Una plataforma de alto rendimiento para el cultivo y la obtención de imágenes 3D de organoides

En los cultivos celulares 3D organotípicos, en lo sucesivo denominados organoides, las células madre se diferencian y se autoorganizan en estructuras espaciales que comparten fuertes similitudes morfológicas y funcionales con órganos reales. Los organoides ofrecen modelos valiosos para estudiar la biología humana y el desarrollo fuera del cuerpo ^1,2,3. Se está desarrollando un número creciente de modelos que imitan el hígado, el cerebro, el riñón, el pulmón y muchos otros órganos ^2,4,5. La diferenciación en organoides está dirigida por la adición de factores de crecimiento solubles y una matriz extracelular en una secuencia de tiempo precisa. Sin embargo, en marcado contraste con los órganos, el desarrollo de los organoides es bastante heterogéneo.

Más allá de numerosos desafíos biológicos^6,7, los cultivos de organoides también plantean desafíos tecnológicos en términos de métodos de cultivo celular, caracterización de la transcriptómica e imágenes. El desarrollo de órganos in vivo ocurre en un entorno biológico que resulta en una autoorganización altamente estereotipada de los arreglos celulares. Cualquier alteración fenotípica puede ser utilizada como un proxy para diagnosticar un estado enfermo. En contraste, los organoides se desarrollan in vitro en microambientes mínimamente controlados compatibles con las condiciones de cultivo celular, lo que resulta en una gran variabilidad en la ruta de desarrollo y la formación de formas para cada organoide individual.

Un estudio reciente⁸ demostró que la imagen cuantitativa de la forma de organoides (descriptores fenotípicos) junto con la evaluación de unos pocos marcadores genéticos permite la definición de paisajes de desarrollo fenotípico. Podría decirse que la capacidad de relacionar la diversidad de la expresión genómica en organoides con su comportamiento fenotípico es un paso importante hacia la liberación de todo el potencial de los cultivos organotípicos. Por lo tanto, pide el desarrollo de enfoques de imagen dedicados y de alto contenido que permitan la caracterización de características organoides a escalas subcelulares, multicelulares y organoides completas en 3D ^9,10.

Desarrollamos una plataforma versátil de detección de alto contenido (HCS) que permite el cultivo de organoides optimizados (desde células madre embrionarias humanas aisladas [hESCs], células madre pluripotentes inducidas humanas [hIPSC] o células primarias hasta organoides diferenciados, multicelulares y 3D) e imágenes 3D rápidas y no invasivas. Integra un dispositivo de cultivo celular 3D miniaturizado de próxima generación, llamado chip JeWells (el chip en adelante), que contiene miles de micropozos bien dispuestos flanqueados por espejos de 45 ° que permiten obtener imágenes rápidas, 3D y de alta resolución mediante microscopía de hoja de luz de un solo objetivo¹¹. Compatible con cualquier microscopio estándar, comercial e invertido, este sistema permite obtener imágenes de 300 organoides en 3D con resolución subcelular en <1 h.

La microfabricación del dispositivo de cultivo celular parte de un molde microestructurado existente, que contiene cientos de micropirámides (Figura 1A) con una base cuadrada y paredes laterales a 45 ° con respecto a la base. La Figura 1C muestra imágenes de microscopio electrónico (EM) de tales estructuras. El molde en sí está hecho de poli (dimetilsiloxano) (PDMS) y se puede hacer como una réplica de un molde primario (no se muestra aquí) con las características correspondientes (como cavidades) utilizando procedimientos litográficos blandos estándar. El molde primario puede ser producido por diferentes procedimientos. El utilizado para este protocolo se realizó utilizando grabado húmedo de silicio como se informó en Galland et al. ¹¹; El procedimiento para la fabricación del molde primario no es crítico para este protocolo. Las pirámides están dispuestas en una matriz cuadrada, con el mismo paso para las direcciones X e Y (en este caso el paso es de 350 μm).

Como ilustración, se publicaron experimentos de prueba de concepto¹² para demostrar que el chip permite protocolos de cultivo y diferenciación a largo plazo (meses) al tiempo que define con precisión el número de células iniciales en los pozos. El desarrollo individual de un gran número de organoides se puede monitorear automáticamente en vivo utilizando microscopios de fluorescencia estándar de campo claro y de hoja de luz 3D. Además, los organoides se pueden recuperar para realizar más investigaciones biológicas (por ejemplo, análisis transcriptómico). Este documento describe protocolos detallados para la fabricación de los cubreobjetos de cultivo celular, el procedimiento de siembra y tinción para microscopía de fluorescencia, así como la recuperación de los organoides.

NOTA: La primera parte de este protocolo detalla la microfabricación del dispositivo de cultivo celular. Un molde primario original con cavidades piramidales puede producirse internamente, si hay instalaciones de microfabricación disponibles, o subcontratado a empresas externas. El molde primario utilizado en este trabajo se produce internamente, con pasos del proceso de fabricación descritos en otra parte^11,13. Un protocolo básico para la microfabricación del molde está disponible en el Archivo Suplementario 1. CRÍTICO: Las operaciones en los pasos 1 a 6 deben llevarse a cabo en un ambiente libre de polvo. Se prefiere una campana de flujo laminar o una sala limpia, si está disponible. A lo largo de estos pasos, se debe usar equipo de protección personal (EPP), como guantes, una bata de laboratorio y gafas de seguridad.

1. Dados de molde PDMS

1. Corte pequeñas porciones del molde PDMS a la dimensión requerida para el dispositivo final (por ejemplo, 1 cm x 1 cm [Figura 1B]). Córtelos paralelos a las direcciones XY de la matriz.
   CRÍTICO: Al cortar el molde PDMS en dados de 1 cm x 1 cm, ejecute los cortes en pasos individuales; usando una cuchilla de afeitar de un solo lado, aplique presión y corte a través del PDMS en un solo paso. Esto es para evitar la formación de pequeñas partículas de PDMS, que pueden depositarse en la superficie del molde y afectar la calidad de los pasos de réplica (paso 3).

2. Preparación de sustratos planos de PDMS

1. Pesar ~ 15-20 g de resina base PDMS y 1.5-2 g de su agente de reticulación (es decir, una proporción de 10: 1), mezclarlos cuidadosamente y desgasificar en un frasco de vacío durante ~ 20 min.
2. Vierta lentamente el PDMS desgasificado sobre una placa de Petri de plástico de 15 cm de ancho (diámetro).
3. Curar el PDMS manteniendo la placa de Petri en un horno a 65 ° C durante 2 h. Después de esperar a que se complete el curado, una película PDMS plana de ~ 1.5 mm de espesor (contenida en la placa de Petri) está lista para su uso (Figura 2A).
4. Con una cuchilla afilada, corte piezas de 2 cm x 2 cm del PDMS (Figura 2B-D).
   NOTA: El grosor exacto de esta hoja PDMS no es crítico; ~1-2 mm es un rango adecuado. La dimensión para el corte debe ser más grande que el molde texturizado pero no mucho más grande, lo que resultaría en desperdicio de material.

3. Producción de la capa texturizada hecha de adhesivo curable UV

1. Coloque un dado de molde PDMS (como se preparó en el paso 1) boca abajo sobre el corte plano de PDMS (como se preparó en el paso 2) (Figura 3A, B).
   NOTA: Asegúrese de que las protuberancias piramidales en el molde estén orientadas hacia el sustrato PDMS plano y que solo la superficie superior de las pirámides truncadas esté en contacto. Evalúe la colocación correcta con un microscopio óptico (Figura 3C, D).
2. A un lado del molde, usando una pipeta, deje caer una pequeña cantidad (dos gotas, aproximadamente 0.1-0.2 ml) de adhesivo curable por UV (Figura 4A).
   NOTA: A medida que el líquido entra en contacto con el borde del molde, la capilaridad impulsará el líquido a llenar la cavidad entre el molde y el corte plano de PDMS utilizado como sustrato.
   1. Siga la progresión del líquido dentro de la cavidad, por ejemplo, utilizando un microscopio óptico invertido con un objetivo de aumento de 10x (Figura 4B, C).
3. Exponga el adhesivo curable UV a la luz UV para curarlo. Ajuste el tiempo de exposición dependiendo de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (por ejemplo, una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm 2;² min al 50% de potencia en este protocolo para curar el adhesivo por completo).
4. Usando la cantidad excesiva de adhesivo en un borde, sostenga el adhesivo curado sobre el sustrato plano de PDMS presionando suavemente con un dedo (Figura 5A, B). Mientras tanto, use pinzas para pellizcar una esquina del molde junto al mismo borde que se mantiene presionado y despéguelo lentamente mientras se asegura de que la película texturizada no se levante también.
   NOTA: La Figura 5C muestra el resultado de un procedimiento adecuado de eliminación de moho; La figura 5E-G muestra el procedimiento incorrecto.
5. Recorte el exceso de adhesivo y el exceso de sustrato de PDMS con una cuchilla de afeitar para dejar la capa adhesiva curada y texturizada plana sobre el PDMS con exceso de PDMS en un solo borde (Figura 5D), que será necesario en el paso 5.

4. Preparación del sustrato de cubreobjetos

NOTA: Como sustrato para el dispositivo final, se utilizan cubreobjetos redondeados estándar de 1,5 H con 25 mm de diámetro. Antes de que puedan ser utilizados, necesitan ser limpiados para eliminar el polvo y/o residuos orgánicos de su superficie.

1. Limpieza de cubreobjetos
   1. Sumerja los cubreobjetos en agua jabonosa durante 5 minutos mientras se aplica el ultrasonido (40 kHz, potencia sónica de 110 W).
   2. Lave los cubreobjetos en agua limpia desionizada (DI), primero por inmersión y finalmente con agua DI corriente de un grifo. Seque los cubreobjetos con una cerbatana de gas N₂ .
   3. Sumerja los cubreobjetos en un baño de acetona durante 5 minutos; Cambie inmediatamente a un baño de 2-propanol (IPA) durante 5 minutos adicionales.
   4. Enjuague los cubreobjetos con IPA limpia usando una botella apretada. Seque los cubreobjetos con la cerbatana de gas N₂ .
      NOTA: Los cubreobjetos limpiados con este procedimiento se pueden almacenar en un recipiente cerrado hasta que sea necesario. Manténgalos en un gabinete seco para evitar que la humedad se deposite en su superficie.
2. Cuando esté listo para ser utilizado, trate un cubreobjetos limpios con un proceso corto de plasma de_O2 para mejorar su hidrofilicidad: O₂ 20 sccm, presión de 3 mbar, 60 W en el generador de potencia de RF y 60 s de duración.
3. Inmediatamente después de la activación por plasma, proceda con el recubrimiento por centrifugado de la capa delgada de adhesivo curable UV colocando el cubreobjetos en el mandril de vacío de un recubridor de centrifugado estándar y vertiendo una pequeña gota de adhesivo en el centro del cubreobjetos (Figura 6). Ejecute el proceso de centrifugado: extendiendo durante 5 s a 500 rpm, recubrimiento a 3.000 rpm durante 45 s (con la aceleración y desaceleración ajustadas a 100 rpm/s).
   1. Si el recubrimiento por centrifugado no está disponible, use la siguiente forma alternativa para producir una película delgada de adhesivo UV en los cubreobjetos:
      1. En un cubreobjetos limpio, deje caer ~0,1 ml de adhesivo curable UV con una pipeta (Figura 7A).
      2. Tome un segundo cubreobjetos y colóquelo encima del primero para que el adhesivo líquido se extienda uniformemente entre los dos cubreobjetos (Figura 7B-D).
      3. Una vez que el adhesivo extendido haya alcanzado los bordes de los cubreobjetos, sepárelos suavemente deslizando uno sobre el otro. Una vez separados, ambos cubreobjetos están completamente recubiertos con una fina capa de adhesivo líquido (Figura 7E).
         NOTA: El recubrimiento puede no ser uniforme y liso solo si la separación no se realiza con un movimiento suave y continuo.
4. Precurado de adhesivo curable UV
   1. Después del recubrimiento por centrifugado, precure el adhesivo por exposición a los rayos UV. Ajuste el tiempo de exposición en función de la densidad de potencia de la fuente UV utilizada (aquí, se utilizó una caja UV-LED con una densidad de potencia de 35 mW / cm² durante 1 min al 50% de potencia).
      CRÍTICO: El adhesivo utilizado aquí es un pegamento óptico. Vea la discusión para puntos clave relacionados con las dosis de energía para su curado.

5. Transferencia de la película texturizada al sustrato final

1. Tome una de las películas texturizadas (preparada en el paso 3) y colóquela en contacto con el cubreobjetos recubierto de adhesivo (preparado en el paso 4). Asegúrese de que el contacto entre el adhesivo parcialmente curado en el cubreobjetos y la película texturizada sea lo más uniforme posible (Figura 8A-C).
   CRÍTICO: En esta etapa, el adhesivo en el cubreobjetos debe ser lo suficientemente sólido como para evitar el reflujo, lo que llenaría las cavidades piramidales de la película texturizada cuando se coloca en contacto, pero también sería lo suficientemente plástico y adhesivo como para que el contacto se pueda optimizar presionando suavemente la película texturizada.
2. Exponga los cubreobjetos a la luz UV hasta que la capa adhesiva recubierta en el cubreobjetos esté completamente curada. Esto sellará la película texturizada en el cubreobjetos y proporcionará un aislamiento a prueba de fugas entre las cavidades piramidales.
3. Finalmente, retire el sustrato plano PDMS (Figura 8D-F). Con unas pinzas, pellizque el PDMS en una esquina del borde donde quedó el exceso de material después del recorte (paso 3.5). De esta manera, la capa de película texturizada se deja adhesiva al cubreobjetos con acceso abierto en la parte superior para la siembra celular. CRÍTICO: Al despegar el PDMS plano, la película texturizada debe permanecer bien adherida al cubreobjetos. Los fallos de adhesión se confirman fácilmente si la película texturizada se puede despegar del cubreobjetos después de la exposición final a los rayos UV sin ningún esfuerzo.

6. Pasivación a largo plazo del cubreobjetos de cultivo celular para cultivo celular

NOTA: La pasivación se logra generando un recubrimiento conforme y continuo de un copolímero biomimético con una estructura similar al grupo polar de fosfolípidos en la membrana celular. Este recubrimiento conformado evita la adhesión de las células al dispositivo de cultivo celular

1. Preparar una solución con 0,5% (p/v) del copolímero biomimético disuelto en etanol puro. Conservar la solución a 4 °C para utilizarla en el futuro.
2. Coloque el cubreobjetos de cultivo celular en una placa de Petri de 35 mm y cúbralo completamente con la solución de copolímero biomimético.
3. Después de 5 min, retire el cubreobjetos de cultivo celular del recipiente con la solución de copolímero biomimético y déjelo secar a temperatura ambiente dentro del plato final en una campana de bioseguridad (>1 h).
   NOTA: Se puede producir un recubrimiento más grueso aumentando la concentración del copolímero biomimético en la solución de recubrimiento; los resultados de un recubrimiento más grueso son visibles bajo un microscopio de campo claro (Figura 9A).

7. Siembra celular

1. Desgasificación y esterilización
   1. Justo antes de la siembra celular, dispense solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS) en las placas de cultivo celular (típicamente 1 ml para una placa de Petri de 35 mm). Desgasifique el plato con el PBS estéril usando un dispositivo ultrasónico durante ~ 10 minutos, seguido de varias rondas de pipeteo para eliminar todas las burbujas.
      CRÍTICO: Si el aire queda atrapado dentro de las cavidades piramidales, evitará que las células entren en ellas. Para asegurarse de que no haya aire atrapado en la pirámide antes de la siembra celular, se recomienda asegurar visualmente (bajo un microscopio de campo claro de sobremesa con un aumento de 10x o 20x) la ausencia de aire en estas cavidades (Figura 10).
   2. Reemplace el PBS con medio de cultivo estéril y esterilice la placa con luz UV durante 30 minutos bajo una campana de cultivo celular.
      NOTA: A partir de este paso, el plato debe considerarse estéril y manipularse utilizando técnicas estériles. Una forma alternativa de eliminar el aire atrapado del dispositivo de cultivo celular es usar un frasco de vacío con una bomba de vacío.
2. Preparación de la suspensión celular
   NOTA: Las celdas se pueden sembrar como agregados de células simples o pequeñas e ingresar a los pocillos de muestra a través de la abertura superior. Con el tiempo, las células insertadas se agregan y crecen dentro de los pozos de muestra en esferoides de un tamaño mayor que el tamaño de la abertura. Como modelos de línea celular validados, utilice células cancerosas HCT116 (CCL-247 ATCC) o MCF7 (HTB-22 ATCC) mantenidas en el medio de cultivo recomendado (directrices ATCC).
   1. Preparar una suspensión celular (p. ej., utilizando un proceso de tripsinización siguiendo las pautas de ATCC). Siga las recomendaciones de preparación de tripsinización/suspensión celular para las células de interés.
   2. Contar y ajustar la concentración celular a 0,5 × 10⁶ células/ml en el medio de cultivo recomendado.
3. Dispensación celular
   1. Retire el tampón PBS de la placa de cultivo celular de 35 mm y luego dispense 1 ml de la suspensión celular ajustada. Consulte la Figura 11A para obtener una imagen de microscopio óptico de un procedimiento de siembra celular con densidad celular y homogeneidad adecuadas.
   2. Vuelva a colocar la placa de cultivo celular en la incubadora celular (37 °C, 5% de_CO2 y 100% de humedad) durante 10 min. Aproximadamente 80-100 células entrarán en cada cavidad piramidal.
      NOTA: Es posible aumentar el número de células por placa de cultivo celular aumentando la concentración celular o el tiempo empleado antes de la eliminación de la suspensión celular. Típicamente, la formación de esferoides toma varias horas (dependiendo del tipo de célula) después de la siembra celular y se puede seguir con un microscopio de campo claro (objetivos de 4x a 40x; Figura 11). A partir de aquí, el medio de cultivo, las matrices extracelulares y los factores de crecimiento de diferenciación se pueden cambiar o agregar a la placa de cultivo celular que contiene los esferoides de acuerdo con los protocolos de diferenciación típicos que podrían durar unos pocos días, semanas o meses.
   3. Después de la incubación de 10 minutos, recupere la placa de cultivo celular de la incubadora y aspire suavemente la suspensión celular para eliminar las células no atrapadas. Agregue 1 ml de medio de cultivo a un plato de 35 mm y colóquelo nuevamente en la incubadora celular.
      CRÍTICO: En esta etapa, debido a que los esferoides aún no se han formado, es muy importante evitar la aspiración fuerte o la dispensación que resultará en la pérdida de las células. El control visual con un microscopio de campo claro de sobremesa es muy recomendable en este paso.

8. Inmunotinción e imagen

1. Fijación y tinción
   NOTA: Los diferentes procedimientos clásicos de fijación e inmunotinción son completamente compatibles con la placa de cultivo celular. Aquí se describe un protocolo típico.
   1. Fijar los organoides/esferoides en la placa de cultivo celular durante 20 minutos en paraformaldehído al 4% a temperatura ambiente.
   2. Permeabilizar los organoides durante 24 h en una solución de tensioactivo al 1% en PBS estéril a 4 °C en un agitador orbital e incubar durante 24 h en tampón de bloqueo (albúmina sérica bovina [BSA] al 2% y surfactante al 1% en PBS estéril) a 4 °C en un agitador orbital.
   3. Incubar las muestras con anticuerpos primarios de interés en una dilución entre 1/50 y 1/200 (o según las recomendaciones del fabricante) en tampón de dilución de anticuerpos (2% BSA y 0,2% surfactante en PBS estéril) a 4 °C durante 48 h.
   4. Enjuagar las muestras 3 veces con tampón de lavado en un agitador orbital (3% de NaCl y 0,2% de surfactante en PBS estéril) e incubar con los anticuerpos secundarios correspondientes en el tampón de dilución de anticuerpos (dilución entre 1/100 y 1/300 o según las recomendaciones del fabricante), 0,5 μg/ml de 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) y 0,2 μg/ml de Alexa Fluor 647 o 488 Faloidina a 4 °C durante 24 h en un agitador orbital, seguido de cinco pasos de enjuague con PBS. Opcionalmente, montar las muestras utilizando un agente de limpieza soluble en agua precalentado a 37 °C.
2. Imagenológico
   NOTA: En esta etapa, los organoides en la placa de micropocillos pueden considerarse como una placa de cultivo normal que contiene muestras fijas y teñidas para imágenes: cualquier procedimiento de imagen estándar se puede utilizar sin necesidad de adaptación o modificación. La figura 12 ilustra un resultado representativo de imágenes y reconstrucción 3D obtenidas utilizando un microscopio confocal de disco giratorio, con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica 0,75).
   1. Utilice software constructor para el proceso automático de adquisición de imágenes con los siguientes ajustes: tiempo de exposición = 50 ms, con una platina motorizada z para adquirir una pila z (paso z de 1 μm, para una altura total de 70 μm).
   2. Realice la reconstrucción 3D utilizando software de análisis de imágenes.

9. Liberación y recolección de los organoides

NOTA: La capa adhesiva texturizada de la placa de cultivo celular se puede separar del cubreobjetos para liberar los esferoides / organoides vivos (antes de la fijación) contenidos dentro de las cavidades piramidales para el análisis de las células con otros procedimientos como secuenciación de ARN, enfoques ómicos, experimentos in vitro y trasplante in vivo .

1. Con la muestra todavía en la placa de Petri y en una campana de bioseguridad, use una cuchilla como un bisturí para cortar una esquina de la capa adhesiva texturizada.
2. Con pinzas, pellizque la capa adhesiva texturizada en el borde cortado y despéguela suavemente del cubreobjetos de vidrio, pero manténgala sumergida en el medio (algunos organoides podrían permanecer con la capa adhesiva, Figura 13).
3. Enjuagar 3x con medio de cultivo y recoger los organoides por pipeteo.

La Figura 8F muestra el aspecto típico de un cubreobjetos de cultivo celular después de una fabricación exitosa. La capa adhesiva curable UV aparece plana y se adhiere bien al cubreobjetos. La transferencia de la capa adhesiva en el cubreobjetos puede fallar si la capa del cubreobjetos se cura en exceso, o si la eliminación del sustrato PDMS plano se realiza incorrectamente (como se muestra en la Figura 8G, H). En ambos casos, la falla es evidente ya que no se transfiere ninguna película texturizada al cubreobjetos.

Para que los micropocillos funcionen, la película texturizada producida (como se describe en el paso 3 del protocolo) debe tener abiertos los lados superior e inferior de las pirámides para garantizar que las células durante la siembra en el paso 7 puedan ingresar a las cavidades y permanecer contenidas una vez que los organoides comiencen a formarse. La Figura 9 muestra el aumento del espesor del recubrimiento al aumentar la concentración del copolímero biomimético en la solución de recubrimiento. La Figura 10 muestra los resultados de la desgasificación de las placas de cultivo celular para garantizar que no quede aire atrapado en las cavidades piramidales. La Figura 10A,B muestra la desgasificación completa, mientras que la Figura 10C,D muestra burbujas de aire en las cavidades piramidales.

En la Figura 11, las células quedan atrapadas dentro de las pirámides, y los organoides correspondientes se forman después de los días 2 y 15 de cultivo. Si la abertura superior de los micropocillos se cierra (como consecuencia del paso 3 incorrecto), no quedarán células después de enjuagar la muestra después de la siembra celular. La Figura 12 muestra imágenes representativas de los organoides y una reconstrucción 3D obtenida utilizando un microscopio confocal de disco giratorio con un objetivo de aire de 40x (apertura numérica 0,75). Después de la liberación y recolección, los organoides pueden almacenarse en un pequeño vial y usarse para análisis adicionales (por ejemplo, secuenciación de ARN). La Figura 13B muestra un ejemplo de una muestra de organoides recolectados como se describe.

Figura 1: Molde de poli(dimetilsiloxano). (A) El molde PDMS inicial obtenido como una réplica fundida de una oblea texturizada de 4" (ver Archivo Suplementario 1). (B) Corte de 1 cm x 1 cm de ancho del molde PDMS inicial. (C) Imágenes de microscopio electrónico de barrido de los pilares trapezoidales dispuestos en una matriz cuadrada, que pueblan la superficie del molde. Barras de escala = 1 cm (A), 100 μm y 200 μm (C superior e inferior, respectivamente). Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Sustrato PDMS plano. (A) Una capa de PDMS, ~1 mm de espesor, se prepara en una placa de Petri estándar de 15 cm de ancho. (B) Despegado de un corte fresco de PDMS. (C) El PDMS restante en la placa de Petri se puede cortar en más trozos para su uso posterior. (D) PDMS plano cortado y molde PDMS uno al lado del otro; el PDMS plano es más grande que el molde. Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Colocación del molde sobre el sustrato. (A) El molde se coloca sobre el sustrato plano con las pirámides hacia abajo. (B) Apariencia diferente de mal contacto (arriba) y buen contacto (abajo) entre el molde y el sustrato PDMS. (C) Imagen de microscopio óptico de un área con contacto deficiente; Los círculos rojos resaltan los pilares que no están en contacto con el sustrato, aparecen de un color más brillante que los que están en contacto en la misma imagen. (D) Imagen óptica de un área con todos los pilares en buen contacto. Barras de escala = 200 μm (C,D). Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 4: Llenado capilar de adhesivo curable UV . (A) Esta secuencia de imágenes muestra (de izquierda a derecha) el vertido de una pequeña cantidad de adhesivo en un borde y la progresión del adhesivo líquido en la cavidad entre el molde y el sustrato. Las flechas amarillas apuntan a la dirección del flujo de líquido. (B) Secuencia de imágenes ópticas (aumento de 40x) del frente líquido en movimiento; Cuando está en buen contacto, el frente del líquido se mueve alrededor de los bordes de las pirámides sin fugas. Las flechas amarillas apuntan a la dirección del flujo y las flechas rojas apuntan al borde delantero del frente líquido que se mueve alrededor de los bordes de contacto. (C) Secuencia de imágenes ópticas (40x) del frente líquido moviéndose cuando el contacto es deficiente; Las flechas rojas apuntan al borde delantero del líquido que se infiltra entre el molde y el sustrato. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 5: Eliminación del molde después del curado adhesivo. (A-C) Procedimiento correcto para despegar el molde: mientras se presiona suavemente el exceso de adhesivo en los bordes izquierdos con pinzas, el molde se pellizca cerca del mismo borde y se dobla lentamente para despegarse. (D) El resultado del procedimiento correcto; el exceso se recorta en tres bordes, mientras que un pequeño exceso de PDMS se deja en el cuarto lado (flecha amarilla). (E-G) Ejemplo de un procedimiento incorrecto para quitar el molde: el molde se pellizca con pinzas desde el borde opuesto, lo que resulta en la despegación del sustrato plano de la película adhesiva junto con el molde. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 6: Recubrimiento del cubreobjetos de vidrio. (A,B) Ejemplo de un buen procedimiento de recubrimiento: el cubreobjetos de vidrio se coloca en el mandril al vacío de un centrifugador, y se dispensa suficiente adhesivo en el centro, dando un recubrimiento homogéneo del cubreobjetos. (C,D) Ejemplo de un mal procedimiento de recubrimiento: no se dispensa suficiente adhesivo, lo que resulta en un recubrimiento no uniforme del cubreobjetos. (E) De izquierda a derecha, ejemplos de recubrimiento bueno, aceptable y malo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 7: Proceso de recubrimiento alternativo . (A) Se coloca una pequeña gota de adhesivo líquido en el centro del cubreobjetos. (B) Un segundo cubreobjetos se coloca suavemente encima del primero. (C,D) El líquido se extiende entre los dos cubreobjetos y se distribuye uniformemente. (E) Ejemplos de resultados después de la separación correcta de los cubreobjetos (izquierda) o la separación incorrecta (derecha). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 8: Transferencia al cubreobjetos. (A) La película adhesiva curada y recortada (Figura 5D) se coloca en el cubreobjetos con adhesivo parcialmente curado. (B) Ejemplo de buen contacto entre la película texturizada y el cubreobjetos. El recuadro es una imagen óptica que muestra el contacto uniforme de las áreas entre las cavidades trapezoidales (color uniforme oscuro). (C) Ejemplo de mal contacto entre la película texturizada y el cubreobjetos. Las áreas más brillantes no están en contacto, las flechas rojas apuntan a esas áreas. El recuadro es una imagen óptica que muestra la apariencia diferente de buen contacto (dos a la izquierda) y mal contacto (dos a la derecha). Barras de escala (amarillas, B,C) = 200 μm. (D,E) Procedimiento correcto para eliminar el sustrato plano PDMS: se utilizan pinzas para pellizcar el PDMS en el borde con exceso de PDMS y doblar para despegar suavemente. (F) El resultado con la película con textura adhesiva UV se transfirió con éxito al cubreobjetos. (G,H) Ejemplo de procedimiento de peeling incorrecto: las pinzas se utilizan para pellizcar el PDMS plano en uno de los bordes donde se recortó el exceso de material; por lo tanto, la película se retira junto con el PDMS plano. Abreviatura: PDMS = poli(dimetisiloxano). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 9: Recubrimiento con copolímero biomimético. (A) Dispositivo de cultivo celular recubierto con copolímero biomimético utilizando una solución de 0,5% (izquierda) o (B) 1% (derecha) (p/v) en etanol puro. Barra de escala = 100 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 10: Desgasificación del dispositivo de cultivo celular. (A) Dispositivo de cultivo celular antes de la desgasificación completa. (B) Dispositivo de cultivo celular después de la desgasificación completa; (C, D) dispositivo de cultivo celular con desgasificación parcial donde las burbujas de aire quedan atrapadas en las pirámides. Barras de escala = 200 μm (A-D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 11: Imágenes representativas de campo claro de la siembra celular y el crecimiento de organoides . (A) Las células son visibles flotando en la parte superior. (B) Células atrapadas en las cavidades piramidales después de enjuagar la suspensión celular. Solo las celdas atrapadas se conservarán como se muestra. (C) Las células se agregan para formar esferoides en cada cavidad (día 2 después de la siembra celular). (D) Imagen en el día 15 después de la siembra celular de un organoide que ha crecido en una cavidad piramidal. Barras de escala = 200 μm (A B), 120 μm (C) y 150 μm (D). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 12: Imágenes 3D de organoides. (A) Tres planos Z diferentes adquiridos utilizando un disco giratorio confocal (lente 40x, aire, apertura numérica: 0.75) de un organoide bajo diferenciación neuroectodermo (día 7 después de la siembra celular). Tinción de actina con faloidina (Alexa Fluor 647) en naranja e inmunotinción de N-cadherina (Alexa Fluor 561) en azul. (B) Una reconstrucción 3D utilizando software de análisis de imágenes de los organoides correspondientes (planos 80 Z, altura total de 100 μm). Flechas blancas: grupos de células alrededor de una raya con alto nivel de expresión de actina. Flechas azules: grupos celulares positivos para la expresión de la proteína N-cadherina. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 13: Liberación de organoides. (A) Eliminación de la capa adhesiva texturizada con pinzas; (B) imagen de campo claro de una suspensión organoide obtenida después de la extracción. Barra de escala = 200 μm (B). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Archivo complementario 1: Se presenta un protocolo paso a paso para la microfabricación de un molde de Si con microcavidades piramidales. Haga clic aquí para descargar este archivo.

Se ha publicado una solicitud internacional de patente con el número de publicación WO 2021/167535 A1.