvätta varje väl med ytterligare 1 ml 2 μM tiazovivin i iPSC-medium. Tillsätt 2 ml cellsuspension till varje brunn på plattan som nyligen belagts med basalmembranmatris (steg 2.1.1).
   5. Efter 24 timmar avlägsnar du mediet och tillsätter färskt iPSC-medium (utan tiazovin). Mata iPSC:erna var 48:e timme med 2 ml iPSC-medium eller var 72:e timme med 4 ml medium. Omplatta cellerna i en 1:6 utspädning för passering var 3:e dag eller när de når 80% sammanflöde.
      OBS: Olika cellinjer kan kräva justering av utspädnings- och passagefrekvensen.
2. Differentiering av kardiomyocyter
   1. Börja differentieringen när iPSC-monolagren är 80%-90% sammanflytande.
   2. Bered differentieringsmediet genom att tillsätta 10 ml B27-tillskott utan insulin och 5 ml penicillin-streptomycin-stamlösning till 500 ml Roswell Park Memorial Institute 1640-medium (RPMI). Bered underhållsmediet för kardiomyocyter genom att tillsätta 10 ml B27-tillskott och 5 ml penicillin-streptomycin-stamlösning till 500 ml RPMI 1640.
      OBS: Differentieringsmediet och underhållsmediet för kardiomyocyter kan förvaras vid 4 °C i upp till 2 veckor.
   3. Dag 0: Tvätta cellerna med 1 ml DMEM/F12 och tillsätt 2 ml 10 μM CHIR99021 och utspädd basalmembranmatris i differentieringsmedium.
   4. Dag 1: Efter 24 timmar, eller när cellsammanflödet har minskat till under 70 %, tvätta cellerna med 1 ml DMEM/F12, tillsätt 2 ml differentieringsmedium och inkubera i 48 timmar.
   5. Dag 3-4: Tvätta cellerna med 1 ml DMEM/F12 och tillsätt 2 ml 5 μM IWR-1 i differentieringsmedium. Upprepa på dag 4.
   6. Dag 5-6: Tvätta cellerna med 1 ml DMEM/F12 och tillsätt 2 ml differentieringsmedium. Upprepa på dag 6.
   7. Dag 7-10: Tvätta cellerna med 1 ml DMEM/F12 och tillsätt 2 ml underhållsmedium för kardiomyocyter. Upprepa var 24:e timme.
   8. Dag 11+: Byt ut mediet mot 4 ml färskt underhållsmedium för kardiomyocyter var 48-72:e timme. Aspirera och pipettera långsamt för att undvika att skada de kraftigt slående monolagren.

3. hECT-kulturen

1. Skörd av kardiomyocyter
   1. Skörda kardiomyocytmonolagren för användning i hECT-tillverkningen 8-60 dagar efter differentieringsinduktion. Räkna med 2-5 miljoner celler per brunn.
      OBS: Om cellerna inte har börjat slå på dag 10 är det osannolikt att differentieringen lyckas. Kraftigt vispande monolager lossnar ofta efter 11-15 dagar i differentieringen och komprimeras till täta vävnader. Det rekommenderas att använda eller omplatta sådana celler vid denna tidpunkt.
   2. Skölj varje brunn av kardiomyocyter 2x med 2 ml PBS. Tillsätt 1 ml rumstempererad 0,25 % trypsin-EDTA. Inkubera vid 37 °C i 5-10 minuter tills cellerna ser rundade ut och lossnar genom lätt knackning på plattan.
   3. Tillsätt 1 ml 10 % FBS i kardiomyocytunderhållsmedium till varje brunn för att neutralisera dissociationen. Pipettera försiktigt monolagren med en 5 ml serologisk pipettspets och överför till ett 50 ml koniskt rör för att bryta upp pelleten i klumpar om 10-20 celler.
   4. Blanda cellsuspensionen genom att vända upp och ner på det koniska röret innan 10 μl celler överförs till 10 μl trypanblått. Räkna cellerna med hjälp av en automatiserad cellräknare eller glashemocytometer. Cellsuspensionen separeras på lämpligt sätt om inte alla celler kommer att användas eller om vissa celler är reserverade för flödescytometri.
      OBS: Kompletterande celler (t.ex. fibroblaster) kan läggas till vid denna tidpunkt.
   5. Centrifugera cellerna vid 250 × g i 5 min. Aspirera omedelbart så mycket supernatant som möjligt utan att störa cellpelleten och håll den på is. Arbeta snabbt för att minimera tiden som cellerna spenderar i pelleten.
2. hECT-tillverkning
   1. Använd volymerna i tabell 2 och justera efter antalet celler i pelleten så att varje hECT innehåller 1 miljon celler. Efter varje steg, blanda genom att pipettera långsamt för att undvika bubblor.
      OBS: Utför steg 3.2.2-3.2.3 avskärmade från direkt ljus eftersom vissa komponenter är ljuskänsliga.
   2. Förbered en 2.9 g/ml typ-1 kollagenlösning i ett 1.7 ml mikrorör genom att tillsätta 13.442 μL destillerat vatten, 4.4 μL 10x PBS och 0.638 μL 1M NaOH. Tillsätt 25,52 μL 5 mg/ml kollagenstamlösning och blanda långsamt.
   3. Förbered extracellulär matrisblandning (ECM-blandning från tabell 2): Tillsätt 5,5 μL 0,2 N pH 9 HEPES-lösning följt av 5,5 μL 10x MEM. Blanda noggrant tills en jämn ljusgul till ljusrosa färg observeras. Överför 35,2 μl ECM-blandningslösningen till cellpelleten och tillsätt 4,4 μL basalmembranmatris.
   4. Öppna den autoklaverade påsen med bioreaktordelar (steg 1.4.7, figur 4A). Medan du bär handskar steriliserade med 70 % etanol, ta bort den svarta basplattan från autoklavpåsen och placera i en 60 mm skål med brunnarna uppåt. Pipettera långsamt 44 μL av cellblandningen i varje brunn för att undvika att bubblor tillförs. Använd vid behov pipetten för att ta bort eventuella bubblor som tillförts genom pipettering eller som har bildats på grund av PTFE:s hydrofobicitet. Återställ hECT-volymen så att vätskans yta är i jämnhöjd med brunnens kant (Figur 4BI).
   5. Ta på dig ett nytt par steriliserade handskar och ta bort polysulfonramen med PDMS-ställ från autoklavpåsen. Sänk ner ramen på bottenplattan så att ramens ändar passar in i spåren i ändarna av bottenplattan (Figur 4BII, III). Inspektera bioreaktorn för att säkerställa att stolparna är raka och att ramen inte lutar innan den placeras i en 60 mm skål.
   6. Tillsätt 1 ml 10 % FBS i kardiomyocytunderhållsmedium till 60 mm skålen (var noga med att inte störa hECT) för att öka luftfuktigheten i skålen när hECT:erna stelnar. Placera 60 mm-skålen utan lock i en 100 mm hög skål med hög profil (20 mm hög), täck med ett 100 mm skållock och sätt tillbaka bioreaktorn i 37 °C, 5 % CO 2-inkubatorn så att kollagenet kan bilda en gel med cellerna i suspension.
   7. Ta ut skålen ur inkubatorn efter 2 timmar. Tillsätt 13 ml 10 % FBS i kardiomyocytunderhållsmedium, luta skålen för att uppmuntra mediet att flöda mellan PTFE-basplattan och PDMS-racken.
   8. Inspektera bioreaktorn från sidan för att säkerställa att inga luftbubblor fastnar mellan de hydrofoba ytorna på PTFE-basplattan och PDMS-racken, och sätt tillbaka skålen i inkubatorn. Om det finns instängd luft, luta bioreaktorn ut ur mediet för att låta bubblan spricka och sänk den långsamt igen, eller använd en mikropipett med en gelladdningsspets för att suga ut luften, var noga med att inte störa stolparna.
3. Borttagning av bottenplatta
   1. Inspektera hECT-komprimeringen genom springan i ramen. Under loppet av 24-96 timmar komprimeras hECT:erna och blir mer ogenomskinliga (Figur 4CI-III). När det finns ett synligt mellanrum mellan hECT:erna och basplattans vägg (Figur 4CII), utför två halvvolymsmediebyten för att byta medium till kardiomyocytunderhållsmedium utan FBS. Ta bort bottenplattan när hECT:erna har komprimerats med minst 30 % jämfört med den ursprungliga diametern (Figur 4CIII). Fyll 60 mm-skålen som innehåller bioreaktorn med underhållsmedium för kardiomyocyter tills vätskan är i jämnhöjd med skålens kant och tillsätt 14 ml till en ny 60 mm-skål.
   2. KRITISKT STEG: Medan du bär sterila handskar, vänd bioreaktorn i sin skål så att bottenplattan är ovanpå (Figur 4BIV). Kontrollera om det finns instängda luftbubblor enligt steg 3.2.8. Lyft långsamt upp bottenplattan och håll den i nivå (Figur 4BV).
   3. Om en hECT faller av när bottenplattan tas bort men stannar kvar i bottenplattan, använd steril böjd fin pincett för att överföra hECT från basplattan till 60 mm skålen. Använd pincetten för att styra änden av hECT till dess stolpe. Använd en andra pincett för att hålla stolpen stadigt och trä den genom hålet i hECT. Upprepa för det andra inlägget om det behövs.
   4. Med alla hECT:er fästa på stolparna, överför ramen med hECT:erna till den nya 60 mm-skålen och placera ramen med stolparna nedåt (Figur 4BVI). Inspektera bioreaktorn för att säkerställa att hECT:erna förblir på sina platser precis proximalt till SPoTs.
   5. Om en hECT har tryckts av ytspänningen till basen av dess stolpar, stabilisera ramen med en steril böjd pincett. För in den andra pincetten genom skåran i ramen och håll den stängd. När spetsen på pincetten har sänkts förbi PDMS-ställena, vrid den så att den når stolpen och använd de stängda spetsarna för att försiktigt trycka hECT mot änden av stolpen tills den vilar på SPoT (Figur 4BVI, infälld).
4. hECT-underhåll
   1. Utför mediumbyten med halv volym med kardiomyocytunderhållsmedium var 24-48:e timme (efter 2 veckors odling kan frekvensen minskas till två gånger per vecka.)
   2. När hECT:erna uppvisar kluster av spontan svävning, vanligtvis dag 3, och koordinerad svävning med synlig efterböjning dag 5, påbörja de funktionella mätningarna och upprepa så ofta som önskas.
      OBS: hECT:er som inte har påbörjat koordinerad strykning vid dag 7 kommer sannolikt inte att göra det alls.

Komponent			Volym (μL)
destillerad H2O			13.442			2,9 mg/ml kollagenlösning	"ECM-mix"	slutlig hECT-cellblandning
NaOH 1N			0.638
PBS 10x			4.4
5 mg/ml kollagenbuljong			25.52
0,2 N pH 9 HEPES			5.5
10x MEM			5.5
Volym ECM-blandning som ska överföras till cellpellets			35.2
Volym av Matrigel			4.4

Tabell 2: hECT-reagenser. Komponenterna ska läggas till i den ordning som anges och förvaras på is.

Figur 4: Montering av bioreaktor och tillverkning av hECT. (A) (I) Två PDMS-ställ (vänster, ljusblå) monterade på polysulfonramen (höger, brun). (II) PTFE-basplattan (svart, vänster) passar sedan på ramen (höger) så att varje par stolpar passar in i en brunn på bottenplattan. (B) (I) Fyrtiofyra mikroliter kardiomyocytsuspension i kollagenbaserad extracellulär matris tillsätts till var och en av de sex basplattbrunnarna. (II,III) Ramen med PDMS-ställ presspassas på bottenplattan. Efter 1-4 dagar kan hECT:erna tas bort från bottenplattan. (IV) Först vänds bioreaktorn upp och ner innan (V) bottenplattan lyfts av ramen. VI) Bioreaktorn sedd från sidan med sex hECT. Infälld: förstorad vy som visar hECT-positionen på stolparna i förhållande till SPoTs (infälld). (C) CAD-rendering som visar tre nivåer av hECT-komprimering ([I] låg, [II] medel och [III] hög) sett genom gapet i polysulfonramen. Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: CAD = datorstödd konstruktion; PDMS = polydimetylsiloxan, PTFE = polytetrafluoreten, SPoT = stabil postspårare; hECT = humaniserad hjärtvävnad. Klicka här för att se en större version av denna figur.

4. Utrustning för stimulering av hECT

1. Jacka för den uppvärmda scenen
   1. Använd en laserskärmaskin för att skära ut komponenterna i akrylisoleringsmanteln ur en 0.635 cm tjock klar akrylskiva (tilläggsfil 3), en vardera av figur 5A-D och två vardera av figur 5E, F.
   2. Montera delarna (B), (C), (D) och en av (E) från figur 5 och bind ihop med akryllim som visas i figur 5GI. Fäst den övre panelen (Figur 5GII), låt limmet härda i flera timmar och skjut sedan in den uppvärmda stage i sidan av jackan (Figur 5GIII).
   3. När manteln är på plats, använd tejp för att fästa insatserna mellan benen på den uppvärmda stage och lägg till frontpanelen (Figur 5GIV) för att avsluta monteringen (Figur 5GV).
2. Tillverkning av grafitelektroder
   1. Skär 6,25 mm tjocka, 25 mm breda grafitstänger med en bandsåg i block som är 35 mm långa; Skär sedan varje block på längden i en böjd linje så att varje elektrod är 13-16 mm hög i ena änden och 8-10 mm hög i den andra änden. Borra två hål med en diameter på 0.7 mm i det övre hörnet (Figur 6AI). Polera bitarna med hushållspapper och sonikera i vatten i 20 minuter för att ta bort grafitdamm. Se till att elektroderna kilar fast mellan skålens väggar och den 25 mm breda bioreaktorn för att säkerställa ett konsekvent avstånd mellan elektroderna (Figur 6AII).
   2. Trä en 150 mm lång x 0,25 mm diameter ståltråd genom hålen på elektroderna och böj den så att den passar över kanten på 60 mm skålen och runt väggarna på 100 mm skålen så att locket kan stängas (Figur 6AII).
   3. Rengör elektroderna genom att blötlägga dem i destillerat vatten i 1-2 timmar efter varje användning för att avlägsna eventuellt absorberat medium, låt torka över natten och autoklavera sedan vid 132 °C i 30 minuter. Innan mätningarna påbörjas, placera en elektrod på vardera sidan av bioreaktorn (Figur 6AII). Placera ledningarna så att 100 mm skållocket kan stängas och sätt tillbaka bioreaktorn i inkubatorn för att komma i jämvikt.

Figur 5: Akrylmantel för isolering av det uppvärmda glasetappen. CAD-bilder som visar de viktigaste måtten på bitarna i akrylhöljet som är avsedda för glasbordet. (A) Den övre panelen har ett hål på 27 cm x 18,5 cm så att bioreaktorskålen kan sitta på värmeelementet. De orangefärgade rektanglarna i hörnen indikerar den föreslagna placeringen av små distansbitar för att ge utrymme mellan jackans ovansida och värmeelementet. (B) Jackans nederdel har två utskärningar så att benen på den uppvärmda stage kan glida in (gröna asterisker). (C&D) Två sidopaneler passar under toppstycket. (D) Den vänstra sidopanelen innehåller en 3 cm x 0.3 cm utskärning (infälld) för stage nätsladd. (E) Långa paneler passar på fram- och baksidan. (F) Insatser läggs till för att fylla luckorna när bordet är inuti. (G) (I) Sido- och bakpanelerna fästs på bottenstycket, och sedan (II) läggs den övre panelen till. (III) Glasbordet skjuts in i manteln (magentafärgade pilar). (IV) Insatserna fästs mellan bordets ben och baksidan passar på öppningen för att stänga lådan. (V) Den färdiga mantelmonteringen. Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: CAD = datorstödd konstruktion; R = radie; Ø = diameter. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figur 6: Datainsamling av hECT-kontraktion. (A) (I) Foton av elektroderna skurna från grafitstavar. De magentafärgade pilarna indikerar hål för att fästa de rostfria trådarna. Skalstreck = 1 cm. (II) Sned vy (vänster) och toppvy (höger) som visar grafitelektrodernas placering i bioreaktorn. Elektroderna tar upp utrymmet mellan den 25 mm breda bioreaktorn och parabolens vägg för att säkerställa ett jämnt avstånd mellan elektroderna. Trådarna är böjda så att disklocket kan stängas. (B) Foto av hECT-stimuleringsinställningen inuti den rena bänkutrustningen för laminärt flöde – all utrustning placeras på vibrationsisoleringsbordet för att minska vibrationsbruset från den rena bänken. Bioreaktorn (magenta pilspets) sitter på den mantlade uppvärmda scenen, upplyst av en LED-ljuskälla ovanifrån. Dissektionsmikroskopet är riktat horisontellt mot en rätvinklig spegel (orange asterisk) för att se bioreaktorn underifrån och är försett med en CCD-kamera (vänster). Det turkosa fästet indikerar ett vattenbad för kontinuerlig temperaturövervakning för att ge återkoppling till den uppvärmda stageregulatorn med sluten slinga. Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: hECT = human engineered cardiac tissue; LED = lysdiod. Klicka här för att se en större version av denna figur.

5. Funktionella mätningar av hECT

1. Ställa in arbetsytan för tempo
   1. Slå på den uppvärmda stage till 39.5 °C, och ställ upp stimuleringsutrustningen på ett vibrationsisoleringsbord inuti en laminärt flödesren bänk enligt figur 6B. Montera dissekeringsmikroskopet på ett bomstativ och rikta det mot en rätvinklig spegel (Figur 6B, orange asterisk) placerad på ett labbuttag under glasbordet för att view bioreaktorn underifrån. Fäst en höghastighets CCD-kamera på mikroskopet och anslut till datorn. Bestråla installationen med UV-ljus i 15 minuter för att sterilisera arbetsytan.
   2. Placera bioreaktorn (Figur 6B, magenta pilspets) på den mantlade uppvärmda stage, upplyst av en LED-ljuskälla med dubbla svanhalsar ovanifrån (halsarna på LED-lampor kan fästas säkrare på huvudenheten jämfört med fiberoptiska lamps). Minimera ytterligare buller genom att se till att stimuleringsutrustningen på vibrationsbordet (och själva bordet) inte vidrör någon del av den rena bänken med laminärt flöde.
   3. Lägg till en andra 60 mm skål fylld med förvärmt vatten inuti en 100 mm skål på det uppvärmda bordet (Figur 6B, turkos fäste) och utrusta med en temperatursond för kontinuerlig temperaturövervakning. Justera temperaturinställningen för den uppvärmda stage efter behov för att hålla temperaturen på referensskålen på 36-37 °C.
   4. Ställ in mikroskopets förstoring på 1.5x (eller annan önskad förstoring med vilken en hECT kan visualiseras i sin helhet med tillräcklig upplösning).
2. Justera kamerainställningarna
   1. Öppna kamerans programvara. Ändra storlek på videoflödet för att beskära synfältet så mycket som möjligt samtidigt som du visualiserar en hel hECT. Detta maximerar kamerahastigheten.
   2. Ställ in hämtningshastigheten på 90 bilder per sekund. Justera exponeringstiden och ljuskällans position för att optimera enhetligheten i ljusförhållandena över synfältet och maximera kontrasten hos SPoTs.
3. Installation av förvärvsprogramvara
   1. Slå på den fyrkantiga pulsstimulatorn och anslut den till datorn. Justera inställningarna för att leverera bifasiska pulser med en amplitud på 12 V och en varaktighet på 5 ms.
   2. Öppna datainsamlingsprogrammet och öppna sedan "AutomatedPostTracking3.vi"-filen (tilläggsfil 4). När det har laddats klickar du på den vita pilen till vänster i verktygsfältet för att initiera programmet (Figur 7A).
   3. Kalibrera programvaran med hjälp av en glashemocytometer på den uppvärmda stage. I verktygsfältet (Figur 7B) klickar du på linjeverktyget för att rita en linje över 1 mm av hemocytometermarkeringarna (visas inte). I rutan Avståndskalibrering (pixlar/mm) (Figur 7C) anger du Referenslängd (mm) till 1 och klickar sedan på knappen Beräkna .
   4. Mät hECT-tvärsnittsarean genom att använda linjeverktyget för att rita en linje över vävnadens bredd. Klicka på 1 i rutan Tvärsnittsarea (mm^2) (figur 7D) för att beräkna arean (med antagande av en cylindrisk geometri för de linjära vävnadsremsorna, som fastställts i litteraturen ^{1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,} 12,15,16,18,19,20^,
      21,22,23,24,25,26,37,38). Upprepa längs olika delar av hECT och anteckna värdena under de andra två knapparna i rutan. Tabellfilen för utdata rapporterar medelvärdet av dessa tre värden för att beräkna vävnadens diameter.
4. hECT-funktionell karakterisering
   1. Se till att inläggstipsen är i fokus. Slå på tröskelomkopplaren (Figur 7E) och justera reglaget (Figur 7F) tills SPoTs (Figur 7G) är snyggt avgränsade och inte ändrar form när hECT drar ihop sig.
   2. Använd rektangelverktyget för att rita en rektangel runt en av SpoTs (Figur 7, grön rektangel) och klicka på knappen Ställ in 1 i rutan Inläggsgränser (Figur 7H) för att ställa in rektangelpositionen runt SPoT, och se till att SPoT alltid håller sig inom rektangelns gräns. Upprepa för det andra inlägget och spela in det under Set 2.
   3. Justera inställningarna för objektstorlek (Figur 7I) för att förhindra att programmet spårar mindre objekt. Se till att antalet objekt som spåras i varje rektangel förblir konstant. Gränssnittet (Figur 7J) visar det uppmätta avståndet mellan de spårade objekten i realtid. Använd det här diagrammet för att övervaka bruset.
   4. Välj en katalog för att spara filerna (Figur 7K). Lagra data från olika dagar i separata mappar. Välj det aktuella vävnadsnumret och skriv önskade kommentarer i rutan Kommentarer .
   5. Under rubriken Stimuleringsfrekvens (Hz) (Figur 7L), ange önskat frekvensområde (Min och Max) och önskat intervall för stegning från Min till Max. Om hECT:erna rör sig över hela deras inspelningsområde, testa olika stimuleringsfrekvenser för att hitta den lägsta frekvensen vid vilken ett stimulus:toppförhållande på 1:1 uppnås, och fortsätt att öka frekvensen tills det förhållandet går förlorat. Mät den spontana funktionen genom att välja ett godtyckligt frekvensområde (t.ex. 0.01 Hz till 0.01 Hz) och hålla fyrkantspulsstimulatorns utgång avstängd.
   6. I rutorna till höger väljer du önskad inställningstid(er) (ett tidsintervall efter att frekvensen har ställts in men data inte registreras) för att låta hECT anpassa sig till den nya stimuleringsfrekvensen. Ange inspelningstid (er) och stimuleringsspänning (V). Starta programmet genom att klicka på knappen Starta program (Figur 7M).
      OBS: Resultaten sparas automatiskt i den valda katalogen. Efter varje inspelning, observera att skriptet visar Fouriertransformationen av data (Figur 7N), där topparna motsvarar den detekterade svävningsfrekvensen.
   7. Om så önskas, kör programmet "Excitation Threshold Finding" för att hitta den lägsta volymentage som krävs för att stimulera hECT i view (Figur 7O). Om så önskas, beräkna stolparnas maximala och minimala utböjning (Figur 7P).

Figur 7: Gränssnitt för datainsamling efter avböjning. (A) Knapp för att köra programvaran. (B) Verktygsfält som innehåller linje- och rektangelverktygen för längdmätning respektive objektval. C) Kontroller för avståndskalibrering. (D) Verktyg för mätning av hECT-tvärsnittsarean vid tre olika punkter. (E) Tröskelomkopplare och (F) skjutreglage för att konvertera videoflödet till bilder med hög kontrast i realtid. (G) En SPoT som visas i förhandsgranskningsfönstret. (H) Verktyg för att välja SPoTs. (I) Skjutreglage för att filtrera objekten efter storlek. (J) Graf som visar det uppmätta avståndet mellan de spårade objekten i realtid. (K) Alternativ för att välja katalog för att spara utdatafilerna. (L) Alternativ för att ställa in frekvensområde, frekvensintervall, inspelningstid och inställningstid mellan inspelningar för efterspårningsprogrammet (M). (N) Grafutmatning av Fouriertransformationen av avböjningskurvan för den senast sparade inspelningen. (O) Program för att hitta den lägsta volymentage som krävs för att stimulera hECT. (P) Program för att beräkna stolparnas maximala och minsta nedböjning. Förkortningar: hECT = human engineered cardiac tissue; SPoT = stabil post tracker. Klicka här för att se en större version av denna figur.

6. Mått på PDMS-rack

1. Obelastade sträckor
   1. Innan hECT-tillverkning, montera önskat par PDMS-ställ på en ram. Använd stimuleringsinställningen och programvaran som beskrivs i steg 5.1 för funktionsmätningarna. Välj de stationära SPoTs i ändarna av inläggen.
   2. Justera ljuskällan och/eller tröskeln vid behov för att minska bruset till <2 μm. Anteckna det genomsnittliga levande y-värdet som anges i diagrammet i ett kalkylblad.
2. Stolphöjder och hECT-höjder
   1. Från stimuleringsinställningen som beskrivs i steg 5.2, ta bort den vinklade spegeln och den uppvärmda stage. Placera bioreaktorn direkt på labbuttaget för en sida view av bioreaktorn.
   2. Öppna kamerans programvara. Justera exponeringstiden och ljuskällans position för att optimera enhetligheten i ljusförhållandena över synfältet och maximera synligheten för stolparna.
   3. Öppna datainsamlingsprogrammet och öppna sedan filen "PostMeasurement_PB3.vi" (tilläggsfil 5). När det har laddats klickar du på den vita pilen till vänster i verktygsfältet för att initiera programmet.
   4. Kalibrera programvaran med hjälp av en hemocytometer av glas. Klicka på linjeverktyget i det vertikala verktygsfältet till vänster om visningsfönstret och dra en linje över 1 mm av hemocytometermarkeringarna. I rutan Avståndskalibrering (pixlar/mm) längst ned till vänster på skärmen anger du Referenslängd (mm) till 1 och klickar sedan på knappen Beräkna .
   5. Under kalibreringsfälten anger du önskat vävnadsnummer (för identifiering) i fältet Vävnadsnummer . Fokusera kameran på den vänstra stolpen på hECT och välj Vänster i rutan Stolpsida .
   6. Använd linjeverktyget för att rita en linje från basen av stolpen (överst) till spetsen av SPoTs (nederst) och spela in genom att klicka på Mät stolpe Ht.
   7. Dra en linje från basen av stolpen till den bortre kanten av hECT och spela in genom att klicka på Mät vävnad Top Ht. Rita en linje från basen av stolpen till den närmaste kanten av hECT och spela in genom att klicka på Mät vävnadsbas Ht.
   8. Vänd nu på bioreaktorn för att mäta rätt stolphöjd. Välj rätt inläggsalternativ för att spela in samma mätningar. Klicka på knappen Lägg till för att fylla i kalkylbladet med de uppmätta värdena och automatiskt beräkna medelhöjden för hECT, som kommer att användas i steg 7.
   9. När du är klar med registreringen av vävnadshöjderna klickar du på knappen Spara för att spara värdena i en textfil.

7. Funktionell databehandling med hjälp av anpassade analysskript

1. I en kalkylarksredigerare fyller du i sammanfattningsfilen med hjälp av mallen (tilläggsfil 6). Använd värdena för stolplängd och genomsnittlig vävnadshöjd som erhållits i steg 6.2. Kontrollera att alla hECT:er som har data i mappen finns representerade i sammanfattningsfilen. Ge filen namnet "sammanfattning #.csv", där # refererar till antalet dagar i experimentet.
   OBS: hECT-funktionsdata måste finnas i separata mappar beroende på experimentdagen.
2. Se till att mappen som innehåller AnalyzeLogsGUI-skripten (tilläggsfil 7) och mappen med hECT-inspelningarna båda läggs till i sökvägen.
3. Öppna programvaran för dataanalys. Till vänster om katalogfältet klickar du på knappen Bläddra efter mapp för att navigera till den överordnade mappen som innehåller både mappen AnalyzeLogsGUI och funktionella hECT-data. I sidofältet Aktuellt fönster högerklickar du på dessa mappar för att lägga till i sökväg | Lägg till markerade mappar och undermappar.
4. Öppna filen "AnalyzeLogsGui_SC.m". På fliken Editor trycker du på knappen Kör och väntar tills det grafiska användargränssnittet (GUI) visas i ett nytt fönster.
   1. I rutan Loggval (bild 8AI) klickar du på knappen Välj katalog och navigerar till mappen som innehåller hECT-funktionsdata. Välj önskad hECT som ska bearbetas i rullgardinsmenyn Vävnad .
   2. I rutan Datainmatningar (Figur 8AII) anger du det obelastade avståndet mellan stolparna som registrerats från steg 6.1 i fältet Diastoliskt avstånd. Ange 0,25 i fältet Postradie (mm).
   3. I rutan Analysbegränsningar (bild 8AIII) väljer du de frekvenser som ska utelämnas från analysen eller väljer specifika frekvenser som ska inkluderas (avgränsade med kommatecken). Starttiden och sluttiden är inställda på 0 respektive −1 som standard för att bearbeta hela längden på inspelningarna. Ändra dessa värden för att trimma inspelningarna om det behövs.
   4. Ändra filterparametrarna (bild 8AIV) för polynomordning och bildrutestorlek för att ändra utjämningsnivån under filtreringsprocessen och skjutreglaget för tröskelvärde för toppdetektering för att ställa in den minsta toppstorlek som ska identifieras av skripten.
      OBS: Skriptet innehåller alternativet Spikborttagning, som klipper höga toppar orsakade av artefakter; Detta rekommenderas dock inte eftersom det ändrar formen på ryckningarna. Ta bort artefakter genom att trimma inspelningen istället (Figur 8AIII).
   5. Använd ytterligare alternativ (Figur 8AV) för ytterligare dataanalys: Analys efter avböjning för att köra ytterligare en algoritm för toppdetektering, Autoskala y-axeln på zoomdiagram för att automatiskt justera axlarna på ryckkraftkurvan (Figur 8B), Spara kraftspårningskurvor för att spara varje ryckkraftssiffra i en .fig-fil och Spara krafttidsdata för att spara x- och y-koordinaterna för filtrerade data som ritas i figuren för Twitch-kraftkurvan.
   6. Klicka på Kör analys för att generera en .txt fil som innehåller attributen för twitch-kraftkurvan (tilläggsfil 8) i genomsnitt över en hel inspelning.

Figur 8: Beräkningar av Twitch-kraftkurvan. (A) Om du kör filen "AnalyzeLogsGUI.m" i databehandlingsprogrammet öppnas GUI-fönstret. (I) Rutan Loggval gör det möjligt för användaren att välja katalog för mappen som innehåller hECT-funktionsdata. Fältet Dagnummer fylls i automatiskt från titeln på sammanfattningsfilen som skapades i protokollsteg 7.1. Den hECT som ska bearbetas väljs med hjälp av rullgardinsmenyn Vävnad . (II) Rutan Datainmatningar innehåller information om de PDMS-stolpar som stöder hECT, t.ex. obelastat avstånd (erhållet i protokollsteg 6.1) och stolpradie (0,25 mm). (III) Rutan Analysbegränsningar gör det möjligt för användaren att välja de frekvenser som ska utelämnas eller inkluderas och att trimma inspelningarna. (IV) Rutan för filterparametrar innehåller alternativen för att välja hur den råa ryckkraftskurvan ska filtreras. Polynomordning och bildrutestorlek ändrar utjämningsnivån under filtreringsprocessen. Skjutreglaget Tröskelvärde för toppdetektering avgör den minsta toppstorlek som ska identifieras av skripten. Alternativet Borttagning av spikar klipper bort höga toppar som orsakas av artefakter. (V) Ytterligare alternativ inkluderar analys efter avböjning, som kör ytterligare en algoritm för toppdetektering, autoskalning av y-axeln på zoomdiagram, som verkar på ryckkraftskurvan, som verkar på ryckkraftskurvan, som sparar ryckkraftssiffrorna, och Spara krafttidsdata, som sparar plottade ryckkraftsdata. (B) Exempel på ryckkraftkurvan för en 30 s-inspelning av en hECT-takt vid 1 Hz som produceras av GUI-skärmdumpen från panel A. Den röda ryckkraftskurvan visar den filtrerade kraften som produceras av parametrarna i AIV, överlagrad på den råa ryckkraftkurvan (mörkblå kurva, visas när alternativet Visa ofiltrerade data i AV är valt). Förkortningar: hECT = human engineered cardiac tissue; GUI = grafiskt användargränssnitt; PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Representative Results

Enligt ovanstående protokoll genererades kardiomyocyter från en frisk iPSC-linje som tidigare använts av vår grupp ^9,15 och tillverkades till hECT efter 8-61 dagar i odling. Figur 9A visar representativa bilder av hECT:er sedda nedifrån, som skapades utan (överst) och med (nederst) SPoTs. Funktionella mätningar gjordes vid rumstemperatur (23 °C) och vid fysiologisk temperatur (36 °C) mellan 37 dagar och 52 dagar efter hECT-tillverkning. Vid tillverkningen av PDMS-racken har vi dokumenterat att en erfaren användare kan förvänta sig att ha en 80-procentig avkastning i PDMS-rack med alla sex stolparna intakta och en total 95-procentig avkastning på minst fem stolpar (baserat på tre användare i vårt laboratorium), med <3 % variation i stolphöjd.

SPoTs tillhandahöll en enda definierad form att spåra under datainsamlingen (figur 9B och kompletterande video S1) jämfört med de fragmenterade formerna på markörbläcket, som inte binder bra till spetsarna på PDMS-stolparna (kompletterande video S2)²⁷. I vissa extrema fall kan spårningsobjektet till och med vara dolt (bild 9C, översta raden). Dessa oregelbundenheter introducerar mycket brus som skymmer ryckkraftskurvan, vilket förhindrar en noggrann mätning av de utvecklade krafterna under 10 μN. För att korrigera för detta och säkerställa konsekvent spårning av dessa former krävs vanligtvis många justeringar av ljusvinkeln och positionen för att optimera kontrasten och klarheten. Mörkret och regelbundenheten i SPoT-formerna effektiviserar denna process, vilket minskar insamlingstiden med cirka 50 % (från ~12-30 min till 5-10 min per hECT för ett typiskt inspelningsområde på 1 Hz till 4 Hz). Dessutom, i detta arbete, gav SPoTs en mer tillförlitlig form för optisk spårning, och minskningen av brus möjliggjorde mätning av svaga vävnader med en utvecklad kraft så låg som 1 μN, vilket motsvarar en postavböjning på mindre än 5 μm (figur 9D), samt minskade variabiliteten mellan mätningarna av samma hECT²⁷.

Enligt vår erfarenhet uppstår provförlust i longitudinella experiment vanligtvis på grund av att hECTS glider av ändarna på de inverterade PDMS-stolparna. Denna glidning av hECT:erna inträffar vanligtvis när hECT:erna tas bort från basplattan (Figur 4BV, 1-4 dagar efter hECT-tillverkning) eller ännu senare i experimentet (1-3 veckor efter hECT-tillverkning) när hECT:erna är kompakta och mogna. Denna mognad av hECT:erna utövar ibland tillräckligt med passiv och aktiv spänning på de flexibla stolparna för att få hECT:erna att dra sig loss från änden av en stolpe, vilket resulterar i en värdelös klump av vävnad som komprimeras runt den motsatta stolpen (Figur 9E). SPoTs ger en lockgeometri som förhindrar hECT-förlust (figur 9F), som kvantifieras i figur 9G. För de 103 bioreaktorer som skapades under loppet av 2 år (var och en med tre till sex hECT i början) behöll PDMS-racken utan SPoT i genomsnitt 95 % av hECT:erna i 66 bioreaktorer. Men medan de flesta bioreaktorer inte hade någon vävnadsförlust, förlorade vissa bioreaktorer 30%-100% av hECT (ofta när en enda bioreaktor representerar en hel experimentgrupp), vilket resulterade i betydande ineffektivitet. I detta arbete eliminerade SPoTs effektivt hECT-förlusten, vilket avsevärt förbättrade retentionsgraden till 100 % över 37 bioreaktorer (p = 0,038)²⁷.

Figur 9: Förbättring av kvaliteten på efterdeformationsdata och ökning av hECT-retentionen med tillägg av SPoTs till PDMS-stolparna. (A) Bottenvy av hECT:er utan (överst) eller med (nederst) SPoTs. (B,C) Närbilder av ena änden av en hECT på en stolpe sedd under bioreaktorn, med tröskelinställningarna i den högra kolumnen desamma som vid datainsamling. De röda rutorna indikerar objekt som kan spåras av programvaran för postspårning. (B) Jämförelse av de spårbara fiduciella markörerna på ett inlägg med markörbläck jämfört med SPoT. (C) Avslappnade och sammandragna hECT:er på inlägg med tuschpenna (de två översta raderna) eller med SPoTs (de två nedersta raderna). (D) Exempel på spårning av ryckkraft för en hECT med elektrisk takt vid 1 Hz slag med en utvecklad kraft på 1 μN, vilket motsvarar en avböjning på mindre än 5 μm (kricka: ofiltrerat spår; magenta: filtrerat spår). (E) Sned bild av en bioreaktor utan SPoTs där hECT gled av en av sina stolpar, vilket resulterade i en klump av vävnad som bildades runt den motsatta stolpen (turkosa pilspetsar). (F) Foto av en bioreaktor med SPoTs som visar 100 % hECT-retention. (G) Punktdiagram som visar vävnadsretentionen per bioreaktor för PDMS-rack (var och en med tre till sex hECT) utan SPoTs (n = 322 hECT, 66 bioreaktorer) och PDMS-rack med SPoTs (n = 134 hECT, 37 bioreaktorer), inklusive data från bioreaktorer med vävnadssvikt under avlägsnande av basplattan (dag 1-4) och senare i odlingsprocessen (dag 4-15). *p = 0,038; diamant anger medelvärdet. Skalstreck = 1 mm (A,C), 1 cm (E). Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortningar: hECT = human engineered cardiac tissue; SPoT = stabil postspårare; GUI = grafiskt användargränssnitt; PDMS = polydimetylsiloxan. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Som ett exempel på tillämpning av ovanstående metoder visar vi också vikten av att mäta hECT-funktionen vid fysiologisk temperatur (36 °C) snarare än vid rumstemperatur (23 °C). hECT-funktionen visade sig vara stabil under förlängd odlingstid i den aktuella stimuleringsinställningen med den uppvärmda stage (Figur 10A)²⁷. Jämfört med mätningar vid fysiologisk temperatur visade hECT förändrad kontraktionsdynamik vid rumstemperatur, med långsammare kontraktions- och relaxationshastigheter (indikeras av topparnas lutningar i figur 10B).

I detta arbete uppvisade 1 hECT av 10 hypotermisk inotropi (där den utvecklade kraften var högre vid 23 °C än vid 36 °C), men endast vid låga frekvenser. När hECT var tempostyrt vid 1,5 Hz hade den en starkare utvecklad kraft vid 36 °C (ingen hypotermisk inotropi) och fullständig relaxation mellan ryckningarna (flacka intertoppregioner i ryckkraftskurvan, höger panel) men ofullständig relaxation mellan sammandragningarna vid 23 °C (ökad passiv kraft mellan topparna, vänster panel) (Figur 10BI). När hECT var inställd på 0,75 Hz förelåg hypotermisk inotropi (Figur 10BII), och hECT observerades slappna av helt mellan sammandragningarna, även vid 23 °C (vänster panel). Definitiva frekvensmatchade jämförelser av hECT-funktionen var dock utmanande eftersom infångningsområdet för de flesta hECT-reaktorer visade minimal överlappning mellan temperaturer (Figur 10C). Detta berodde till stor del på den låga maximala fångstfrekvensen vid 23 °C (oftast ≤1,5 Hz) och den höga lägsta infångningsfrekvensen för hECT vid 36 °C (oftast ≥ 1,5 Hz) (figur 10D). Dessa begränsningar ses inte i naturligt myokardium (testat vid 28 °C och 37 °C) eftersom nativ ventrikulär myokardium inte slår spontant⁴⁶. Endast en av de hECT:er som hade frekvensöverlappning uppvisade frekvensmatchad hypotermisk inotropi (Figur 10D). Som indikeras av ryckkraftkurvorna i figur 10B visade hECT-hastigheter vid 36 °C högre magnituder på +dF/dt och −dF/dt (figur 10E, heldragna linjer) än när de hölls i ett tempo på 23 °C (streckade linjer). I hECT som uppvisade hypotermisk inotropi (röd linje) var kontraktionen och relaxationen mycket snabbare vid 36 °C trots den lägre kraften. Vid tempo vid 36 °C hade hECT också en högre spontan svävningshastighet (figur 10F) (n = 10, p = 0,000016 för ett parat t-test) och ett mer expansivt intervall av fångstfrekvenser (figur 10G) (n = 9, p = 0,0000061 för ett parat t-test), vilket uppnådde 1:1-upptagning vid suprafysiologiska frekvenser^{48 på 4,5} Hz till 6,75 Hz (figur 10C).

Figur 10: hECT-kontraktil dynamik som visar temperaturberoende. (A) Twitch force tracing av en hECT med 1 Hz i 30 minuter (överst) för att visa stabilitet i funktionen över tid, med infällningar (nederst) som visar en förstorad bild av toppen med 5 minuters intervall. (B) Ryckkraftstracings av en hECT med ett tempo vid (I) 1,5 Hz och (II) 0,75 Hz utan respektive med hypotermisk inotropi. Spårningarna på vänster panel erhölls vid 23 °C och de högra paneltracingarna erhölls vid 36 °C. (C) Kraft-frekvensförhållande för hECT (n = 6 hECT dag 37 efter fabrikation över två bioreaktorer, n = 4 vid dag 52 efter tillverkning över två bioreaktorer) vid 23 °C (streckade linjer) och vid 36 °C (heldragna linjer). Varje färg representerar en hECT. (D) Kraft-frekvensförhållanden för tre hECT från panel C som visar frekvensöverlappning vid båda temperaturerna, varav en visar frekvensmatchad hypotermisk inotropi (svart pilspets). (E) +dF/dt och −dF/dt för samma hECT i panel D plottade över frekvenser vid 23 °C (streckade linjer) och 36 °C (heldragna linjer). (F) Spontan slagningshastighet för hECT vid de två temperaturbetingelserna (n = 10, p = 0,000016). (G) Frekvensområde med 1:1 stimulering: toppinfångning (frekvensområde i detta diagram definierat som maximal infångningsfrekvens - minsta infångningsfrekvens) vid varje temperatur (n = 9, p = 0,000006,1). p-värden från parade Students t-test. Felstaplar anger standardavvikelsen. Denna siffra är modifierad från van Neste²⁷. Förkortning: hECT = human engineered cardiac tissue. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Tilläggsfil 1: CAD-filer för de bearbetade bioreaktordelarna. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 2: CAD-filer för den 3D-printade SPoT-gjutapparaten. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 3: CAD-filer för den isolerande akrylmanteln för den uppvärmda scenen. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 4: AutomatedPostTracking3.vi fil för att spåra hECT-nedböjningar (protokollsteg 5.3). Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 5: PostMeasurement_PB3.vi-fil för mätning av stolplängder och vävnadshöjder (protokollsteg 6.2). Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 6: Mall för "summary #.csv" (protokoll steg 7.1), som används för bearbetning av post deflection data. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 7: AnalyzeLogsGUI-mapp som innehåller MatLab-skript för bearbetning av data efter avböjning (protokollsteg 7). Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Tilläggsfil 8: Beskrivningar av variablerna i MatLab-skriptets utdatafil "_datatable.txt". Raderna 10-24 är parametrisering av ryckkraftkurvan i genomsnitt över alla toppar under inspelningens varaktighet (anges på rad 25). Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video S1: Video av spontan slå hECT på inlägg med SPoTs. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande video S2: Video av spontana hECT:er på inlägg utan SPoTs. Den här filen är hämtad från van Neste²⁷. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Discussion

Det finns ett stort antal linjärt konstruerade hjärtvävnadsmodeller publicerade i litteraturen, av vilka några beskrivs i tabell 1. Vissa modeller involverar direkt mätning av vävnadskraften, men dessa kräver vanligtvis att konstruktionen överförs till ett separat muskelbad³⁸. De flesta modeller är utformade med vävnaderna permanent förankrade i båda ändar, oftast till PDMS-stolpar 1,2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16 ^,17,18,19,20,21,
22,25,26 (eller trådar ³⁹), vilket tar bort behovet av vävnadsmanipulation, och kraften som genereras av vävnaderna kan beräknas exakt genom den optiska spårningen av ändankarfunktionerna. PDMS-stolparna som utvecklats av vår grupp 1,2,3,4,5,6,7,8,9,27 utformades för att stödja medelstora vävnader, och dessa stolpar balanserar genomströmning, exakta funktionella mätningar och upprätthållande av viktiga aspekter av den ursprungliga hjärtnischen. Stolparna var för små för att möjliggöra en delad gjutmetod 10,13,14,18,19,20,21,24, och integrerade lock skulle få stolparna att knäckas under det kritiska protokollsteget 1.3.2. Utan lock kan hECT:erna glida av stolparna. I de fall då vävnadsretentionen inte var 100 % förlorade dessa bioreaktorer ofta en stor del av hECT, vilket skapade ett allt-eller-inget-problem²⁷. Detta hände oftast under det kritiska protokollsteget 3.3.2, när hECT:erna avlägsnades från basplattans brunn. HECT:erna kunde ibland fysiskt manipuleras tillbaka till stolparna med varje ände av stolpen försiktigt gängad genom hålet i hECT; Detta var inte bara tekniskt utmanande utan också en betydande källa till skada som kunde påverka den efterföljande kontraktila funktionen negativt.

SPoTs som läggs till PDMS-postdesignen möjliggör hECT-kultur med ett bredare spänningsområde. Således kan hECT med en fenotyp av låg komprimering/passiv spänning (t.ex. lågt innehåll av icke-myocyter eller modeller av dilaterad kardiomyopati⁴), som annars skulle glida av stolparna, odlas och utvärderas med SPoTs. Omvänt säkerställer lockgeometrin att hECT med hög passiv spänning (t.ex. högt innehåll av icke-myocyter eller sjukdomsmodeller med nedsatt diastolisk relaxation⁴⁹) som tenderar att dra av släta PDMS-stolpar hålls på plats²⁷. Dessutom är SPoT relativt unika genom att de läggs till PDMS-stolparna i ett andra tillverkningssteg, vilket bara har setts i en annan modell med betydligt mindre vävnader¹⁷. Även om SPoTs kräver detta separata tillverkningssteg, möjliggör de samtidig tillsats av en lockgeometri med möjlighet att införliva olika material i locket, såsom en ogenomskinlig svart färg, magneter eller fluorescerande pärlor; Dessa har utforskats av några andra grupper men kräver också ytterligare tillverkningssteg 23,25,26.

Ett annat fokus för denna uppsats var att utforska effekterna av temperatur på hECT-funktionen. Även om hjärtteknologisk vävnad har använts för att modellera många aspekter av hjärtfunktion in vivo (t.ex. sjukdomsmodellering ^4,8,50,51 och läkemedelsrespons 15,21,52), har temperaturberoende effekter såvitt vi vet inte undersökts systematiskt i dessa modeller. Frekvensmatchad hypotermisk inotropi är både uttalad – ibland med en femfaldig ökning av utvecklad kraft – och allestädes närvarande⁴⁵, eftersom de ses hos många däggdjursarter (råttor 46,53,54, illrar⁵⁴, kaniner⁵⁵ och katter⁵⁴), såväl som friska och sviktande mänskliga hjärtmuskel i olika åldrar⁴⁴. Vi fann att hECT:s spontana slagfrekvens och fångstfrekvensområde skiftades till mycket lägre frekvenser vid lägre temperaturer, men frekvensmatchad hypotermisk inotropi var inte alltid närvarande²⁷. I strävan att förbättra konstruerad hjärtvävnad genom framsteg inom mognad^13,18 och biokomplexitet⁵⁶, erbjuder hypotermisk inotropi en annan funktionell fenotyp av naturlig hjärtmuskel som kan användas som ett riktmärke för hjärtats biotrohet.

Mot bakgrund av temperaturberoendet hos naturligt myokardium och i ett försök att rekapitulera den naturliga hjärtnischmiljön, karakteriseras konstruerad vävnadsfunktion ofta vid fysiologisk temperatur. Detta är dock inte alltid möjligt eftersom vissa system för att samla in vävnadsfunktionsdata med bibehållen sterilitet inte bidrar till upphettning. Jämförelser av funktion mellan vävnader (eller vävnadsmodeller) mätt vid olika temperaturer kan därför vara olämpliga. Faktum är att standardisering av testbetingelser för in vitro-vävnadstekniska analyser anses nödvändig både inom regenerativ medicin⁵⁷ och av tillsynsmyndigheter som Food and Drug Administration^58,59. Metoderna som beskrivs i detta dokument kan bidra till att uppnå en sådan standardisering förutom att möjliggöra ytterligare studier av temperaturens effekter på hECT-funktionen²⁷.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.25 mm diamete 304 Stainless Steel Wire	McMaster Carr	6517K61
0.25% trypsin-EDTA	Gibco	25200056
1.7 mL Microtubes	Axygen	MCT-175-C
10 cm dishes (20 mm tall)	Corning	353003
10 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-010
10 N NaOH	Fisher Scientific	SS225-1	dilute 1:10 in sterile distilled water
10X Modified Eagle Medium	Sigma Aldrich	M0275
20 - 200 μL Micropipette	Eppendorf	3123000055
200 μL MicroPipette Tips	VWR	76322-150
5 mL Serological Pipette	Drummond	6-000-005
50 mL Conical Centrifuge Tubes	Falcon	352070
6 cm Petri Dish	Corning	353002
6 Watt LED Dual Gooseneck Illuminator	AmScope	LED-6W
6-Well Plates	Corning	353046
90 degree angle mirror	Edmund Optics	45-594
Acrylic bonding glue	SCIGRIP	#4
Adjustable 10 cm x 10 cm jack	Fisher Scientific	14-673-50
Aluminum 6061	McMaster Carr	9008K82
A-Plan 10X Objective Lens	ZEISS	1020-863
Autoclave Bags	Propper	21002
B-27 supplement	ThermoFisher	17504044
B-27 supplement (without insulin)	ThermoFisher	A1895601
Benchtop Centrifuge	Eppendorf	5810 R
Black ABS	Ultimaker		2.85 mm wide
Bovine Collagen I	Gibco	A1064401
CHIR99021	Tocris	4423
Class II Biosafety Cabinet	Labconco	3430009
Clear Acrylic Sheeting	estreetplastics	1002502436	6.25 mm thick
CNC Vertical Mill	Haas	VF-1
Conductive Graphite Bars	McMaster Carr	1763T33
Dissection microscope	Olympus	SZ61
Dulbecco's Modified Eagle Medium/Ham's F-12 Nutrient Mix	ThermoFisher	11330032
Ethanol	Fisher Scientific	A4094	Dilute to 70% in water
EVE Automated Cell counter	NanoEntek	E1000
EVE Cell Counting Slide	NanoEntek	EVS-050
Fetal Bovine Serum	Life Technologies	10438026
Fine Curved Forceps	Fine Science Tools	11253-25
Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator	Thermo Electron Corporation	3110	AKA "incubator". With HEPA class 100 filter
Fusion360 software	Autodesk		AKA "CAD software"
Glass Hemocytometer	Reichert	1475	0.1 mm deep
HEPES	Sigma Aldrich	H3784
hESC qualified matrigel	Corning	354277	AKA "basement membrane matrix". Store in frozen aliquots
High Speed CCD Camera	PixelLINK	P7410
Inverted Microscope	Carl Zeiss Werk	Axiovert 40 CFL	10X phase contrast objective
IWR-1	Selleck Chem	S7086
LabView Software	National Instruments	2016
Laminar flow clean bench	NuAire	NU-201-330	necessary for hECT functional analysis
Laptop	AsusTek	Strix	Intel Core i& processor ,CPU 2.8GHz, 16GB RAM
Laser Cutting Machine	Epilog	Helix 24
Magnification headset	ExcelBlades	70020	Recommended for steps requiring fine manipulations
Matlab	Mathworks	Version 2019b or later	AKA "data analysis software"
Micro Vannas Scissors, 3 mm blade	WPI Instruments	501839
Microscope Boom Stand	Olympus	SZ2-STU1
Penicillin-Streptomycin stock solution	ThermoFisher	15140122	10,000 IU/ml penicillin; 10,000 μg/ml streptomycin
Phosphate-buffered saline without divalent cations	Sigma Aldrich	P3813	Diluted in distilled water to 1X and 10X concentrations
Pipette Controller	Drummond	4-000-100
PixelLINK Capture OEM	PixelLINK	10.2.1.6	AKA "Camera Software"
Polysulfone	McMaster Carr	86735K73	translucent amber color
Polytetrafluoroethylene (PTFE)	McMaster Carr	8545K176	Black, molded
ReLeSR	Stem Cell Technologies	5872	AKA "iPSC dissociation media"
Rosewell Park Memorial Institute 1640 Media	ThermoFisher	11875135
Silicone Sheeting	SMI manufacturing		glossy, 0.02 in thickness, durometer 40
Size 10/0 Blue, Green, Red, and Yellow Glass Seed Beads	Michael's		color should withstand autoclaving
Spatula	Fisher Scientific	14-373	used for mixing PDMS
Square Pulse Stimulator	Astro-Med / Grass Technologies	S88X
Stainless Steel Razoblades	GEM	62-0179-CTN	preferred over non-stainless steel due to lower hardness
Stemflex	ThermoFisher	A3349401	AKA "iPSC culture media"
Sterile distilled water	ThermoFisher	5230
Sylgard 170 -  Silicone Elastomer Encapsulant Black 0.9 kg Kit	Dow	DOWSIL 170 2LB KIT	AKA black Polydimethylsiloxane (black PDMS)
Sylgard 184 - Silicone Elastomer Clear 1 lb Kit	Dow	DC 184 SYLGARD 0.5KG 1.1LB KIT	AKA Polydimethylsiloxane (PDMS)
Temperature-controlled heated stage	Okolab	H401-HG-SMU	Set height to 10 cm
Thermoplastic 3D printer	Ultimaker	Ultimaker 3
Thiazovivin	Selleck Chem	S1459
Trypan Blue	NanoEntek	EBT-001
Vacuum Chamber	Bel-Art Parts	F42027-0000
Variable Speed Mini Band Saw	Micro-Mark	82203
Variable Speed Miniature Drill Press	Micro-Mark	82959
Vibration Isolation Table	Labconco	3618000
Weighing Boats	VWR	10803-140
Talon Cylinder Bench Clamp	VWR	97035-528	AKA screw clamp