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Identificación y aislamiento de progenitores eritroides de unidades formadoras de ráfagas y unidades formadoras de colonias a partir de tejido de ratón mediante citometría de flujo

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DOI:

10.3791/64373

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4 de noviembre de 2022

 ,  ,  , 
1Department of Molecular, Cell and Cancer Biology, UMASS Chan Medical School

En este artículo

Resumen

Aquí, describimos un nuevo método citométrico de flujo para el aislamiento prospectivo de progenitores eritroides unitarios formadores de ráfagas tempranas (BFU-e) y eritroides unitarios formadores de colonias (UFC-e) directamente de médula ósea y bazo de ratón frescos. Este protocolo, desarrollado en base a datos transcriptómicos unicelulares, es el primero en aislar todos los progenitores eritroides del tejido con alta pureza.

Resumen

Los progenitores eritroides tempranos se definieron originalmente por su potencial de formación de colonias in vitro y se clasificaron en "unidades" formadoras de ráfagas y colonias conocidas como BFU-e y UFC-e. Hasta hace poco, no se disponía de métodos para el aislamiento prospectivo directo y completo de progenitores puros de BFU-e y UFC-e de médula ósea de ratón adulta recién aislada. Para abordar esta brecha, se analizó un conjunto de datos de RNA-seq de una sola célula (scRNAseq) de médula ósea de ratón para la expresión de genes que codifican marcadores de superficie celular. Este análisis se combinó con ensayos de destino celular, lo que permitió el desarrollo de un nuevo enfoque citométrico de flujo que identifica y permite el aislamiento de subconjuntos completos y puros de progenitores BFU-e y CFU-e en médula ósea o bazo de ratón. Este enfoque también identifica otros subconjuntos progenitores, incluidos los subconjuntos enriquecidos para los potenciales basófilos/mastocitos y megacariocíticos. El método consiste en marcar células frescas de médula ósea o bazo con anticuerpos dirigidos a Kit y CD55. Los progenitores que expresan ambos marcadores se subdividen en cinco poblaciones principales. La población 1 (P1 o UFC-e, Kit+ CD55+ CD49f med/bajo CD105 med/alto CD71 med/alto) contiene todos los progenitores CFU-e y puede subdividirse en P1-bajo (CD71 med CD150 alto) y P1-hi (CD71alto CD150 bajo), correspondiente a CFU-e temprano y tardío, respectivamente; La población 2 (P2 o BFU-e, Kit+ CD55+ CD49f med/low CD105 med/high CD71 low CD150high) contiene todos los progenitores BFU-e; La población P3 (P3, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150 low CD41low) está enriquecida para progenitores basófilos/mastocitos; La población 4 (P4, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41+) está enriquecida para progenitores megacariocíticos; y la población 5 (P5, Kit+ CD55+ CD49f med/high CD105med/low CD150high CD41-) contiene progenitores con eritroides, basófilos/mastocitos y potencial megacariocítico (EBMP) y progenitores multipotenciales eritroses/megacariocíticos/basófilos (MPP). Este nuevo enfoque permite una mayor precisión al analizar progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos y también permite hacer referencia a la información del transcriptoma para cada población citométricamente definida por flujo.

Introducción

La eritropoyesis puede dividirse en dos fases principales: eritropoyesis precoz y diferenciación terminal eritroide (Figura 1)1,2,3. En la eritropoyesis temprana, las células madre hematopoyéticas se comprometen con el linaje eritroide y dan lugar a progenitores eritroides tempranos, que se identificaron por primera vez en la década de 1970 en función de su potencial de formación de colonias en medio semisólido 4,5,6,7,8,9 . En términos generales, los progenitores eritroides se dividen en dos categorías: progenitores anteriores que dan lugar a un "estallido" (un gran agregado de grupos de células eritroides más pequeños), llamado "eritroide unitario formador de estallido" o BFU-e 4,5,6; y su progenie, que forman cada uno un único grupo o colonia de células eritroides pequeñas, denominadas "unidad formadora de colonias eritroides" o UFC-e 7,8,9. BFU-e y CFU-e aún no expresan genes eritroides terminales y no son morfológicamente reconocibles. Después de una serie de divisiones celulares de auto-renovación o expansión, la UFC-e experimenta un cambio transcripcional en el que se inducen genes eritroides como globinas, pasando así a la diferenciación terminal eritroide (ETD)1,10. Durante la ETD, los eritroblastos se someten a tres a cinco divisiones celulares madurativas antes de enuclearse para formar reticulocitos, que maduran en glóbulos rojos.

Los eritroblastos durante la diferenciación terminal se clasificaron originalmente en función de su morfología en proeritroblastos, basófilos, policromáticos y ortocromáticos. El advenimiento de la citometría de flujo permitió su clasificación y aislamiento prospectivo basado en el tamaño celular (medido por dispersión directa, FSC) y dos marcadores de superficie celular, CD71 y Ter11911,12,13 (Figura 1). Este y otros enfoques citométricos de flujo similares 14 han revolucionado la investigación de los aspectos moleculares y celulares de la ETD, permitiendo el análisis específico de la etapa de desarrollo de eritroblastos in vivo e in vitro 10,15,16,17,18,19,20. El enfoque CD71/Ter119 ahora se usa rutinariamente en el análisis de precursores eritroides.

Hasta hace poco, un enfoque citométrico de flujo similar y accesible para el aislamiento prospectivo directo y de alta pureza de CFU-e y BFU-e de tejido de ratón ha eludido a los investigadores. En cambio, los investigadores han utilizado estrategias citométricas de flujo que aíslan solo una fracción de estos progenitores, a menudo en presencia de células no eritroides que se purifican conjuntamente dentro de los mismos subconjuntos citométricos de flujo21. En consecuencia, la investigación de BFU-e y CFU-e se limitó a sistemas de diferenciación in vitro que derivan y amplifican BFU-e y CFU-e de progenitores de médula ósea anteriores. Entonces es posible aplicar estrategias citométricas de flujo que distinguan la UFC-e de la BFU-e en estos cultivos enriquecidos con progenitores eritroides22,23. Un enfoque alternativo hace uso de UFC-e fetal y BFU-e, que están altamente enriquecidas en la fracción Ter119-negativa del hígado fetal de ratón a mediados de la gestación 10,24,25. Ninguno de estos enfoques, sin embargo, permite la investigación de BFU-e y UFC-e adultos en su estado fisiológico in vivo. La magnitud del desafío puede apreciarse cuando se recuerda que, según los ensayos de formación de colonias, estas células están presentes en la médula ósea adulta con una frecuencia de solo 0,025% y 0,3%, respectivamente6.

El protocolo descrito aquí es un nuevo enfoque citométrico de flujo basado en el análisis transcriptómico de células transcriptómicas de células de médula ósea de ratón Kit+ recién cosechadas (Kit es expresado por todas las poblaciones progenitoras tempranas de la médula ósea)1. Nuestro enfoque contiene algunos marcadores de superficie celular que ya estaban en uso por Pronk et al.21,26. Se utilizaron transcriptomas unicelulares para determinar combinaciones de marcadores de superficie celular que identifican progenitores eritroides y otros progenitores hematopoyéticos tempranos (Figura 2). Específicamente, la fracción CD55+ de las células Kit+ negativas para linaje (Lin-) puede subdividirse en cinco poblaciones, tres de las cuales producen segmentos contiguos de la trayectoria eritroide (Figura 2). Las identidades transcriptómicas de cada una de estas poblaciones se confirmaron mediante clasificación, seguido de scRNAseq y proyección de los transcriptomas unicelulares ordenados en el mapa transcriptómico original (la expresión génica en cada una de las cinco poblaciones y todo el conjunto de datos de médula ósea se puede explorar en https://kleintools.hms.harvard.edu/paper_websites/tusi_et_al/index.html)1 . El potencial de destino celular de cada una de las poblaciones se confirmó mediante ensayos tradicionales de formación de colonias (Figura 2), así como un nuevo ensayo de destino unicelular de alto rendimiento 1,27. Estos análisis muestran que el nuevo enfoque citométrico de flujo da como resultado un aislamiento de alta pureza de todos los progenitores BFU-e y CFU-e de la médula ósea y el bazo adultos frescos. Específicamente, la población 1 (P1) contiene solo UFC-e y ningún otro progenitor hematopoyético, y la población 2 (P2) contiene todos los progenitores BFU-e de la médula ósea y un pequeño número de UFC-e pero ningún otro progenitor1. El protocolo detallado a continuación se ilustra con un experimento de ejemplo en ratones que fueron inyectados con solución salina o con la hormona estimulante de la eritropoyesis eritropoyetina (Epo).

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Protocolo

Todos los experimentos se llevaron a cabo de acuerdo con los protocolos animales A-1586 y 202200017 aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Escuela de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts.

NOTA: Aquí se detallan dos protocolos: primero, análisis citométrico de flujo (sección 1), seguido de ajustes de protocolo para la clasificación por citometría de flujo (sección 2). El siguiente protocolo utiliza un citómetro/clasificador de flujo con 10 canales. En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo de configuración, al que se hace referencia en el paso 1.14.5. También es posible ejecutar este protocolo con solo nueve canales; véase la leyenda en el cuadro 2.

1. Análisis citométrico de flujo

  1. Eutanasia a ratones adultos (>6 semanas de edad) Balb/C o C57BL6 utilizando un método apropiado aprobado por su Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (por ejemplo, inhalación deCO2 seguida de dislocación cervical). Para el análisis citométrico de flujo, la médula ósea (BM) de un solo ratón será suficiente. Para la clasificación, el número de ratones depende de las aplicaciones posteriores. El rendimiento celular para cada población se indica a continuación (paso 2.3.3).
  2. Recolección de tejidos:
    1. Preparar tubos de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) de 5 ml que contengan 3 ml de tampón de tinción en frío (4 °C) ("SB5": solución salina tamponada con fosfato (PBS), 0,2% de albúmina sérica bovina (BSA), 0,08% de glucosa, 5 mM EDTA) en hielo. Use esto para colocar los tejidos cosechados.
    2. Prepare tubos separados para cada tejido diseccionado de cada ratón. No agrupe tejidos de varios ratones.
    3. Cosecha ambos fémures y ambas tibias. Retire todos los músculos de los huesos antes de colocarlos en el tubo con SB5.
    4. Diseccionar el bazo a través de una incisión en el lado izquierdo del abdomen.
  3. Extracción de células de médula ósea:
    1. Coloque los fémures y tibias recién disecados directamente en el tampón de tinción en frío (SB5) y mantenga los tubos en hielo hasta que estén listos para extraer la médula ósea (BM). Coloque un mortero esterilizado limpio sobre hielo en un balde. Transfiera los huesos al mortero junto con el SB5 del tubo.
    2. Corte aproximadamente 1 mm de los extremos de cada hueso con tijeras de disección para que el orificio del hueso se vuelva apenas visible.
    3. Use una aguja de 26 G y una jeringa de 3 ml llena de SB5 para eliminar la médula de los huesos y recogerla en el mortero. Repita el proceso 3-5 veces usando tampón nuevo cada vez hasta que los huesos parezcan incoloros.
    4. Filtre la médula enjuagada a través de un filtro de malla de 100 μm y recoja las células en un tubo de centrífuga de 50 ml colocado sobre hielo.
    5. Use el mortero para aplastar los huesos enjuagados en 5-10 ml de SB5. Filtrar la mezcla de huesos triturados y tampón a través del filtro de células de 100 μm y agrupar con las células recogidas en el paso 1.3.4.
  4. Extracción de células del bazo:
    1. Coloque un filtro de malla de 100 μm en un tubo centrífugo vacío de 50 ml colocado sobre hielo. Coloque un solo bazo en el filtro de malla.
    2. Agregue 0.5-1 ml de SB5 al bazo para asegurarse de que no se seque.
    3. Usando el lado de goma de un émbolo de jeringa de 3 ml o 5 ml, triture el bazo a través de la malla. Agregue más SB5, 5 ml a la vez, y continúe triturando hasta que todas las células se hayan recogido en el tubo.
  5. A partir de este momento, la médula ósea y las células esplénicas se tratan de la misma manera.
  6. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspire el sobrenadante usando una configuración de aspiración endouterina.
  7. Para hacer una suspensión de una sola célula, resuspenda las celdas en 2 ml de SB5 y pipete hacia arriba y hacia abajo 50 veces usando un P1000 con una punta de orificio grande (consulte la Tabla de materiales). Estos tienen aberturas anchas en las puntas para ayudar a prevenir el daño a las células frágiles.
  8. Para contar las celdas, resuspenda pipeteando hacia arriba y hacia abajo 20 veces. Diluir las células en una proporción de 1:100 en SB5. Mezclar 10 μL de las células diluidas con 10 μL de azul de tripano y contar con un hemocitómetro y/o contador celular.
  9. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min. Aspirar el sobrenadante y resuspender las células a 33 x 106 células vivas/ml en SB5.
  10. Prepare el cóctel Lin-FITC mezclando volúmenes iguales de cada anticuerpo en la Tabla 3.
  11. Prepare las celdas para controles de un solo color y controles de "fluorescencia menos uno" (FMO). Realizar los pasos 1.11-1.12 en paralelo con la preparación y tinción de las células de muestra en el paso 1.14 (muestras para análisis citométrico de flujo) y/o en el paso 2.1 (clasificación por citometría de flujo).
    1. Preparar las células para un control celular no teñido transfiriendo 50 μL (1,6 x 106 células) de la suspensión celular a un tubo FACS sobre hielo. Prepare las celdas para cada control de color único (11 tubos) transfiriendo 50 μL (1,6 x 106 celdas) de la suspensión celular a un tubo FACS sobre hielo.
    2. Prepare los controles FMO para los siguientes colores (Kit, CD41, CD150, CD49f [cuatro tubos]) transfiriendo 300 μL (10 x 106 celdas) de la suspensión celular a un tubo FACS separado sobre hielo.
    3. Girar las células a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante.
  12. Tinción de anticuerpos de FMO y controles de un solo color
    1. Tinción de los FMO a 33 x 106 células/ml (en un volumen total de 300 μL) en tubos FACS. Para cada control, agregue todos los anticuerpos excepto el anticuerpo homónimo del FMO. Por ejemplo, para el Kit FMO, omita el anticuerpo Kit. Para cada anticuerpo, use la dilución y la concentración final como en la Tabla 2.
    2. Teñir los controles de color único a 20 x 106 células/ml (en un volumen total de 50 μL) en tubos FACS; para cada control, añadir un único anticuerpo a la concentración indicada en la Tabla 2.
    3. Vortex cada tubo de control durante 2-3 s a 3.000 rpm (rotaciones por minuto), y luego incubar a 4 °C, balanceándose durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz. Balancee los tubos con un eje de rotación paralelo a la longitud del tubo, entre aproximadamente un ángulo de 10° y 60° desde la horizontal, de modo que el contenido no toque la tapa.
    4. Lave las celdas con SB5: Enrasar el volumen de la suspensión celular a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
  13. Resuspensión celular:
    1. Resuspenda los controles sin teñir y todos los controles de un solo color (excepto el control DAPI) en 300 μL de SB5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 μm en un nuevo tubo FACS.
    2. Haga una solución DAPI/SB5 diluyendo el stock de DAPI (1 mg/ml en etanol al 100%) a 1:10.000 en SB5.
    3. Resuspender los FMO en 1,8 ml de DAPI/SB5 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un nuevo tubo FACS
    4. Vuelva a suspender el control de color único DAPI en 300 μL de DAPI/SB5 y filtre a través de una malla de filtro de 40 μm en un nuevo tubo FACS de 4 ml.
  14. Preparación de la muestra: Si las células se están preparando para el análisis citométrico de flujo, vaya al paso 1.14. Si prepara las celdas para la ordenación, vaya al paso 2.1.
  15. Tinción de las muestras de análisis citométrico de flujo a 33 x 106 células/ml en un volumen total de 300 μL (10 x 106 células) en tubos FACS:
    1. Prepare la mezcla maestra de anticuerpos. Determinar el volumen de la mezcla maestra por el número de muestras, con 300 μL por muestra. Haga la mezcla maestra diluyendo todos los anticuerpos enumerados en la Tabla 2 en la dilución indicada en SB5. El Rabbit IgG en la mezcla maestra sirve como un bloque Fc.
    2. Vortex cada tubo durante 2-3 s a 3.000 rpm, y luego incubar a 4 °C, balanceando durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz.
    3. Lave las celdas con SB5: Enrasar el volumen de la suspensión celular a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
    4. Resuspender las muestras para el análisis citométrico de flujo en 1,8 ml de DAPI/SB5 preparado en el paso 1.12.5.2 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un tubo FACS.
    5. Analizar las muestras en un citómetro con 10 canales para acomodar los conjugados de anticuerpos en la Tabla 2 y el colorante de viabilidad DAPI. En la Tabla 1 se proporciona un ejemplo de configuración de canal. También es posible utilizar sólo nueve canales; véase la leyenda de la Tabla 2 .
    6. Durante el análisis de los datos de citometría de flujo, utilice enfoques de compensación espectral estándar con la ayuda de los controles de un solo color y los controles FMO como se detalla en el paso 2.4.

2. Ajustes del protocolo para la clasificación por citometría de flujo

  1. Preparación de Lin-
    1. Agrupe todas las células extraídas del mismo tejido (ya sea BM o bazo) de 10 ratones en un tubo de 50 ml. Resuspenda cada muestra agrupada pipeteando con un P1000 con una punta de orificio grande.
    2. Girar las células a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante.
    3. Prepare controles de un solo color y FMO como se describe en la sección 1 utilizando células no enriquecidas.
    4. Enriquecer las células de Lin para su clasificación mediante el enriquecimiento magnético de las células de lin:
    5. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml con SB5 y transferirlas a un tubo de 15 ml. Añadir suero normal de rata y los anticuerpos biotinilados enumerados en la Tabla 4 e incubar con balanceo a 4 °C durante 1 h.
    6. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células en 15 mL de SB5 frío.
    7. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml en SB5 frío y mantenerlas en hielo.
    8. Vortex las nanoperlas magnéticas a 3.000 rpm durante 5-10 s. Tome 1 ml de nanoperlas magnéticas por cada 10 ml de células.
    9. Lave las nanoperlas en un tubo FACS de 5 ml. Enrasar el volumen a 4 ml con SB5, girar a 900 x g, 4 °C durante 5 min, y aspirar el sobrenadante.
    10. Resuspender las nanoperlas en 500 μL de SB5 y mezclar con las células preparadas en el paso 2.1.7. Incubar a 4 °C con balanceo durante 15 min.
    11. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min y aspirar el sobrenadante. Resuspender las células a 1 x 108 células/ml con SB5.
    12. Colocar el tubo sobre un imán a 4 °C durante 5 min.
    13. Vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml.
    14. Colocar el tubo que contiene el sobrenadante del paso 2.1.13 en un imán a 4 °C durante 5 min. Vierta con cuidado el sobrenadante en un nuevo tubo de 15 ml.
    15. Girar las células del sobrenadante en el paso 2.1.14 a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y aspirar el sobrenadante.
    16. Resuspender las células enriquecidas con Lin en 1 ml de SB5.
    17. Diluir 10 μL de las células a 1:100 en SB5. Mezclar 10 μL de las células diluidas con 10 μL de azul de tripano y contar con un hemocitómetro y/o contador celular.
    18. Según el recuento de células en el paso 2.1.17, resuspender las células enriquecidas con Lin a 33 x 106 células/ml.
  2. Tinción de células enriquecidas:
    1. Teñir las muestras de células enriquecidas a 33 x 106 células/ml en tubos FACS añadiendo todos los anticuerpos enumerados en la Tabla 2. Vortex cada tubo durante 2-3 s a 3.000 rpm, y luego incubar a 4 °C, balanceando durante 2,5 h en la oscuridad, protegido de la luz.
    2. Lavar las celdas con SB5: Enrasar el volumen de los tubos FACS a 4 mL con SB5. Girar las células hacia abajo a 900 x g, 4 °C durante 10 min, y retirar el sobrenadante.
    3. Resuspender las muestras para el análisis citométrico de flujo en 4-6 ml de DAPI/SB5 como se preparó en el paso 1.12.5.2 y filtrar a través de una malla filtrante de 40 μm en un nuevo tubo FACS de 4 ml.
  3. Clasificación de muestras:
    1. Clasifique las muestras con una boquilla grande y baja presión para maximizar el rendimiento de CFU-e, ya que las células CFU-e se dañan fácilmente a alta presión. Para el citómetro de flujo utilizado en este estudio, use 14 psi y una boquilla de 100 μm o 12 psi con una boquilla de 130 μm. Configure las puertas de clasificación como se describe en el paso 2.4 a continuación.
    2. Prepare el tampón de recolección: agregue un 20% de suero bovino fetal al PBS.
    3. Para comprobar la pureza de las poblaciones ordenadas, vuelva a ejecutar una pequeña alícuota de cada población ordenada en un búfer que contenga DAPI, como se describe en el paso 1.12.5.2.
      NOTA: Típicamente, BM de un total de 10 ratones (aproximadamente 1 x 109 células) produce al menos 50,000-100,000 células para cada una de las poblaciones P1-hi, P1-low y P2 con una viabilidad de aproximadamente 70%.
  4. Utilice la estrategia de acceso que se muestra en la figura 3 para analizar o configurar las puertas de clasificación.
    1. Utilice el parámetro de dispersión directa (FSC) para eliminar los residuos en función del tamaño. Utilice el histograma FSC-altura versus FSC-área para excluir agregados de celdas y seleccionar celdas individuales; repita con el histograma de altura de dispersión lateral (SSC) versus área de SSC.
    2. Excluya las células muertas eliminando las células que son positivas para el colorante de ADN DAPI, al que las células viables son impermeables.
    3. Seleccione las células Lin-Ter119-Kit+ y, de estas, seleccione una subpoblación que exprese CD55.
    4. Subdivida las células Lin-Ter119-Kit+CD55+ en dos poblaciones principales, P6 y P7, basándose en la expresión de CD49f y CD105.
    5. Según la expresión de CD150 y CD41, subdivida P6 en P3 (progenitores basófilos o mastocitos), P4 (progenitores megacariocíticos) y P5 (EBMP y MPP con sesgo eritroide).
    6. Según la expresión de CD150 y CD71, subdivida P7 en P2 (BFU-e), UFC-e temprana (P1-baja) y UFC-e tardía (P1-hi).

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Resultados

El protocolo describe un enfoque citométrico de flujo para identificar BFU-es y UFC-es en células de médula ósea y bazo recién cosechadas. Comienza con la recolección de BM fresco y bazo de ratones e inmediatamente la colocación del tejido en hielo. Todos los procedimientos se realizan en el frío para preservar la viabilidad celular. Las células se marcan con un cóctel de anticuerpos de "linaje" que permite la exclusión de todas las células que expresan marcadores de linajes sanguíneos diferenciados (el cóctel FITC-Lin, ...

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Discusión

La capacidad de aislar prospectivamente progenitores de BFU-e y CFU-e directamente de tejido fresco con alta pureza había eludido previamente a los investigadores. Nuestro nuevo enfoque, validado utilizando scRNAseq y ensayos de destino celular 1,27, ahora ofrece las herramientas para hacer esto.

Hay una serie de puntos clave para ejecutar con éxito tanto la clasificación como los protocolos analíticos. Primero, las células deben hilar...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

Este trabajo es apoyado por las subvenciones de los NIH R01DK130498, R01DK120639 y R01HL141402

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0,5 M EDTA, pH 8,0Life Technologies15575020
1000 y micro; L puntas de orificio grandeUSA sceintific1011-9000
Alexa Fluor 647 anti-ratón CD55 (DAF) AnticuerpoBioLegend131806
APC/Cyanine7 anti-ratón CD117 (c-kit) AnticuerpoBioLegend105826
Biotina-CD11bBD Biosciences557395M1/70 (clon)
Biotina-CD19BD Biosciences5537841D3 (clon)
Biotina-CD4BD BiosciencesBDB553045RM4-5 (clon)
Biotina-CD8aBD BiosciencesBDB55302953-6.7 (clon)
Biotina-F4/80Biolegend123106BM8 (clon)
Biotina-Ly-6G y Ly-6CBD Biosciences553125RB6-8C5 (clon)
Biotina-TER-119BD Biosciences553672TER-119 (clon)
Albúmina sérica bovinaSigma aldritchA1470
Violeta Brillante 421 anti-humano/ratón CD49f AnticuerpoBioLegend313624
Brilliant Violet 605 anti-ratón Anticuerpo CD41BioLegend133921
Brilliant Violet 650 anti-ratón CD150 (SLAM) AnticuerpoBioLegend115931
BUV395 Rata Anti-Ratón TER-119/Eritroide CélulasBD Biosciences563827
ChromPure Rabbit IgG, molécula enteraJackson ImmunoResearch Laboratories011-000-003
DAPI (4',6-Diamidino-2-Fenilindol, diclorhidrato)Life TechnologiesD1306
Digital DIVA hardware y software para LSR IIBD Biosciences
FITC anti-ratón F4/80 AnticuerpoBioLegend123108
FITC Rata Anti-CD11bBD Biosciences557396
FITC Rata Anti-Ratón CD19BD Biosciences553785
FITC Rata Anti-Ratón CD4BD Biosciences553047
FITC Rata Anti-Ratón CD8aBD Biosciences553031
FITC Rata Anti-Ratón Ly-6G y LY-6CBD Biosciences
software FlowJo FlowJoversión 10Software de análisis de citómetros de flujo
LSR II analizador de citómetro de flujo multiparamétrico digitalBD Biosciencesflujo 
NewlineNY Machacadora de mano de acero inoxidable & Juego de tazón, mortero y morteroSuero de rata normal amazónico
Tecnologías de células madre13551
PE anti-ratón CD105 Anticuerpo BioLegend120408
PE/Cyanine7 anti-ratón CD71 Anticuerpo BioLegend113812
Solución salina tamponada con fosfato, 10xFisher scientificBP3994
Estreptavidina NanobeadsBioLegend480016Cuentas magnéticas
553127 Citómetro de

Referencias

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