Artículo de método

Cuantificación de la actividad antifúngica de péptidos contra Candida albicans

DOI:

10.3791/64416

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13 de enero de 2023

 ,  , 
1Department of Chemical and Biomolecular Engineering, University of Maryland

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un método para obtener datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica de péptidos y otros compuestos, como agentes antifúngicos de moléculas pequeñas, contra Candida albicans. Su uso de la densidad óptica en lugar de contar las unidades formadoras de colonias para cuantificar la inhibición del crecimiento ahorra tiempo y recursos.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los métodos tradicionales para realizar pruebas de susceptibilidad antifúngica para Candida albicans consumen mucho tiempo y carecen de resultados cuantitativos. Por ejemplo, un enfoque común se basa en placas de células tratadas con diferentes concentraciones de moléculas antifúngicas en placas de agar y luego contar las colonias para determinar la relación entre la concentración de moléculas y la inhibición del crecimiento. Este método requiere muchas placas y un tiempo sustancial para contar las colonias. Otro enfoque común elimina las placas y el conteo de colonias mediante la inspección visual de cultivos tratados con agentes antifúngicos para identificar la concentración mínima requerida para inhibir el crecimiento; sin embargo, la inspección visual produce sólo resultados cualitativos, y se pierde información sobre el crecimiento a concentraciones subinhibitorias. Este protocolo describe un método para medir la susceptibilidad de C. albicans a péptidos antifúngicos. Al basarse en mediciones de densidad óptica de cultivos, el método reduce el tiempo y los materiales necesarios para obtener resultados cuantitativos sobre el crecimiento del cultivo a diferentes concentraciones de péptidos. La incubación del hongo con péptidos se realiza en una placa de 96 pocillos utilizando un tampón apropiado, con controles que representan ninguna inhibición del crecimiento e inhibición completa del crecimiento. Después de la incubación con el péptido, las suspensiones celulares resultantes se diluyen para reducir la actividad peptídica y luego se cultivan durante la noche. Después del crecimiento nocturno, se mide la densidad óptica de cada pocillo y se compara con los controles positivos y negativos para calcular la inhibición del crecimiento resultante en cada concentración de péptidos. Los resultados utilizando este ensayo son comparables a los resultados utilizando el método tradicional de chapado de los cultivos en placas de agar, pero este protocolo reduce los residuos plásticos y el tiempo dedicado a contar colonias. Aunque las aplicaciones de este protocolo se han centrado en péptidos antifúngicos, el método también será aplicable para probar otras moléculas con actividad antifúngica conocida o sospechada.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Candida albicans es un miembro de la microbiota humana que coloniza numerosos lugares, incluyendo la cavidad oral, la piel, el tracto gastrointestinal y la vagina1. Para pacientes inmunocomprometidos debido a enfermedades como el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) y tratamientos inmunosupresores, la colonización de C. albicans puede conducir a candidiasis local o sistémica 2,3. El uso de terapias antifúngicas de moléculas pequeñas actualmente disponibles, como anfotericina B, azoles o equinocandinas, puede complicarse por problemas de solubilidad y toxicidad y por la resistencia de las infecciones a la terapéutica 4,5. Debido a las limitaciones de los agentes antifúngicos actuales, los investigadores están continuamente buscando nuevas moléculas antifúngicas con actividad contra C. albicans.

Los péptidos antimicrobianos (AMP) son una alternativa potencial a los actuales agentes antifúngicos de moléculas pequeñas 6,7,8 y se propone que son menos susceptibles al desarrollo de resistencia en comparación con los fármacos de moléculas pequeñas 9. Los AMP son un conjunto diverso de péptidos, pero a menudo son catiónicos, con un amplio espectro de actividad10,11,12. Los AMP con actividad contra C. albicans incluyen péptidos bien conocidos de las familias histatina y cecropina 13,14,15, junto con péptidos descritos más recientemente como ToAP2, NDBP-5.7 y la variante de histatina 5 K11R-K17R16,17. Debido a su potencial para tratar las infecciones por Candida, identificar y diseñar nuevos AMP que se dirijan a C. albicans es un objetivo importante para muchos grupos de investigación.

Como parte del proceso para desarrollar AMP efectivos (y otros agentes antifúngicos) que se dirigen a C. albicans, las pruebas in vitro se usan comúnmente para identificar péptidos prometedores. Los métodos para probar la actividad antifúngica contra C. albicans generalmente implican incubar células con diluciones seriadas de los AMP (en tampón o medio) en placas de 96 pocillos. Hay varios métodos disponibles para evaluar la actividad antifúngica después de la incubación. Una técnica descrita por el Clinical Laboratory Standards Institute utiliza una evaluación puramente visual de la turbidez de los pocillos para determinar la concentración mínima (CMI) para la inhibición completa del crecimiento (al menos 50% de inhibición para agentes antifúngicos seleccionados, como azoles y equinocandinas) y no proporciona cuantificación del crecimiento a concentraciones sub-CMI18 . Otro enfoque comúnmente utilizado consiste en cuantificar la viabilidad después de la incubación con AMP mediante el recubrimiento del contenido de los pocillos en placas de agar, la incubación de las placas y luego el recuento del número de unidades formadoras de colonias (UFC) en la placa. Este método se ha utilizado para evaluar una serie de péptidos, incluidos los péptidos basados en histatina 5, LL-37 y la lactoferrina humana 19,20,21. Esta técnica requiere un volumen relativamente grande de agar y un alto número de placas e implica el tedioso conteo de UFC en las placas. Para obtener más datos cuantitativos y generar menos residuos plásticos y evitar el conteo de UFC, el contenido de los pocillos se puede utilizar para inocular medio fresco en otra placa de 96 pocillos. Después de incubar la placa recién inoculada, el crecimiento se puede cuantificar midiendo la densidad óptica a 600 nm (OD600) en un lector de placas de absorbancia. Este método ha sido utilizado para determinar la actividad antifúngica de la histatina 5 y sus fragmentos de degradación y péptidos penetrantes celulares 17,22,23,24,25.

Este protocolo describe cómo probar la actividad antifúngica de péptidos y utiliza el método OD600 para cuantificar la reducción de la viabilidad de C. albicans debido a péptidos.

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Protocolo

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Se obtuvo la aprobación del Comité Institucional de Bioseguridad (IBC) de la Universidad de Maryland, College Park, para el trabajo con C. albicans en este protocolo (PN 274). En el presente estudio se utilizó la cepa SC5314 de C. albicans (ver Tabla de Materiales); sin embargo, también se puede utilizar cualquier otra cepa.

1. Preparación del tampón, agua estéril y medio de cultivo

  1. Preparar tampón estéril de fosfato sódico 0,1 M (NaPB)26 a pH 7,4, y diluir a 2 mM y 1 mM con agua estéril. La preparación de 100 mL de 2 mM NaPB y 1 mM NaPB será más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones de este protocolo.
  2. Prepare levadura-peptona-dextrosa líquida estéril (YPD, ver Tabla de materiales) mediana (10 g/L de extracto de levadura, 20 g/L de dextrosa, 20 g/L de peptona). La preparación de 100 ml de YPD será más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones de este protocolo.
  3. Prepare agua ultrapura estéril. Preparar 100 mL de agua será más que suficiente para la mayoría de las aplicaciones de este protocolo.
    NOTA: Los tampones, los medios y el agua se esterilizan en autoclave a 121 °C en un ciclo líquido durante un tiempo apropiado en función del volumen en los recipientes que se esterilizan en autoclave27. Por ejemplo, para botellas que contienen 500 ml, el tiempo de exposición debe ser de 40 minutos.

2. Inoculación, cultivo y subcultivo de C. albicans

PRECAUCIÓN: Siga todas las regulaciones institucionales y gubernamentales para trabajar con C. albicans, que a menudo es clasificado por las instituciones de investigación académica como un organismo de nivel de bioseguridad (BSL) 2 independientemente de la resistencia a los medicamentos y por la American Type Culture Collection (ATCC) como un organismo BSL1 o BSL2, dependiendo de la resistencia a los medicamentos de la cepa28.

NOTA: Realice las porciones de inoculación y cultivo de este paso (pasos 2.1-2.2) el día antes de comenzar la prueba de actividad antimicótica. Si es posible, realice todos los pasos del protocolo con las células (y las soluciones que se incubarán con las células) en un gabinete de bioseguridad.

  1. Inocular la cepa deseada de C. albicans en 10 ml de medio YPD en un tubo de cultivo.
    NOTA: El cultivo se puede inocular de un congelador o de una placa de agar, pero se debe utilizar una fuente consistente para todos los datos que se compararán.
  2. Cultivar el cultivo durante la noche (~12-16 h) a 30 °C y 230 rpm en una agitadora rotativa.
  3. Subcultivo del cultivo nocturno de C. albicans, y crecer a un OD600 de ~1.0-1.2.
    1. Mida el OD600 del cultivo durante la noche utilizando un espectrofotómetro UV (consulte la Tabla de materiales).
    2. Basado en el OD 600 del cultivo nocturno, use el cultivo nocturno para inocular un subcultivo en un OD600 de 0.1 en10 mL de YPD.
    3. Cultivar el cultivo a 30 °C en un agitador rotativo a 230 rpm hasta que el OD600 alcance ~1.0-1.2, lo que probablemente tomará 4-6 h. Complete el paso 3 (preparación de soluciones peptídicas) mientras el subcultivo está creciendo; El subcultivo se diluirá para su uso en el ensayo en el paso 4.

3. Preparación de las soluciones peptídicas en una placa de 96 pocillos

NOTA: Este paso se puede hacer antes de tiempo, si las soluciones madre de péptidos son estables durante el almacenamiento. Normalmente, las soluciones peptídicas se almacenan a -20 °C hasta su uso. Se pueden descongelar en un baño de agua a temperatura ambiente antes de continuar con el siguiente paso.

  1. Determine la concentración más alta de cada péptido que se probará en el ensayo. Esto variará en función de los péptidos seleccionados. Para los datos presentados en la sección de resultados representativos, se probaron la histatina 5 y los análogos de ingeniería22 , y la concentración más alta probada fue de 50 μM.
    NOTA: La concentración más alta a probar se determina utilizando los datos reportados en la literatura o realizando experimentos preliminares en un amplio rango de concentraciones de péptidos. Cuando sea posible, se debe seleccionar la concentración más alta para observar una meseta para una reducción completa de la viabilidad a las concentraciones más altas probadas y una meseta para ninguna reducción de la viabilidad a las concentraciones más bajas probadas, lo que permite la cuantificación de la gama completa de actividad peptídica.
  2. Disuelva cada péptido en agua estéril al doble de la concentración máxima deseada. Para los datos presentados en la sección de resultados representativos, se prepararon 150 μL de soluciones de 100 μM de histatina 5 y análogos diseñados en agua estéril.
    NOTA: Si un péptido no es soluble en agua, puede ser necesaria la solubilización en otro disolvente antes de este paso. El dimetilsulfóxido (DMSO) se usa comúnmente para solubilizar péptidos a una alta concentración antes de diluir a la concentración de trabajo. Asegúrese de que la concentración final del DMSO sea del 1% (v/v) o inferiora 29 y que los disolventes alternativos no afecten al crecimiento de las células. Además, asegúrese de que la concentración de disolvente se mantenga constante en todos los pocillos en los pasos 3.4-3.5.
  3. Añadir 40 μL de las soluciones madre peptídicas deseadas al primer pocillo (Columna 1) de cada fila en una placa de cultivo de fondo redondo de 96 pocillos (ver Tabla de materiales). Esta placa es la lámina 1 (Figura 1).
    NOTA: Cada placa tiene ocho filas que se utilizan para probar péptidos. Estas filas se pueden utilizar para diferentes péptidos o para réplicas de los mismos péptidos. Incluya un solo péptido en cada fila.
  4. Añadir 20 μL de agua ultrapura estéril a la columna 2 a la columna 12 de las filas que contienen péptido (figura 1).
    NOTA: Si las cepas de péptidos se prepararon con un disolvente distinto del agua pura en la etapa 3.2, el agua estéril en esta etapa debe reemplazarse con el disolvente presente en la cepa peptídica añadida a la primera columna. Por ejemplo, si el péptido se solubilizó en DMSO y el stock de péptidos contiene 1% (v/v) de DMSO en agua, el agua que contiene 1% de DMSO debe agregarse a la columna 2 a la columna 12.
  5. Diluir en serie las soluciones madre de péptidos a través de la placa a la columna 10 (Figura 1).
    NOTA: En lugar de realizar las diluciones seriadas en la placa como se describe a continuación, las diluciones también podrían realizarse en tubos de microcentrífuga y transferirse a la placa de 96 pocillos.
    1. Retire 20 μL de la columna 1, transfiéralo a la columna 2 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo. La columna 2 contiene ahora 40 μL de solución peptídica con una dilución 1:2 de la concentración en la columna 1.
    2. Retire 20 μL de la columna 2, transfiéralo a la columna 3 y mezcle pipeteando hacia arriba y hacia abajo, de modo que la columna 3 ahora contenga 40 μL de solución peptídica en una dilución 1:4 de la concentración en la columna 1.
    3. Repita este proceso hasta que la columna 10 contenga 40 μL de solución peptídica en una dilución 1:512 de la concentración en la columna 1.
    4. Retire 20 μL de solución peptídica de la columna 10 y deséchela. Cada columna ahora contiene 20 μL de solución peptídica (Columnas 1-10) o agua (Columna 11 y Columna 12).
      NOTA: Los pocillos de la Columna 11 sirven como controles de esterilidad, y los pocillos de la Columna 12 sirven como controles que no contienen péptidos.

4. Dilución del subcultivo de C. albicans

NOTA: Comience este paso después de que la subreferencia haya alcanzado un OD600 de ~1.0-1.2 (paso 2.3.3).

  1. Transfiera el subcultivo a un tubo de centrífuga de 15 ml y centrifugar a 3.900 x g durante 3 minutos a temperatura ambiente para granular las células. Retirar el sobrenadante mediante pipeteo o decantación.
  2. Vuelva a suspender el pellet con 1 ml de NaPB de 2 mM (paso 1.1) y transfiera la suspensión a un tubo de centrífuga de 1,7 ml.
  3. Granular las células (como en el paso 4.1), desechar el sobrenadante y volver a suspender el pellet en 1 ml de 2 mM de NaPB.
  4. Repita el paso 4.3 dos veces adicionales para dejar las células lavadas en 1 ml de NaPB de 2 mM.
  5. Determinar la densidad celular de la suspensión lavada y calcular el factor de dilución necesario para obtener una densidad celular de 5 x 105 células/ml. Esta concentración finalmente conducirá a agregar 1 x 104 células a cada pocillo de la placa de 96 pocillos.
    NOTA: La densidad celular de la suspensión se puede determinar utilizando varios métodos, incluido un hemocitómetro o un contador celular automatizado. Para el presente estudio se utilizó una curva estándar de densidad celular versus OD600 para la cepa de interés cultivada en condiciones relevantes. Esta curva se preparó utilizando un hemocitómetro (ver Tabla de materiales) para determinar la densidad celular de suspensiones con valores variables de OD600 .
  6. Diluir la suspensión celular a 5 x 105 células/ml en 2 mM NaPB. La preparación de 10 ml de esta suspensión diluida será más que suficiente para completar este estudio.

5. Incubación de C. albicans con soluciones peptídicas y preparación de las células para la cuantificación de viabilidad

  1. Añadir 20 μL de la suspensión diluida de C. albicans (paso 4.6 ) a las columnas 1-10 y 12 de cada fila (figura 1).
    NOTA: La concentración final de péptidos en la primera columna es ahora la mitad de la concentración de péptidos. Para el presente estudio, la concentración peptídica final fue de 50 μM en este punto. La suspensión celular final en cada pocillo contiene 2.5 x 105 células/mL. Las columnas 1-10 sirven como pozos experimentales para evaluar la actividad antifúngica a diferentes concentraciones de péptidos, y la columna 12 sirve como control para el crecimiento sin péptido.
  2. Añadir 20 μL de NaPB de 2 mM a la columna 11. Todos los pozos ahora tienen una concentración final de 1 mM de NaPB. La columna 11 sirve como control de esterilidad.
  3. Cubrir la placa 1 (que contiene tanto células como péptidos) e incubarla a 30 °C durante 30 min.
    NOTA: Un tiempo de incubación de 30 min es suficiente para muchos péptidos 17,21,22,30, pero el tiempo de incubación puede aumentarse a 60 min si se desea tener en cuenta péptidos que pueden requerir un tiempo más largo para ejercer su actividad antifúngica 25,31,32.
  4. Preparar una nueva placa de cultivo de 96 pocillos (Placa 2) para utilizarla en la cuantificación de la viabilidad (Figura 2).
    NOTA: La placa de cultivo debe prepararse durante la incubación de la placa 1.
    1. Añadir 100 μL de YPD (paso 1.2) a todos los pocillos de la placa.
    2. Añadir 100 μL de NaPB de 2 mM (Paso 1.1) a todos los pocillos de la placa.
  5. Diluir las muestras en la placa 1 (que contiene células y péptidos) y transferir a la placa 2 (que contiene medio y tampón).
    1. Recupere la placa 1 de la incubadora después de los 30 minutos de incubación.
    2. Diluir cada pocillo de la placa 1 añadiendo 280 μL de 1 mM de NaPB (paso 1.1) para obtener un volumen total de 320 μL en cada pocillo (Figura 2).
    3. Mezcle todos los pocillos que contienen células y péptidos pipeteando hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que todas las células se resuspendan y que no haya células sedimentadas visibles en el fondo de los pocillos.
    4. Transfiera 8 μL de cada pocillo de la placa 1 al pocillo correspondiente de la placa 2. Este volumen transfiere aproximadamente 250 celdas de cada pocillo de la Placa 1 a la Placa 2 (Figura 2).
  6. Cubrir la placa 2 e incubar en un agitador de placas de microtitulación (ver Tabla de materiales) a 350 rpm durante 17 h a 30 °C.

figure-protocol-1
Figura 1: Preparación de la placa 1 para la incubación de diluciones seriadas peptídicas con células. Las diluciones seriadas del péptido se hacen en agua, y las células de C. albicans se agregan a la placa 1. Un color azul indica que el péptido está presente en el pozo, y el gris indica un pozo con agua y sin péptido. Los pocillos que contienen celdas se indican con un patrón de puntos negros. Después de estos pasos, la placa se incuba para permitir que el péptido ejerza su actividad antifúngica. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

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Figura 2: Preparación de la placa 2 para cuantificar la reducción de la viabilidad debida al péptido. YPD medio y NaPB se añaden a la placa 2. Después de diluir el contenido de la placa 1, se transfiere una alícuota de cada pocillo de la placa 1 a la placa 2. La placa 2 se incuba para permitir que las células viables crezcan para la cuantificación midiendo el OD600. Para la placa 2, los pocillos que contienen solo YPD y NaPB se muestran en naranja. Los pocillos que contienen alícuotas de la placa 1 mezcladas con el YPD y el NaPB se muestran en verde. Consulte la leyenda de la Figura 1 para obtener la descripción de los colores de la lámina 1. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

6. Determinación de la actividad antifúngica

  1. Obtenga600 lecturas de OD para cada pocillo en la Lámina 2.
    1. Retire la placa 2 de la incubadora después de 17 h de incubación.
    2. Mezcle todos los pocillos en la placa 2 pipeteando hacia arriba y hacia abajo para asegurarse de que todas las celdas estén resuspendidas y que no haya celdas sedimentadas visibles en el fondo de los pocillos.
      NOTA: Evite generar burbujas durante este paso, ya que pueden interferir con las lecturas de OD600 . Si se forman burbujas, a menudo se pueden reventar con una punta de pipeta seca o eliminarse usando dos puntas de pipeta para sacarlas del pozo.
    3. Utilice un lector de placas de absorbancia (consulte la Tabla de materiales) a una longitud de onda de 600 nm para obtener el OD600 para cada pocillo.
  2. Calcule la inhibición del crecimiento (como porcentaje) y tráquela para determinar el efecto de los péptidos en el crecimiento de C. albicans.
    1. Para cada pozo, calcule la reducción de la viabilidad en comparación con el control (como porcentaje) utilizando la siguiente ecuación 17,22,23:
      figure-protocol-3
      donde la DO con péptido es la DO 600 de un pocillo que contiene una concentración dada de péptido, el fondo de DO es la DO 600 de la columna 11 en la misma fila (control que no contiene células), y
      OD sin péptido es el OD600 de la columna 12 en la misma fila (control que contiene células y no péptido).
    2. Por ejemplo, utilice la siguiente expresión para calcular la reducción de la viabilidad en el pozo B5 a partir de los valores de OD600 para la fila B:
      figure-protocol-4
  3. Trazar la reducción de la viabilidad en función de la concentración de péptidos.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El uso de mediciones de OD600 para cuantificar la reducción en el crecimiento debido a péptidos antifúngicos ahorra un tiempo sustancial en comparación con el recubrimiento de muestras y el recuento de UFC. El método descrito en este protocolo requiere completar los pasos en tres días diferentes. El primer día, se necesita aproximadamente 1 h para preparar los tampones y medios (sin incluir el tiempo de esterilización) e inocular el cultivo inicial de C. albicans para la incubación nocturna. En el seg...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este protocolo describe un enfoque eficiente para obtener datos cuantitativos sobre la actividad antifúngica de los AMP contra el patógeno fúngico C. albicans. Un enfoque alternativo común para probar péptidos y otros agentes antifúngicos es la microdilución en caldo descrita en el estándar M2718 del Instituto de Estándares de Laboratorio Clínico (CLSI), pero este estándar se centra en obtener resultados visuales cualitativos en lugar de resultados cuantitativos. Otro enfoque alternativo ...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo fue apoyado por los Institutos Nacionales de Salud (R03DE029270, T32AI089621B), la Fundación Nacional de Ciencias (CBET 1511718), el Departamento de Educación (GAANN-P200A180093) y una subvención semilla entre campus de la Universidad de Maryland.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Placas de 96 pocillos (fondo redondo)VWR10062-902
Lector de microplacas de absorbanciaN/AN/ACualquier lector de microplacas disponible es suficiente
C. albicans strain SC5314ATCC MYA-2876También se pueden utilizar otros C. albicans
HemocitómetroN/AN/ASe puede utilizar para hacer una curva estándar que relacione el número de células con el diámetro exterior600
Microplaca agitadorVWR2620-926
Péptido(s)N/AN/ALos péptidos pueden ser sintetizados comercialmente por cualquier proveedor confiable; una pureza de ≥ Se recomienda un 95% y la eliminación de sal de ácido trifluoroacético a sal de clorhidrato
Depósitos de reactivos para pipetas multicanalVWR18900-320Simplifica el pipeteo en placas de pocillos múltiples con pipeta multicanal
Fosfato de sodio, dibásicoFisher ScientificBP332-500Para la fabricación de NaPB
Fosfato de sodio, monobásicoFisher ScientificBP329-500Para la fabricación de NaPB
Espectrofotómetro UVN/AN/ACualquier espectrofotómetro UV disponible es suficiente
YPD medio polvoBD Life Sciences242820También puede estar hecho de extracto de levadura, peptona y dextrosa

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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