La capacidad de los bacteriófagos para mover el ADN entre las células bacterianas los convierte en herramientas efectivas para la manipulación genética de sus huéspedes bacterianos. Aquí se presenta una metodología para inducir, recuperar y usar φBB-1, un bacteriófago de Borrelia burgdorferi, para transducir ADN heterólogo entre diferentes cepas de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme.
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Artículo de método
Manipulación genética mediada por fagos de la enfermedad de Lyme Espiroqueta Borrelia burgdorferi
En este artículo
Resumen
Resumen
La introducción de ADN extraño en la espiroqueta Borrelia burgdorferi se ha logrado casi exclusivamente mediante la transformación mediante electroporación. Este proceso tiene eficiencias notablemente más bajas en la espiroqueta de la enfermedad de Lyme en relación con otras bacterias Gram-negativas mejor caracterizadas. La tasa de éxito de la transformación depende en gran medida de tener cantidades concentradas de ADN de alta calidad de antecedentes específicos y está sujeta a una variabilidad significativa de cepa a cepa. Los medios alternativos para introducir ADN extraño (es decir, vectores lanzadera, reporteros fluorescentes y marcadores de resistencia a los antibióticos) en B. burgdorferi podrían ser una adición importante al arsenal de herramientas útiles para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Los bacteriófagos han sido bien reconocidos como mecanismos naturales para el movimiento del ADN entre las bacterias en un proceso llamado transducción. En este estudio, se ha desarrollado un método para utilizar el ubicuo fago borrelial φBB-1 para transducir ADN entre células de B. burgdorferi de los mismos y diferentes antecedentes genéticos. El ADN transducido incluye tanto ADN borrelial como ADN heterólogo en forma de pequeños vectores lanzadera. Esta demostración sugiere un uso potencial de la transducción mediada por fagos como complemento de la electroporación para la manipulación genética de la espiroqueta de la enfermedad de Lyme. Este informe describe métodos para la inducción y purificación del fago φBB-1 de B. burgdorferi, el uso de este fago en ensayos de transducción y la selección y selección de transductores potenciales.
Introducción
El desarrollo de herramientas para la manipulación genética de la bacteria espiroqueta Borrelia burgdorferi ha añadido un valor inconmensurable a la comprensión de la naturaleza de la enfermedad de Lyme 1,2,3,4. B. burgdorferi tiene un genoma inusualmente complejo compuesto por un pequeño cromosoma lineal y plásmidos lineales y circulares 5,6. La pérdida espontánea de plásmidos, el reordenamiento intragénico (movimiento de genes de un plásmido a otro dentro del mism....
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Protocolo
Todos los experimentos con ADN recombinante y organismos BSL-2 fueron revisados y aprobados por el Comité Institucional de Bioseguridad de la Universidad de Quinnipiac.
1. Preparación del cultivo de B. burgdorferi para la producción de φBB-1
- Preparar el medio Barbour-Stoenner-Kelly suplementado con suplementado con suero normal de conejo (BSK) inactivado por calor al 6,6%15. Para 1 L de 1x BSK, combinar los componentes enumerados en la Tabla 1 en 900 ml de agua, ajustar el pH a 7,6 utilizando 1 N de hidróxido de sodio y mezclar lentamente a 4 °C durante 2-4 h. Una ....
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Resultados
El uso de bacteriófagos para mover ADN entre cepas o clones de B. burgdorferi más fácilmente transformables que son recalcitrantes a la electrotransformación representa otra herramienta para la investigación molecular continua de los determinantes de la enfermedad de Lyme. El ensayo de transducción descrito en este documento puede modificarse según sea necesario para facilitar el movimiento de ADN entre cualquier clon de interés utilizando uno o dos antibióticos para la selección de posibles transductores. Se ha.......
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Discusión
El uso de la transducción podría representar un método para superar al menos algunas de las barreras biológicas y técnicas asociadas con la electrotransformación de B. burgdorferi 1,4,13,37. En muchos sistemas, el bacteriófago puede mover el ADN del huésped (no profago) entre las células bacterianas mediante transducción generalizada o especializada 22,23,24,49,50.
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Divulgaciones
El autor no tiene nada que revelar.
Agradecimientos
El autor desea agradecer a Shawna Reed, D. Scott Samuels y Patrick Secor por su útil discusión y a Vareeon (Pam) Chonweerawong por su asistencia técnica. Este trabajo fue apoyado por el Departamento de Ciencias Biomédicas y becas de investigación de la facultad a Christian H. Eggers de la Escuela de Ciencias de la Salud de la Universidad de Quinnipiac.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Unidades de filtro de 1 L (PES, 0,22 y micro; m tamaño de poro) | Millipore Sigma | S2GPU10RE | |
| tubo de 12 mm x 75 mm (tapa de doble posición) (polipropileno) | USA Scientific | 1450-0810 | tiene capacidad para 4 mL con bajo volumen de vacíos (para inducción) |
| Tubos de centrífuga cónicos de 15 mL (polipropileno) | USA Scientific | 5618-8271 | |
| 1-metil-3-nitroso-nitroguanidina (MNNG) | Millipore Sigma | ATENCIÓN: potencialmente cancerígeno; ya no están disponibles, no han probado ofrecen pipetas | |
| Pasteur de repuesto de 5,75" (taponadas de algodón/vidrio de borosilicato/no estériles) | Autoclave Thermo Fisher Scientific | 13-678-8A | antes de usar |
| centrífuga cónicos de 50 mL (polipropileno) | USA Scientific | 1500-1211 | |
| Etanol | |||
| Agarosa LE | Dot Scientific inc. | AGLE-500 | |
| Bacto Neopeptona | Gibco | DF0119-17-9 | |
| Bacto TC Yeastolate | Gibco | 255772 | |
| Albúmina sérica bovina (grado de reemplazo sérico) | Gemini Bio-Products | 700-104P | |
| Cloroformo (para biología molecular) | Thermo Fisher Scientific | BP1145-1 | ATENCIÓN: volátil orgánico; úselo solo en una campana de extracción química |
| CMRL-1066 sin L-glutamina (polvo) | US Biological | C5900-01 | grado de cultivo celular |
| Eritromicina | Research Products International Corp | E57000-25.0 | |
| Gibco | 15750-060 | ||
| Glucosa (dextrosa anhidra) | Thermo Fisher Scientific | BP350-500 | |
| HEPES | Thermo Fisher Scientific | BP310-500 | |
| Sulfato de kanamicina | Thermo Fisher Scientific | 25389-94-0 | |
| Millex-GS (0.22 µ Tamaño de poro M) | Millipore Sigma | SLGSM33SS | para filtrar antibióticos esterilizados y otras soluciones de pequeño volumen |
| Mitomicina C | Thermo Fisher Scientific | BP25312 | PRECAUCIÓN: carcinógeno potencial; úselo solo en una campana de gases químicos |
| N-acetil-D-glucosamina | MP Biomedicals, LLC | 100068 | |
| Oligonucleótidos (cebadores para PCR) | IDT DNA | ||
| OmniPrep (kit de extracción genómica total) | G Biosciences | 786-136 | |
| Placa de Petri (100 mm y veces; 15 mm) | Thermo Fisher Scientific | FB0875712 | |
| Cámara de recuento de Petroff-Hausser | Hausser scientific | HS-3900 | |
| Cámara de recuento de Petroff-Hausser cubreobjetos de vidrio | Hausser scientific | HS-5051 | |
| Polietilenglicol 8000 (PEG) | Thermo Fisher Scientific | BP233-1 | |
| Suero de conejo no estéril trazas jóvenes hemolizadas (NRS) | Pel-Freez Biologicals | 31119-3 | inactivo por calor según las instrucciones del fabricante |
| Cubetas semi-micro UV transparentes | USA Scientific | 9750-9150 | |
| Bicarbonato de sodio | Thermo Fisher Scientific | BP328-500 | |
| Cloruro de | sodioThermo Fisher Scientific | BP358-1 | |
| Piruvato de sodio | Millipore Sigma | P8674-25G | |
| Spectronic Genesys 5 | Thermo Fisher Scientific | ||
| Solución de sulfato de estreptomicina | Millipore Sigma | S6501-50G | |
| Citrato trisódico dihidratado | Millipore Sigma | S1804-500G | citrato de sodio para BSK |
Referencias
- Samuels, D. S., Drecktrah, D., Hall, L. S. Genetic transformation and complementation. Methods in Molecular Biology. 1690, 183-200 (2018).
- Winslow, C., Coburn, J. Recent discoveries and advancements in research on the Lyme disease spirochete Borrelia burgdorf....
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Reimpresiones y permisos
