Extracción de Lumican de la membrana amniótica y determinación de su temperatura de almacenamiento

Resumen

El presente protocolo describe la extracción de lumican de la membrana amniótica (AM) y sus condiciones de almacenamiento como extracto de AM (AME) a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días para cuantificar sus proteínas y la concentración de lumicano.

Resumen

Lumican es un pequeño proteoglicano rico en leucina en la membrana amniótica humana (AM) que promueve la epitelización corneal y la organización de las fibras de colágeno, manteniendo la transparencia corneal. En el presente trabajo, se propone un método de extracción de proteínas de AM para obtener lumican. Además, se evalúa la estabilidad de lumicano en el extracto AM (AME) almacenado a diferentes temperaturas y períodos de tiempo. 100 mg de AM fueron descongelados y desepitelizados mecánicamente. La AM desepitelizada se congeló y trituró hasta obtener un polvo fino, que se solubilizó con 2,5 mL de tampón salino con inhibidores de la proteasa y se centrifugó para la extracción de proteínas. El sobrenadante se recolectó y almacenó a -20 °C, 4 °C y temperatura ambiente (RT) durante 6, 12, 20 y 32 días. Posteriormente, lumican se cuantificó en cada AME. Esta técnica permite un protocolo accesible y adquirible para la extracción lumican de AM. La concentración de Lumican se vio afectada por el tiempo de almacenamiento y las condiciones de temperatura. Lumican en el AME de 12 días almacenado a -20 °C y 4 °C fue significativamente mayor que otros AME. Esta extracción lumica podría ser útil para desarrollar tratamientos y soluciones farmacéuticas. Se necesitan estudios adicionales para determinar los usos de AME lumican en el proceso de reepitelización y cicatrización de heridas.

Introducción

Uno de los tratamientos más utilizados para las afecciones corneales es el trasplante de membrana amniótica; Sin embargo, en los últimos años, han surgido nuevas propuestas para utilizar diversos componentes del tejido amniótico como tratamientos alternativos y adyuvantes. Entre los componentes más estudiados de AM se encuentran los obtenidos del extracto de AM (AME)1,2,3,4,5,6,7. AM contiene múltiples factores solubles como proteínas ant....

Protocolo

Todos los procedimientos experimentales fueron aprobados por la Junta de Revisión Institucional (Proyecto Nº CEI-2020/06/04). La AM se obtuvo del banco de amnios del Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana (de sujetos humanos no identificados), preparado tal como lo describen Chávez-García et ^al.17.

1. Preparación del extracto de membrana amniótica

1. Obtenga 100 mg de AM del banco de amnios.
   NOTA: Según un informe anterior, 50 mg de AM secretan un total de 10 ng / ml de lumican¹⁴. Para obtener una mayor concentración de lumican, use 100 mg de AM, equivalente a....

Resultados

Los resultados se informan como el valor medio ± la desviación estándar (DE). Se realizaron pruebas t de Student y análisis de varianza (ANOVA). Los valores de p < 0,05 se consideraron estadísticamente significativos. El análisis estadístico se realizó utilizando software estadístico (ver Tabla de materiales).

La cantidad total de proteína en el AME se vio afectada por el tiempo y las condiciones de almacenamiento. La concentración de proteína basal fue si.......

Discusión

En este estudio, se analizó la presencia de lumican en el AME y su correlación directa con su estabilidad bajo diferentes condiciones de almacenamiento. Curiosamente, cuando se cuantificó la concentración total de proteína en AME, la concentración de proteína aumentó después del almacenamiento. La evidencia sugiere tres mecanismos que podrían cambiar la concentración de proteínas en el almacenamiento congelado: la desnaturalización en frío, la concentración congelada de solutos y el despliegue parcial inducido por el hie.......

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 N H2SO4 solución de parada	R& D Sistemas	DY994
100 μ Micropipeta L	Eppendorf
1000 μ L micropipeta	Eppendorf
15 mm Placa de Petri	Symlaboratorios
18 G Aguja (1,2 mm x 40 mm)	BD Becton Dickinson
Tubo de microcentrífuga de 2 mL	Eppendorf	Z606340
jeringa de plástico de 20 mL	BD Becton Dickinson
20 μ Micropipeta L	Eppendorf
20-200 μ Micropipeta L	Eppendorf
Tubo de microcentrífuga de 5 mL	Microplaca Eppendorf	30119401
96 pocillos	SARSTEDT	821581
Papel de aluminio	N/A	N/A
Membrana amniótica	Instituto de Oftalmología Conde de Valenciana Banco		100 mg
Solución salina equilibrada	Bausch + Lomb	BSS-403802
Vaso de precipitados	N/A	N/A
BioRender	BioRender
Balancín compacto	BioRad	970822DD	Mod. 5202SD-BIO
completo, sin EDTA, Inhibidor de la proteasa comprimidos de cóctel	Roche	11 873 580 001	Inhibidor de la proteasa
Daiggner vortex Genie 2	A.Daigger & Co. , INC	22220A
Dispasa II	Gibco	17105-041
Espectrómetro de placa ELISA	Thermo Labsystems& nbsp;	35401106
Congelador
Prisma GraphPad	GraphPad Software, Inc	versión 9	análisis estadístico y programa gráfico
Kit ELISA Human lumican DuoSet	R& D Systems	DY2846-05	anticuerpos de captura Lumican humana
	Forma Scientific	3326 S/N 36481-7002
Microscopio de luz invertida	Olympus	6A13921	para confirmar la desepitelización  Mod.CK2
Campana de flujo laminar	Forma Scientific	14753-567	Mod.1184
Nitrógeno líquido	N/A	N/A
Mortero	N/A	N/A
Pipeta multicanal	Eppendorf
Tanque de nitrógeno	Thermo Scientific		Mod. Biocan 20
Toallas de papel	N/A	N/A
Solución salina tamponada con fosfato	R& D Systems	DY006
Pierce Kit de ensayo de proteínas Lowry modificado	Thermo Scientific	23240
Selladores	de placas R& D Systems	DY992
Diluyente de reactivos	R& D Systems	DY995	1% BSA en PBS, pH 7.2-7.4, 0.2 μ m filtrado
Centrífuga refrigerada	centurion scientific Ltd	15877	mod. K2015R
Raspador de células de policía de goma	NEST	710001	para la desepitelización mecánica
Cuchillo de bisturí	Braun	BB521	No. 10 o 21
Estreptavidina-HRP 40 veces concentrado	R& D Systems	parte 893975
Sustrato de solución de tetrametilbencidina (TMB)	R& D Systems	DY999
Pinzas dentadas	Invent Germany	6b	inox
Agua ultrapura	PISA
Tampón de lavado	R& D Systems	WA126	0.05% Tween 20 en PBS, pH 7.2-7.4