Method Article

Evaluación de la integridad del punto de control del ensamblaje del husillo en ovocitos de ratón

DOI:

10.3791/64459

⸱

September 13th, 2022

 ,  , 
1Department of Genetics, Rutgers, The State University of New Jersey, 2Human Genetics Institute of New Jersey, 3Department of Theriogenology, Faculty of Veterinary Medicine, Mansoura University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El error en la segregación cromosómica es una característica común en los ovocitos. Por lo tanto, estudiar el punto de control de ensamblaje del husillo da pistas importantes sobre los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos. El presente protocolo describe tres ensayos complementarios para evaluar la integridad del punto de control del ensamblaje del huso en ovocitos de ratón.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aneuploidía es la principal anomalía genética que causa aborto espontáneo temprano y fracaso del embarazo en humanos. La mayoría de los errores en la segregación cromosómica que dan lugar a la aneuploidía ocurren durante la meiosis en los ovocitos, pero aún no se comprende completamente por qué la meiosis de los ovocitos es propensa a errores. Durante la división celular, las células evitan errores en la segregación cromosómica activando el punto de control de ensamblaje del huso (SAC). Este mecanismo de control se basa en la detección de accesorios cinetocoro (KT)-microtúbulos (MT) y en la detección de la tensión generada por las fibras del huso. Cuando los KT no están conectados, el SAC se activa y evita la progresión del ciclo celular. El SAC es activado primero por la quinasa MPS1, que desencadena el reclutamiento y la formación del complejo de punto de control mitótico (MCC), compuesto por MAD1, MAD2, BUB3 y BUBR1. Luego, el CCM se difunde en el citoplasma y secuestra CDC20, un activador del complejo/ciclosoma promotor de anafase (APC/C). Una vez que los KT se unen a los microtúbulos y los cromosomas se alinean en la placa de metafase, el SAC se silencia, se libera CDC20 y se activa el APC / C, lo que desencadena la degradación de la ciclina B y la securina, lo que permite el inicio de la anafase. En comparación con las células somáticas, el SAC en los ovocitos no es tan efectivo porque las células pueden sufrir anafase a pesar de tener KT no unidos. Comprender por qué el SAC es más permisivo y si esta permisividad es una de las causas de los errores de segregación cromosómica en los ovocitos aún necesita más investigación. El presente protocolo describe las tres técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en ovocitos de ratón. Estas técnicas incluyen el uso de nocodazol para despolimerizar MT para evaluar la respuesta SAC, rastrear el silenciamiento de SAC siguiendo la cinética de destrucción de Securin y evaluar el reclutamiento de MAD2 a KTs por inmunofluorescencia. Juntas, estas técnicas investigan los mecanismos necesarios para producir óvulos sanos al proporcionar una evaluación completa de la integridad de SAC.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La aneuploidía, que surge de errores en la segregación cromosómica, es la principal causa de abortos espontáneos tempranos y está altamente relacionada con errores en la meiosis1. La meiosis es distinta de la mitosis porque consiste en dos rondas de división celular sin un paso intermedio de replicación del ADN. En la meiosis I, los cromosomas homólogos se separan mientras que las cromátidas hermanas permanecen juntas. En los ovocitos, este paso es propenso a errores, lo que lleva a la producción de huevos aneuploides2.

Para evitar errores de segregación cromosómica, la mayoría de los tipos de células activan un mecanismo de vigilancia que pausa el ciclo celular, llamado punto de control de ensamblaje del huso (SAC). Este mecanismo detecta las uniones cinetocoro (KT)-microtúbulos (MT) y la tensión se genera cuando los cromosomas están orientados de manera bipolar3. Los cinetocoros no unidos desencadenan una respuesta SAC que comienza con el reclutamiento de MPS1, el regulador maestro del SAC, para los cinetocoros 3,4. MPS1 inicia el reclutamiento de otros componentes del SAC, actuando como plataforma para formar el complejo de puntos de control mitóticos (MCC). El MCC, compuesto por MAD1, MAD2, BUB3 y BUBR1, se difunde en el citoplasma e inhibe la activación de APC/C secuestrando su activador CDC20. Una vez que todos los cinetocoros están unidos de manera estable a los MT y los cromosomas se alinean en la placa metafásica, el SAC se silencia y el MCC se desmonta y libera CDC20, lo que permite la activación de APC / C. La APC/C activa degrada la securina y la ciclina B, dos pasos clave para desencadenar el inicio de la anafase 5,6. En las células somáticas, el SAC es estricto porque es activado por un solo cinetocoro no unido y es suficiente para inducir la detención del ciclo celular6. Sin embargo, durante la meiosis ovocitaria, la SAC es más permisiva, y los ovocitos pueden entrar en anafase I con uno o más cinetocoros no unidos 6,7,8,9,10. Comprender por qué el SAC es más permisivo en ovocitos es un área de enfoque continuo en el campo. Los mecanismos que causan defectos en la activación de SAC o el silenciamiento de SAC podrían conducir a errores en la segregación cromosómica o detención prolongada del ciclo celular y muerte celular. Por lo tanto, evaluar los mecanismos que mantienen la integridad SAC en los ovocitos es importante para comprender el proceso de formación de óvulos euploides sanos.

Este protocolo describe técnicas para evaluar exhaustivamente la integridad de SAC en la meiosis de ovocitos de ratón mediante el examen de diferentes pasos críticos del punto de control. En primer lugar, se describe la evaluación de la respuesta SAC después de inducir la activación de SAC. Esta activación se logra mediante la generación de cinetocoros no unidos utilizando nocodazol, un fármaco que despolimeriza las MTs11. En segundo lugar, se describe un método para monitorear el silenciamiento de SAC mediante el seguimiento de la dinámica de la degradación de Securin durante la maduración de los ovocitos. Finalmente, se emplea un ensayo basado en inmunofluorescencia para medir el reclutamiento de MAD2, uno de los componentes del CCM, para los cinetocoros. Juntos, estos ensayos evalúan exhaustivamente la integridad de SAC durante la maduración meiótica de los ovocitos.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos los ratones utilizados en estos protocolos fueron alojados y criados de acuerdo con el Comité Institucional de Uso y Cuidado de Animales de la Universidad de Rutgers (Protocolo 201702497) y las pautas de los Institutos Nacionales de Salud. Estos organismos reguladores aprobaron todos los procedimientos experimentales que involucran estudios en animales. Todos los ratones utilizados en el presente estudio eran hembras CF-1 de 6-8 semanas de edad.

1. Preparación experimental

  1. Antes de iniciar las evaluaciones del SAC, recolectar ovocitos de ratón siguiendo el informe previamente publicado12. Dividir los ovocitos recolectados en tres grupos de tamaño uniforme y mantenerlos en medios de cultivo de Chatot, Ziomek y Bavister (CZB) que contengan milrinona de 2,5 μM (ver Tabla de materiales) para evitar la reanudación meiótica13.
    NOTA: Composición CZB: 81,6 mM NaCL; 4,8 mM KCl; 1,2 mM KH2PO4; 1,2 mM MgSO 4-7H 2O; piruvato de 0,27 mM; 1,7 mM CaCl2; 30,8 mM DL-ácido láctico; 7 mM Taurina; 0,1 mM EDTA; 25 mM NaHCO3; Gentamicina; y 0,3% BSA.
  2. Preparar el ARNc para la microinyección como se describió anteriormente12,14. Amplificar el gen Securin de ratón a partir del ADNc clonado de ovocitos de vesículas germinales de ratón, seguido de subclonación en el vector pMDL2 que contiene la secuencia Gfp15,16.
    1. Para preparar el ARNc de Securin-Gfp, linealizar el plásmido con digestión Nde I. Realizar transcripción in vitro utilizando ARN polimerasa T3 y purificando el ARNc16.
      NOTA: Almacenar el ARNc en alícuotas de 2-3 μL a -80 °C hasta su uso.

2. Tratamiento con nocodazol e imágenes en vivo

  1. Preparar 1 ml de medios de cultivo (CZB) que contengan 5 μM de nocodazol (NOC), 1 ml de medios de cultivo con 5 μM de NOC más 0,5 μM de reversina (NOC + REV) y 1 ml de medios de cultivo con dimetilsulfóxido (DMSO) (1:2000) como control (ver Tabla de materiales).
  2. Para la maduración de los ovocitos y las imágenes vivas, use una placa de 96 pocillos precalentada en la incubadora a 37 ° C, 5% deCO2 y 80% de humedad. En el primer pocillo, cargar 150 μL del tratamiento de control DMSO; en el segundo pozo, cargar 150 μL de tratamiento con NOC; y en el tercer pozo, carga 150 μL de tratamiento NOC + REV. Mantenga la placa en la incubadora en las mismas condiciones que las anteriores hasta que la necesite.
    NOTA: En la placa de 96 pocillos, evite utilizar la primera fila y la primera columna porque la sombra del borde interfiere con la calidad de las imágenes.
  3. Para iniciar la maduración meiótica, retire la milrinona. Mientras observa los ovocitos bajo un microscopio estereoscópico con un aumento entre 30x-64x, lave la milrinona del medio transfiriendo secuencialmente los ovocitos a través de seis gotas de 100 μL de medios de cultivo sin milrinona que contengan DMSO y colóquelos en el pocillo correspondiente de la placa de 96 pocillos con una pipeta manual o bucal.
    1. Cuente los ovocitos recogiéndolos con una pipeta manual o bucal y entregándolos a la siguiente gota para evitar perder alguno. Los ovocitos son células únicas, grandes (~80 μm de diámetro) y redondas. El núcleo aparecerá como un botón en el centro de la célula, y la membrana y la zona pelúcida rodean el ovocito.
      NOTA: Transfiera los ovocitos entre gotas mientras mueve la menor cantidad de líquido posible. Esto permite la eliminación óptima de la milrinona de los medios de cultivo. Si los ovocitos no logran reanudar la meiosis, es probable que la milrinona no se haya eliminado de manera efectiva.
  4. Repita el mismo proceso (paso 2.3) para el tratamiento NOC y NOC + REV.
  5. Imagen de los ovocitos utilizando un microscopio de campo claro equipado con una cámara de incubadora con un ambiente controlado en estas condiciones: 37 °C, 5% deCO2 y 80% de humedad. Capturar imágenes en el plano medio de los ovocitos a intervalos de 20 min durante 24 h.
  6. Cuantificar el número de ovocitos que extruyen un cuerpo polar (PB) identificando las células que pasan por citocinesia asimétrica. El resultado será una pequeña célula (PB) junto al huevo y dentro de la zona pelúcida compartida. Vea las imágenes utilizando el software de imágenes (ImageJ, consulte Tabla de materiales).
  7. Importe la secuencia de imágenes en el software de análisis de imágenes y avance los fotogramas hasta que una o más células pasen por citocinesis asimétrica. Calcular el porcentaje de ovocitos que extruyen un PB del total de ovocitos17.

3. Seguimiento del patrón de degradación de Securin-gfp durante la maduración meiótica

  1. Centrífuga 3 μL de ARNc de securina-GFP (paso 1.2) a 19.283 x g durante 30 min a 4 °C18.
    NOTA: Utilice el sobrenadante para evitar cargar impurezas que podrían causar obstrucción de la aguja durante la microinyección.
  2. Siga paso a paso la microinyección de ovocitos, ampliamente descrita en la referencia12. Microinyectar ovocitos detenidos en profase I con 100 ng/μL de ARNc de Securin-gfp preparados en el paso 1.2.
  3. Después de la microinyección, dejar que los ovocitos se recuperen y traducir el ARN en la incubadora deCO2 durante al menos 3 h. Verifique la expresión observando los ovocitos en un sistema automatizado de imágenes de fluorescencia multicanal (consulte la Tabla de materiales) para ver la señal GFP.
  4. Como se describe en el paso 2.2, cargue 150 μL de medios de cultivo con o sin 5 μM de nocodazol y 150 μL de medios de cultivo con 0,5 μM de reversina en tres pocillos diferentes de una placa de 96 pocillos.
  5. Lave los ovocitos microinyectados a través de seis gotas de medios de cultivo sin milrinona y transfiera 1/3 de los ovocitos a cada tratamiento.
  6. Mantener la placa en la incubadora a 37 °C, con un 5% deCO2 y un 80% de humedad hasta que los ovocitos reanuden la meiosis, alrededor de 3 h después del lavado de milrinona.
    NOTA: Utilice un microscopio estereoscópico con un aumento entre 30x-64x para evaluar la ruptura de la envoltura nuclear como un sello distintivo de la reanudación meiótica.
  7. Grabar imágenes de la maduración de los ovocitos utilizando un microscopio de fluorescencia equipado con una cámara de incubadora, tal como se describe en el paso 2.6. Use la configuración de campo claro para encontrar los ovocitos en el pozo. Utilice un filtro 488 para detectar la señal Securin-gfp y ajuste la intensidad de fluorescencia para evitar la sobreexposición de las células.
    1. Si el sistema de imágenes está automatizado, guardar las posiciones de los ovocitos en cada pocillo. Debido a que Securin-gfp se distribuye uniformemente en el citoplasma, capturar imágenes en el plano medio de los ovocitos a intervalos de 20 min durante 24 h. Para capturar grupos de ovocitos en una imagen, use una lente objetiva de menor aumento, como 10x.
  8. Utilice software de análisis de imágenes para cuantificar la destrucción de Securin-gfp. Abra las imágenes del canal GFP. Comience en el punto de tiempo 1. En el software de análisis preferido, utilice una herramienta de selección o forma para marcar cada ovocito y generar una región de interés (ROI) para cada célula.
    1. Utilice el mismo ROI para seleccionar un área de fondo que se restará más tarde. Mide la intensidad de píxeles GFP en cada ROI.
  9. Utilizando los ROI para cada ovocito generado en el paso 3.8, medir la intensidad de GFP en todos los puntos de tiempo.
    NOTA: En algunos programas de software, una pestaña "Analizar" permite la selección de la función Medir.
    1. Luego, avance al siguiente marco de tiempo y repita este proceso para medir la intensidad de GFP en cada marco de tiempo. Por último, a cada valor GFP, reste la medición del ROI en el fondo seleccionado en el paso 3.8. Este análisis dará un valor para la intensidad de Securin-gfp para cada ovocito en cada punto de tiempo.
  10. Extraiga diferentes parámetros del patrón de destrucción de Securin: (a) el momento en que comenzó la degradación de Securin-gfp. Esto indica cuándo comenzó el silenciamiento de SAC; b) la hora de la señal mínima Securin-gfp. Esto indica cuándo el silenciamiento SAC ha caído por debajo de un nivel umbral para permitir una alta activación de APC / C y una degradación completa de Securin-GFP; c) el índice de destrucción de Securin-GFP19. Esto indica qué tan rápido la actividad de SAC cae por debajo de un nivel umbral para la activación de APC / C y la degradación de Securin-GFP.

4. Reclutamiento de MAD2 en cinetocoros por inmunofluorescencia durante la maduración meiótica

NOTA: Para la recolección y maduración de ovocitos, consulte el informe publicado anteriormente12.

  1. Dividir los ovocitos en tres grupos. Transfiera cada grupo de ovocitos a gotas de 100 μL de medios de cultivo sin milrinona. Cubra las gotas con aceite mineral y colóquelas en la incubadora (37 °C, 5% deCO2 y 80% de humedad) durante 3 h, 5 h y 7 h para alcanzar la prometafase I temprana, la prometafase I tardía y la metafase I, respectivamente.
    NOTA: Coloque cada punto de tiempo en un plato diferente para evitar sacar el mismo plato de la incubadora varias veces, lo que afecta el momento regular de la maduración meiótica.
  2. En los puntos de tiempo asignados, fijar los ovocitos transfiriéndolos a gotas de 500 μL de PFA al 2% en 1x tampón PHEM durante 20 min a temperatura ambiente, utilizando un plato de vidrio de 9 pocillos como se describió anteriormente20. Luego, transfiera las células a un pocillo limpio que contenga una gota de 500 μL de solución de bloqueo (PBS + 0.3% BSA + 0.01% Tween-20 + 0.02% NaN3).
    NOTA: Composición PHEM: 60 mM PIPES; 25 mM HEPES; 10 mM EGTA; y 2 mM MgCl2.
    NOTA: Se puede detener en este punto y almacenar los ovocitos en solución de bloqueo en la placa de 9 pocillos a 4 °C hasta el momento conveniente para completar la inmunofluorescencia.
  3. Para continuar la detección de MAD2, transfiera los ovocitos a un pocillo limpio que contenga una gota de 500 μL de solución de permeabilización (PBS + 0,3% BSA + 0,1% TritonX-100 + 0,02% NaN3). Incubar durante 20 minutos a temperatura ambiente, y luego transferir las células a un nuevo pocillo de solución de bloqueo e incubar durante 10 minutos.
  4. Para el resto de los pasos de inmunofluorescencia, use una tapa de plato de 96 pocillos con hendiduras como se describió anteriormente20. Use una cámara oscura humidificada para evitar la exposición a la luz y la evaporación. Transfiera los ovocitos a una gota de 30 μL de solución bloqueante con anticuerpo anti-MAD2 (1:1000, conejo) y anticuerpo anticentromérico (ACA) (1:30, humano) (ver Tabla de materiales) e incubar durante 2 h a temperatura ambiente.
    NOTA: La tapa del plato de 96 pocillos deja espacio para el procesamiento de varias proteínas y grupos al mismo tiempo.
  5. Para lavar el exceso de anticuerpos primarios, transfiera las células a una gota de 30 μL de 1x tampón PHEM suplementado con Tritón al 0,5% e incubar durante 10 minutos en la cámara humidificada. Repita este paso dos veces más.
  6. Realizar el cuarto lavado, transfiriendo las células a una gota de 30 μL de 1x tampón PHEM sin 0,5% 1x Tritón, e incubar durante 10 min.
  7. Transfiera las células a una gota de 30 μL de solución bloqueante que contenga anticuerpos secundarios como anti-humano-633 (1:200) y anti-conejo-568 (1:200) (ver Tabla de materiales) e incubar durante 1 h a temperatura ambiente.
    NOTA: Elija la combinación de fluoróforos en función de sus láseres o filtros de microscopio.
  8. Para lavar el exceso de anticuerpos secundarios, repita los pasos 4.5-4.6.
  9. Para montar las celdas en el portaobjetos del microscopio, transfiera las células a una gota de 10 μL de medios de montaje que contengan DAPI (0,1 mg/ml) (consulte la Tabla de materiales). Agregue pequeños puntos de vaselina a cada esquina del cubreobjetos, colóquelos con cuidado encima de la gota del medio de montaje y presione lentamente para distribuir. Use esmalte de uñas transparente para sellar el cubreobjetos de la corredera. Para obtener una descripción más detallada del proceso de montaje, consulte la referencia20.
  10. Imagen cinetocoros usando un microscopio confocal (ver Tabla de materiales) equipado con un objetivo 40x o 63x. Usando la señal ACA, determine el rango z que permite obtener imágenes de toda el área del cromosoma.
    NOTA: Se puede utilizar un zoom óptico de 4,0 y un tamaño de paso z de 0,5 μm en algunos sistemas de imágenes. Estos parámetros pueden variar de un sistema a otro, y la optimización será necesaria.
  11. Analice la intensidad de MAD2 en cinetocoros utilizando software de análisis de imágenes. Haga una proyección máxima de z-stack y luego divida los canales.
  12. En primer lugar, cree una máscara utilizando el canal ACA seleccionando el canal ACA para establecer un umbral que identifique todas las señales de cinetocoro. Vaya a la pestaña de edición y cree una selección. Luego, cree un ROI con esta selección.
  13. Seleccione el canal MAD2 y traiga la selección creada en el paso 4.12. Seleccione un método de umbral que se adapte mejor a la señal MAD2. Mide la intensidad.
    NOTA: Seleccione el método de umbral en el tratamiento de control y manténgalo constante al analizar diferentes tratamientos.
  14. Para hacer cálculos de intensidad de píxeles relativos, divide la intensidad de cada celda por la intensidad promedio de los ovocitos WT en el experimento.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Evaluación de la capacidad de respuesta de la SAC mediante el tratamiento con nocodazol
El propósito de este experimento es evaluar la activación y fuerza de SAC. Al usar nocodazol para despolimerizar los microtúbulos del huso, todos los cinetocoros se desunirán, lo que causará una detención del ciclo celular mediada por SAC. En el sistema de imagen actual, los ovocitos de control tratados con DMSO extruyeron un cuerpo polar alrededor de 14 h después de la liberación de milrinona (

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El punto de control de ensamblaje del husillo es un mecanismo de control crítico durante la división celular diseñado para evitar errores de segregación cromosómica. Permite que la célula tenga tiempo suficiente para corregir los accesorios KT-MT incorrectos. La meiosis en ovocitos es un proceso propenso a errores, donde la mayor parte de la mala segregación cromosómica ocurre durante la meiosis I, lo que lleva a la generación de óvulos aneuploides que son la principal causa de abortos espontáneos tempranos e infertilida...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos que revelar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La financiación para este proyecto fue proporcionada por los Institutos Nacionales de Salud (R35GM136340 a KS).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA4503
DAPILife TechnologiesD1306
Dimetil-sulfóxido (DMSO)SigmaD5879
Burro-anti-conejo-Alexa-568Life TechnologiesA10042
EVOS FL Auto Imaging SystemLife TechnologiesMicroscopio
de fluorescenciaEVOS Incubadora en el escenarioLife TechnologiesCámara de incubadora
Fondo de vidrio 96 placas de pocillos N 1.5 sin recubrimientoMatTek CorporationP96G-1.5-5-F
cabra-anti-humano-Alexa-633Life TechnologiesA21091
HEPESSigmaH3537
humanos anti-ACAincorporados15-234Dilución 1/30
ImageJNIH
KClSigmaP5405
KH2PO4SigmaP5655
Leica SP8 equipado con un objetivo de inmersión en aceiteLeica
7H20SigmaM7774
MilrinoneSigmaM4659
Na2HPO4SigmaS2429
NaClSigmaS5886
NaN3SigmaS2002
NocodazolSigmaM1404
Paraformaldhído (PFA)SigmaP6148
PIPESSigmaP6757
Conejo anti-MAD2Biolegend924601 Dilución 1/1000; anteriormente Covance #PRB-452C
ReversineCayman Chemical 10004412
Triton-XSigma274348
Tween-20SigmaX100
Laboratorios VectashieldVectorH-1000
AnticuerposMgSO4 de 63 veces, 1,40 NA;

References

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