Este protocolo describe metodologías para establecer organoides epiteliales endometriales de ratón para la expresión génica y análisis histológicos.
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Artículo de método
Establecimiento de organoides endometriales 3D a partir del útero del ratón
En este artículo
Resumen
Resumen
El tejido endometrial recubre la cavidad interna del útero y está bajo el control cíclico del estrógeno y la progesterona. Es un tejido que se compone de epitelio luminal y glandular, un compartimento estromal, una red vascular y una población compleja de células inmunes. Los modelos de ratón han sido una herramienta poderosa para estudiar el endometrio, revelando mecanismos críticos que controlan la implantación, la placentación y el cáncer. El reciente desarrollo de cultivos de organoides endometriales 3D presenta un modelo de vanguardia para diseccionar las vías de señalización que subyacen a la biología endometrial. Establecer organoides endometriales a partir de modelos de ratón genéticamente modificados, analizar sus transcriptomas y visualizar su morfología a una resolución de una sola célula son herramientas cruciales para el estudio de las enfermedades endometriales. Este documento describe métodos para establecer cultivos 3D de epitelio endometrial de ratones y describe técnicas para cuantificar la expresión génica y analizar la histología de los organoides. El objetivo es proporcionar un recurso que pueda usarse para establecer, cultivar y estudiar la expresión génica y las características morfológicas de los organoides epiteliales endometriales.
Introducción
El endometrio, el tejido mucoso del revestimiento interno de la cavidad uterina, es un tejido único y altamente dinámico que desempeña un papel crítico en la salud reproductiva de una mujer. Durante la vida reproductiva, el endometrio tiene el potencial de someterse a cientos de ciclos de proliferación, diferenciación y descomposición, coordinados por la acción concertada de las hormonas ováricas: estrógeno y progesterona. Los estudios de ratones genéticamente modificados han descubierto mecanismos biológicos básicos que sustentan la respuesta endometrial a las hormonas y el control de la implantación embrionaria, la decidualización de las células estromales y el emba....
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Protocolo
El manejo de ratones y los estudios experimentales se realizaron bajo protocolos aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC) de Baylor College of Medicine y las pautas establecidas por la Guía de los NIH para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio.
1. Aislamiento del epitelio uterino de ratones utilizando métodos enzimáticos y mecánicos
NOTA: Esta sección describe los pasos necesarios para establecer, pasar, congelar y descongelar organoides endometriales epiteliales de ratones utilizando un andamio de matriz de gel. Estudios previos han determinado que los culti....
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Resultados
Imágenes de contraste de fase de organoides endometriales de ratón
Establecimos organoides a partir de epitelio endometrial de ratón WT, como se describe en el protocolo adjunto (ver diagrama en la Figura 1). Después de la disociación enzimática del epitelio endometrial del ratón, las láminas epiteliales se separaron mecánicamente de las células del estroma uterino y se disociaron aún más con colagenasa para generar una suspensión unicelular. Si se realiza correctamente, .......
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Discusión
Aquí, describimos los métodos para generar organoides epiteliales endometriales a partir del endometrio del ratón y los protocolos utilizados rutinariamente para su análisis posterior. Los organoides endometriales son una herramienta poderosa para estudiar los mecanismos que controlan las enfermedades relacionadas con el endometrio, como la endometriosis, el cáncer de endometrio y el fracaso de la implantación. Estudios históricos publicados en 2017 reportaron las condiciones para cultivar cultivos a largo plazo y renova.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.
Agradecimientos
Agradecemos a la Dra. Stephanie Pangas y al Dr. Martin M. Matzuk (M.M.M.) por la lectura crítica y edición de nuestro manuscrito. Los estudios fueron apoyados por las subvenciones del Instituto Nacional de Salud Infantil y Desarrollo Humano Eunice Kennedy Shriver R00-HD096057 (D.M.), R01-HD105800 (D.M.), R01-HD032067 (M.M.M.) y R01-HD110038 (M.M.M.), y por la Subvención de Apoyo al Centro Oncológico NCI-P30 (NCI-CA125123). Diana Monsivais, Ph.D. tiene un Premio al Embarazo de la Próxima Generación del Burroughs Wellcome Fund.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Organoide Formulación de medios | |||
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Concentración final |
| Corning Matrigel Factor de crecimiento Matriz de membrana basal reducida (GFR), *sin LDEV | Corning | 354230 | 100% |
| Tripsina de páncreas bovino | Sigma Aldrich | T1426-1G | 1% |
| Advanced DMEM/F12 | Life Technologies | 12634010 | 1X |
| N2 suplemento | Life Technologies | 17502048 | 1X |
| B-27™ Suplemento (50X), menos vitamina A | Life Technologies | 12587010 | 1X |
| Primocin | Invivogen | ant-pm-1 | 100 µ g/mL |
| N-acetil-L-cisteína | Sigma Aldrich | A9165-5G | 1.25 mM |
| L-glutamina | Life Technologies | 25030024 | 2 mM |
| Nicotinamida | Sigma Aldrich | N0636-100G | 10 nM |
| Inhibidor de ALK-4, -5, -7, A83-01 | Tocris | 2939 | 500 nM |
| EGF humano recombinante | Peprotech | AF-100-15 | 50 ng/mL |
| Recombinante humano Noggin | Peprotech | 120-10C | 100 ng/mL |
| Recombinante humano Rspondin-1 | Peprotech | 120-38 | 500 ng/mL |
| Recombinante humano FGF-10 | Peprotech | 100-26 | 100 ng/mL |
| HGF humano recombinante | Peprotech | 100-39 | 50 ng/mL |
| WNT3a | R& D systems | 5036-WN | 200 ng/mL |
| Otros suministros y reactivos | |||
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Concentración final |
| Colagenasa de Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C0130-1G | 5 mg/ mL |
| Desoxirribonucleasa I del páncreas bovino | Sigma Aldrich | DN25-100MG | 2 mg/mL |
| DPBS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher | 14190-250 | 1X |
| HBSS, sin calcio, sin magnesio | ThermoFisher | 14170112 | 1X |
| Falcon Microplacas de poliestireno (24 pocillos) | Fisher Scientific | #08-772-51 | |
| Falcon Microplacas de poliestireno (12 pocillos) | Fisher Scientific | #0877229 | |
| Coladores de células Falcon, 40 µ m | Fisher Scientific | #08-771-1 | |
| MiniPrep de ARN de zol directo (50 y micro; g) | Genesee Scientific | 11-331 | |
| Trizol reactivo | Invitrogen | 15596026 | |
| DMEM/F-12, HEPES, rojo sin fenol | ThermoFisher | 11039021 | |
| Suero bovino fetal, Carbón tirado | Sigma Aldrich | F6765-500ML | 2% |
| Estratiol (E2) | Sigma Aldrich | E1024-1G | 10 nM |
| Formaldehído 16% en acuoso solución, grado EM VWR | 15710 | 4% | |
| Epredia Cassette 1 cassettes de tejido ranurado | Fisher Scientific | 1000961 | |
| Epredia Moldes de base de inclusión de acero inoxidable | Fisher Scientific | 64-010-15 | |
| Etanol, 200 grados (100%) | Fisher Scientific | 22-032-601 | |
| Histoclear | Fisher Scientific | 50-899-90147 | |
| Medio de montaje Permount | Fisher Scientific | 50-277-97 | |
| Epredia Bolsas de biopsia de nailon | Fisher Scientific | 6774010 | |
| HistoGel Gel de procesamiento de muestras | VWR | 83009-992 | |
| Solución de hematoxilina Premium | VWR | 95057-844 | |
| Solución de eosina Y (amarillenta) Premium | VWR | 95057-848 | |
| TBS Tampón, 20X, pH 7,4 | GenDEPORT | T8054 | 1X |
| TBST (10X), pH 7,4 | GenDEPORT | T8056 | 1X |
| Ácido cítrico | Sigma Aldrich | C0759-1KG | |
| Citrato de sodio tribásico dihidratado | Sigma Aldrich | S4641-500G | |
| Tween20 | Fisher Scientific | BP337-500 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma Aldrich | A2153-100G | 3% |
| DAPI Solución (1 mg/mL) | ThermoFisher | 62248 | dilución 1:1000 |
| VECTASHIELD Antidecoloración Medio de montaje | Vector Labs | H-1000-10 | |
| Esmalte de uñas transparente | Fisher Scientific | NC1849418 | |
| Fisherbrand Superfrost Plus Portaobjetos de microscopio | Fisher Scientific | 22037246 | |
| Micro Cubreobjetos | VWR VWR | 48393-106 | |
| SuperScript VILO Master Mix | ThermoFisher | 11755050 | |
| SYBR Green PCR Master Mix | ThermoFisher | 4364346 | |
| Krt8 Antibody (TROMA-I) | DSHB | TROMA-I | Dilución 1:50 |
| Vimentina Antobody | Cell Signaling | 5741S | Dilución 1:200 |
| Anticuerpo anti-rata IgG (H+L) anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 594 | ThermoFisher | A-21209 | dilución 1:250 |
| Anticuerpo anti de burro anti-Rabbin anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor 488 | ThermoFisher | A-21206 | Dilución 1:250 |
| ZEISS Stemi 508 Stereo Microscopio | ZEISS | ||
| ZEISS Axio Vert.A1 Microscopio de rutina invertido con cámara digital | ZEISS | ||
| strong>Primer Sequence | >Forward (5'-3') | Reverse (5'-3') | _ |
| Lipocalin 2 (Lcn2) | GCAGGTGGTACGTTGTGGG | CTCTTGTAGCTCATAGATGGTGC | |
| Lactoferrina (Ltf) | TGAGGCCCTTGGACTCTGT | ACCCACTTTTCTCATCTCTCTTC | |
| Progesterona (Pgr) | CCCACAGGAGTTTGTCAAGCTC | TAACTTCAGACATCATCATTTCCGG | |
| Gliceraldehído 3 fosfato deshidrogenasa (Gapdh) | CAATGTGTCCGTCGTGGATCT | GCCTGCTTCACCACCTTCTT |
Referencias
- Wang, H., Dey, S. K. Roadmap to embryo implantation: clues from mouse models. Nature Reviews Genetics. 7 (3), 185-199 (2006).
- Hibaoui, Y., Feki, A. Organoid models of human endometrial development and disease. Frontiers in Cell and Developmental Biol....
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Reimpresiones y permisos
