Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

Resumen

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Resumen

La aneuploidía es la principal anomalía genética que causa aborto espontáneo temprano y fracaso del embarazo en humanos. La mayoría de los errores en la segregación cromosómica que dan lugar a la aneuploidía ocurren durante la meiosis en los ovocitos, pero aún no se comprende completamente por qué la meiosis de los ovocitos es propensa a errores. Durante la división celular, las células evitan errores en la segregación cromosómica activando el punto de control de ensamblaje del huso (SAC). Este mecanismo de control se basa en la detección de accesorios cinetocoro (KT)-microtúbulos (MT) y en la detección de la tensión generada por las fibras del huso. Cuando los KT no están conectados, el SAC se activa y evita la progresión del ciclo celular. El SAC es activado primero por la quinasa MPS1, que desencadena el reclutamiento y la formación del complejo de punto de control mitótico (MCC), compuesto por MAD1, MAD2, BUB3 y BUBR1. Luego, el CCM se difunde en el citoplasma y secuestra CDC20, un activador del complejo/ciclosoma promotor de anafase (APC/C). Una vez que los KT se unen a los microtúbulos y los cromosomas se alinean en la placa de metafase, el SAC se silencia, se libera CDC20 y se activa el APC / C, lo que desencadena la degradación de la ciclina B y la securina, lo que permite el inicio de la anafase. En comparación con las células somáticas, el SAC en los ovocitos no es tan efectivo porque las células pueden sufrir anafase a pesar de tener KT no unidos. Comprender por qué el SAC es más permisivo y si esta permisividad es una de las causas de los errores de segregación cromosómica en los ovocitos aún necesita más investigación. El presente protocolo describe las tres técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en ovocitos de ratón. Estas técnicas incluyen el uso de nocodazol para despolimerizar MT para evaluar la respuesta SAC, rastrear el silenciamiento de SAC siguiendo la cinética de destrucción de Securin y evaluar el reclutamiento de MAD2 a KTs por inmunofluorescencia. Juntas, estas técnicas investigan los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos al proporcionar una evaluación completa de la integridad de SAC.

Introducción

La aneuploidía, que surge de errores en la segregación cromosómica, es la principal causa de abortos espontáneos tempranos y está altamente relacionada con errores en la meiosis¹. La meiosis es distinta de la mitosis porque consiste en dos rondas de división celular sin un paso intermedio de replicación del ADN. En la meiosis I, los cromosomas homólogos se separan mientras que las cromátidas hermanas permanecen juntas. En los ovocitos, este paso es propenso a errores, lo que lleva a la producción de huevos aneuploides².

Para evitar errores de segregación cromosómica, la mayoría de los tipos de....

Protocolo

Todos los ratones utilizados en estos protocolos fueron alojados y criados de acuerdo con el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Rutgers (Protocolo 201702497) y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Estos organismos reguladores aprobaron todos los procedimientos experimentales que involucran estudios en animales. Todos los ratones utilizados en el presente estudio eran hembras CF-1 de 6-8 semanas de edad.

1. Preparación experimental

1. Antes de iniciar las evaluaciones del SAC, recolectar ovocitos de ratón siguiendo el informe previamente publicado¹²

Resultados

Evaluación de la capacidad de respuesta de la SAC mediante el tratamiento con nocodazol
El propósito de este experimento es evaluar la activación y fuerza de SAC. Al usar nocodazol para despolimerizar los microtúbulos del huso, todos los cinetocoros se desunirán, lo que causará una detención del ciclo celular mediada por SAC. En el sistema de imagen actual, los ovocitos de control tratados con DMSO extruyeron un cuerpo polar alrededor de 14 h después de la liberación de milrinona (

Discusión

El punto de control de ensamblaje del husillo es un mecanismo de control crítico durante la división celular diseñado para evitar errores de segregación cromosómica. Permite que la célula tenga tiempo suficiente para corregir los accesorios KT-MT incorrectos. La meiosis en ovocitos es un proceso propenso a errores, donde la mayor parte de la mala segregación cromosómica ocurre durante la meiosis I, lo que lleva a la generación de óvulos aneuploides que son la principal causa de abortos espontáneos tempranos e infertilida.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Albúmina sérica bovina (BSA)	Sigma	A4503
DAPI	Life Technologies	D1306
Dimetil-sulfóxido (DMSO)	Sigma	D5879
Burro-anti-conejo-Alexa-568	Life Technologies	A10042
EVOS FL Auto Imaging System	Life Technologies		Microscopio
de fluorescenciaEVOS Incubadora en el escenario	Life Technologies		Cámara de incubadora
Fondo de vidrio 96 placas de pocillos N 1.5 sin recubrimiento	MatTek Corporation	P96G-1.5-5-F
cabra-anti-humano-Alexa-633	Life Technologies	A21091
HEPES	Sigma	H3537
humanos anti-ACA	incorporados	15-234	Dilución 1/30
ImageJ	NIH
KCl	Sigma	P5405
KH2PO4	Sigma	P5655
Leica SP8 equipado con un objetivo de inmersión en aceite	Leica
7H20	Sigma	M7774
Milrinone	Sigma	M4659
Na2HPO4	Sigma	S2429
NaCl	Sigma	S5886
NaN3	Sigma	S2002
Nocodazol	Sigma	M1404
Paraformaldhído (PFA)	Sigma	P6148
PIPES	Sigma	P6757
Conejo anti-MAD2	Biolegend		924601 Dilución 1/1000; anteriormente Covance #PRB-452C
Reversine	Cayman Chemical 10004412
Triton-X	Sigma	274348
Tween-20	Sigma	X100
Laboratorios Vectashield	Vector	H-1000