El cultivo in vitro es un método de detección directa de la presencia de bacterias vivas. Este protocolo describe métodos para el cultivo de diversas espiroquetas de Borrelia, incluidas las del complejo Borrelia burgdorferi sensu lato, las especies de fiebre recidivante de Borrelia y Borrelia miyamotoi. Estas especies son fastidiosas y de crecimiento lento, pero pueden ser cultivadas.
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Artículo de método
Métodos de cultivo de espiroquetas de Borrelia burgdorferi Sensu Lato Complex y fiebre recidivante Borrelia
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Resumen
Resumen
La Borrelia consiste en tres grupos de especies, las del grupo de la borreliosis de Lyme (LB), también conocido como B. burgdorferi sensu lato (s.l.) y recientemente reclasificado en Borreliella, el grupo de la fiebre recurrente (RF) Borrelia, y un tercer grupo de espiroquetas asociado a reptiles. Los métodos basados en el cultivo siguen siendo el estándar de oro para la detección de infecciones bacterianas en el laboratorio tanto para la investigación como para el trabajo clínico, ya que el cultivo de patógenos a partir de fluidos corporales o tejidos detecta directamente patógenos replicantes y proporciona material de origen para la investigación. Las espiroquetas de Borrelia y Borreliella son fastidiosas y de crecimiento lento, y por lo tanto no se cultivan comúnmente con fines clínicos; Sin embargo, la cultura es necesaria para la investigación. Este protocolo demuestra la metodología y las recetas necesarias para cultivar con éxito espiroquetas LB y RF, incluidas todas las especies reconocidas del complejo B. burgdorferi s.l., incluidas B. afzelii, B. americana, B. andersonii, B. bavariensis, B. bissettii/bissettiae, B. burgdorferi sensu stricto (s.s.), B. californiensis, B. carolinensis, B. chilensis, B. finlandensis, B. garinii, B. japonica, B. kurtenbachii, B. lanei, B. lusitaniae, B. maritima, B. mayonii, B. spielmanii, B. tanukii, B. turdi, B. sinica, B. valaisiana, B. yangtzensis yespiroquetas RF, B. anserina, B. coriaceae, B. crocidurae, B. duttonii, B. hermsii, B. hispanica, B. persica, B. recurrentis y B. miyamotoi. El medio básico para cultivar espiroquetas LB y RF es el medio Barbour-Stoenner-Kelly (BSK-II o BSK-H), que apoya de manera confiable el crecimiento de espiroquetas en cultivos establecidos. Para poder cultivar aislados de Borrelia recién aislados a partir de muestras derivadas de garrapatas o huéspedes donde el número inicial de espiroquetas es bajo en el inóculo, se prefiere el medio Kelly-Pettenkofer (MKP) modificado. Este medio también apoya el crecimiento de B. miyamotoi. El éxito del cultivo de espiroquetas de RF también depende críticamente de la calidad de los ingredientes.
Introducción
Borrelia es un género de bacterias espiroquetas que abarca tres clados principales: el grupo de la borreliosis de Lyme (LB), el grupo de la fiebre recurrente (RF) y un grupo menos caracterizado aparentemente restringido a los reptiles. La taxonomía de Borrelia está en constante cambio con el advenimiento de metodologías moleculares que permiten comparaciones de genomas y proteomas, como ocurre con la mayoría de los otros grupos taxonómicos 1,2,3,4,5,6,7.<....
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Protocolo
Todos los estudios con muestras obtenidas de sujetos humanos fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional de la Universidad y/o centro médico correspondiente, y se obtuvo el consentimiento informado por escrito de los participantes antes de que se recolectaran las muestras. Todos los estudios con muestras obtenidas de animales fueron aprobados y realizados bajo los lineamientos del Comité Institucional de Ética Animal. En su caso, se han obtenido aprobaciones para el muestreo ambiental.
NOTA: El éxito de la cultura depende críticamente de la calidad de los ingredientes. El medio BSK comercial está disponible y apoya robustamente ....
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Resultados
Los medios de cultivo de Borrelia BSK y MKP, y sus variantes, son medios de cultivo ricos con ingredientes que deben prepararse y esterilizarse secuencialmente. Cuando se prepara correctamente, el medio BSK debe ser rojo-naranja y transparente (Figura 1). La turbidez y la precipitación que persisten después del calentamiento indican ingredientes problemáticos, producción media o contaminación; Tal medio es mejor descartarlo. Si se añade gelatina a BSK y con MKP, el medio será gelati.......
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Discusión
El cultivo de bacterias en laboratorio es el trampolín para la investigación. La profunda ventaja conferida por la capacidad de cultivar se ejemplifica en la lucha, durante más de un siglo que culminó recientemente en éxito, para cultivar Treponema pallidum, la espiroqueta que es el agente etiológico de la sífilis44. Las espiroquetas de Borrelia también son difíciles de cultivar, pero la cultura es posible 23,24,34,44,45,46,47,48,49.
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Divulgaciones
No se declararon conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo fue parcialmente apoyado por el Consejo de Investigación de Ciencias Naturales e Ingeniería de Canadá y la Fundación Canadiense de la Enfermedad de Lyme (AB y VL), el Consejo Sueco de Investigación (SB, M-LF e IN), el proyecto TAČR GAMA 2 - "Apoyo a la verificación del potencial de aplicación 2.0 en el Centro de Biología CAS" (TP01010022) (MG y NR), y por una subvención del Ministerio de Salud de la República Checa NV19-05-00191 (MG y NR). Agradecemos a S. Vranjes (2021, Rudenko lab) por la imagen de la Figura 4 y a J. Thomas-Ebbett (2021, Lloyd lab) por las imágenes de la Figura 5. Agradecemos a todos los investigadores que han contribuido al campo y ped....
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de 1,7 ml VWR | 87003-294 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará | |
| 0,2 y micro; m Filtro de jeringa estéril | VWR | 28145-501 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 10 µ Punta de pipeta de barrera L | Neptune | BT10XLS3 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| pipetas serológicas de 10 mL | Celltreat | 229011B | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 1000 µ Punta de pipeta de barrera L | Neptune | BT1000.96 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| un tubo de 15 ml | Celltreat | 188261 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 20 y micro; Punta de pipeta de barrera L | Neptune | BT20 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 20 mL Jeringa estéril | BD | 309661 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 200 y micro; Punta de pipeta de barrera L | Neptune | BT200 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 25 mL Tubos de cultivo con tapón de rosca | Fisher Scientific | 14-933C | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 25 mL Pipetas serológicas | Celltreat | 229025B | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| mL Jeringa estéril | BD | 309657 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| 35% BSA | Sigma | A-7409 | La fuente es importante - ver nota |
| 5 mL Pipetas serológicas | Celltreat | 229006B | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| un tubo de 50 ml | Celltreat | 229421 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| tubos de vidrio MKP de 6,5 ml | Schott | Schott Nr. 26 135 115 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Amikacine | Sigma | PHR1654 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Anfotericina B | Sigma | A9528-100MG | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Bactrim / rimetoprima / sulfametoxazol | Sigma | PHR1126-1G | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| caldo BBL Brucella | BD | 211088 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| Gabinete de bioseguridad | Labconco | 302419100 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| Tubos de extracción de sangre (parte superior amarilla - ACD) | Fisher Scientific | BD Tubos de recolección de sangre de vidrio Vacutainer con citrato ácido dextrosa (ACD) | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| BSK-H Medio [w 6% Suero de conejo] | Productos biológicos de Darlynn | BB83-500 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| centrífuga | Eppendorf | modelo 5430 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| Ácido cítrico TrisodioSalDihidrato | Sigma | C-8532 100 g | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| CMRL | Gibco BRL | 21540 500 mL | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| CMRL-1066 | Gibco | 21-510-018 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| Tubos criogénicos (Nalgene) | Fisher Scientific | 5000-0020 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Petri profunda con anillo de apilamiento de 100 mm y veces; 25 mm | Sigma | P7741 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Incubadora digital | VWR | modelo 1545 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| DMSO | ThermoFisher | D12345 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Filtros para la esterilización de | filtrosMillipore 0.22μ m GPExpressPLUS Membrana | SCGPU05RE | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Gelatina | Difco BD | 214340 500 g | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Tubos de cultivo de vidrio | Fisher Scientific | 99449-20 | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Glucosa | Sigma | G-7021 1 kg | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Glycerol | Sigma | G5516 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Hemafuge (Hematocrit & Centrífuga de inmunohematología ) | Labwissen | Modelo 3220 | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| HEPES | Sigma | H-3784 100 g | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| N-acetilglucoseamina | Sigma | A-3286 25 g | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Neopeptone | Difco BD | 211681 500 g | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Hematocitómetro Neubauer | Sigma | Z359629 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará: |
| Microscopio de contraste de fase | Leitz | Artículo estándar - cualquier proveedor hará | |
| Fosfomicina | Sigma | P5396-1G | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Fosfomicina | Sigma | P5396 | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Pipetboy | Integra | Artículo estándar - cualquier proveedor hará | |
| Balanza estándar de precisión | OHAUS | modelo TS200S | Artículo estándar - cualquier el proveedor hará |
| ácido pirúvico (sal de Na) | Sigma | P-8574 25 g | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Suero de conejo | Gibco | 16-120-032 | La fuente es importante |
| Suero de conejo | Sigma | R-4505 La fuente de 100 mL | es importante |
| Rifampicina | Sigma | R3501-1G | Artículo estándar - cualquier proveedor hará |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S-5761 500 g | Artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| Sufametaxazol | Sigma | PHR1126 | artículo estándar: cualquier proveedor hará |
| TC Yeastolate | Difco BD | 255752 100 g | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
| Pipetas de transferencia | VWR | 470225-044 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará. |
| Trimethoprim | Sigma PHR1056 | Artículo estándar: cualquier proveedor lo hará |
Referencias
- Aberer, E., Duray, P. H. Morphology of Borrelia burgdorferi: Structural patterns of cultured borreliae in relation to staining methods. Journal of Clinical Microbiology. 29 (4), 764-772 (1991).
- Estrada-Peña, A., Cabezas-Cruz, A.
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Reimpresiones y permisos
