Artículo de método

Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D

DOI:

10.3791/64462

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16 de septiembre de 2022

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1Department of Psychiatry, University of Iowa, 2Department of Radiology, University of Iowa, 3Carver College of Medicine, University of Iowa, 4Iowa Neuroscience Institute, University of Iowa, 5Pappajohn Biomedical Institute, University of Iowa

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo explica la generación de una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas para investigar las primeras etapas del desarrollo cerebeloso.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El desarrollo preciso y oportuno del cerebelo es crucial no solo para la coordinación y el equilibrio motor precisos, sino también para la cognición. Además, la interrupción en el desarrollo cerebeloso se ha implicado en muchos trastornos del desarrollo neurológico, como el autismo, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la esquizofrenia. Las investigaciones del desarrollo cerebeloso en humanos anteriormente solo han sido posibles a través de estudios post-mortem o neuroimágenes, sin embargo, estos métodos no son suficientes para comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren in vivo durante el desarrollo temprano, que es cuando se originan muchos trastornos del desarrollo neurológico. La aparición de técnicas para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a partir de células somáticas y la capacidad de volver a diferenciar aún más las iPSC en neuronas han allanado el camino para el modelado in vitro del desarrollo temprano del cerebro. El presente estudio proporciona pasos simplificados hacia la generación de células cerebelosas para aplicaciones que requieren una estructura monocapa de 2 dimensiones (2D). Las células cerebelosas que representan las primeras etapas del desarrollo se derivan de iPSC humanas a través de los siguientes pasos: primero, los cuerpos embrioides se hacen en cultivo tridimensional (3D), luego se tratan con FGF2 e insulina para promover la especificación del destino cerebeloso, y finalmente, se diferencian terminalmente como una monocapa en sustratos recubiertos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A los 35 días de diferenciación, los cultivos de células cerebelosas derivadas de iPSC expresan marcadores cerebelosos que incluyen ATOH1, PTF1α, PAX6 y KIRREL2, lo que sugiere que este protocolo genera precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos, así como progenitores de células de Purkinje. Además, las células diferenciadas muestran una morfología neuronal distinta y son positivas para marcadores de inmunofluorescencia de identidad neuronal como TUBB3. Estas células expresan moléculas de guía axonal, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1, y podrían servir como modelo para investigar los mecanismos moleculares del crecimiento de neuritas y la conectividad sináptica. Este método genera neuronas cerebelosas humanas útiles para aplicaciones posteriores, incluyendo expresión génica, estudios fisiológicos y morfológicos que requieren formatos monocapa 2D.

Introducción

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Comprender el desarrollo cerebeloso humano y las ventanas de tiempo críticas de este proceso es importante no solo para decodificar las posibles causas de los trastornos del desarrollo neurológico, sino también para identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica. Modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro ha sido un desafío, sin embargo, con el tiempo, han surgido muchos protocolos que diferencian las células madre embrionarias humanas (hESC) o iPSC con destinos de linaje cerebeloso 1,2,3,4,5,6,7,8 . Además, es importante desarrollar protocolos que generen resultados reproducibles, sean relativamente simples (para reducir el error) y no sean pesados en costos monetarios.

Los primeros protocolos para la diferenciación cerebelosa se generaron a partir de cultivos 2D a partir de cuerpos embrioides (EB) en placas, induciendo el destino cerebeloso con varios factores de crecimiento similares al desarrollo in vivo, incluyendo WNT, BMPs y FGFs 1,9. Los protocolos publicados más recientes indujeron la diferenciación principalmente en el cultivo de organoides 3D con FGF2 e insulina, seguido de FGF19 y SDF1 para estructuras rómbicas similares a labios3,4, o utilizaron una combinación de FGF2, FGF4 y FGF85. Ambos métodos de inducción de organoides cerebelosos dieron como resultado organoides cerebelosos 3D similares, ya que ambos protocolos informaron una expresión similar de marcadores cerebelosos en puntos de tiempo idénticos. Holmes y Heine ampliaron su protocolo 3D5 para mostrar que las células cerebelosas 2D se pueden generar a partir de hESCs e iPSCs, que comienzan como agregados 3D. Además, Silva et al.7 demostraron que las células que representan neuronas cerebelosas maduras en 2D pueden generarse con un enfoque similar al de Holmes y Heine, utilizando un punto de tiempo diferente para cambiar de 3D a 2D y extender el tiempo de crecimiento y maduración.

El protocolo actual induce el destino cerebeloso en iPSC libres de alimentador mediante la generación de cuerpos embrioides (EB) flotantes libres utilizando insulina y FGF2 y luego colocando los EB en platos recubiertos de OLP / laminina el día 14 para el crecimiento y diferenciación 2D. Para el día 35, se obtienen células con identidad cerebelosa. La capacidad de recapitular las primeras etapas del desarrollo cerebeloso, especialmente en un entorno 2D, permite a los investigadores responder preguntas específicas que requieren experimentos con una estructura monocapa. Este protocolo también es susceptible de modificaciones adicionales, como superficies con micropatrones, ensayos de crecimiento axonal y clasificación celular para enriquecer las poblaciones celulares deseadas.

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Protocolo

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La investigación con sujetos humanos fue aprobada bajo el número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa número 201805995 y el número de aprobación del Comité de Células Madre Pluripotentes Humanas de la Universidad de Iowa 2017-02. Las biopsias de piel se obtuvieron de los sujetos después de obtener el consentimiento informado por escrito. Los fibroblastos se cultivaron en DMEM con 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM a 37 °C y 5% deCO2. Los fibroblastos se reprogramaron utilizando un kit de reprogramación episomal siguiendo el protocolo del fabricante (ver Tabla de materiales) utilizando un nucleofector para electroporación. Todos los procedimientos se realizaron en un gabinete de seguridad biológica Tipo A2 de Clase II ("capucha" para abreviar). Todos los medios de cultivo celular estaban libres de antibióticos; Por lo tanto, cada componente que entró en la campana se limpió con etanol al 70%. Todos los medios y componentes de cultivo celular se filtraron estérilmente o se abrieron en la campana para mantener su esterilidad.

1. Preparación experimental

  1. Prepare placas recubiertas de matriz de membrana basal (BMM).
    NOTA: BMM se solidifica más rápidamente a temperaturas más cálidas. Las placas deben prepararse rápida e inmediatamente a 4 °C para su almacenamiento.
    1. Descongele el BMM (ver Tabla de materiales) en hielo, a 4 °C durante al menos 2 h, o durante la noche.
    2. Mezclar DMEM/F12 y BMM hasta una concentración final de 80 μg/mL. Distribuir la solución de BMM en placas de cultivo de tejidos (1 ml para placas de 35 mm y 2 ml para placas de 60 mm) e incubar a 37 °C durante al menos 1 h o durante la noche antes de colocar las células.
      NOTA: Los platos no utilizados se pueden conservar a 4 °C durante 2 semanas.
  2. Prepare placas recubiertas de poli-L-ornitina/laminina (OLP/laminina).
    1. Prepare 20 μg/ml de PLO (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ estéril y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar durante la noche a 37 °C en la incubadora.
    2. Al día siguiente, aspirar la OLP con un aspirador de vacío y lavar dos veces con DPBS+/+. Secar al aire en la campana.
      NOTA: Las placas secadas al aire se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas, envueltas en papel de aluminio, para su uso futuro.
    3. Prepare 10 μg/ml de laminina (consulte la Tabla de materiales) en DPBS+/+ y agregue 1 ml a cada pocillo de una placa de 6 pocillos. Incubar al menos durante 3 h o durante la noche a 37 °C en la incubadora.
    4. Aspire la laminina con un aspirador de vacío y agregue 1 ml de DPBS+/+ mediano o estéril.
      NOTA: El recubrimiento de laminina no debe secarse. PBS o un medio de cultivo apropiado debe agregarse inmediatamente para evitar esto. Las placas recubiertas se pueden almacenar a 4 °C durante un máximo de 2 semanas.
  3. Prepare la solución de paso de PSC.
    NOTA: Se requiere un osmómetro (consulte la Tabla de materiales) para hacer la solución de paso PSC10.
    1. Disolver 11,49 g de cloruro de potasio (KCl) y 0,147 g de citrato de sodio dihidratado (HOC(COONa)(CH 2 COONa)2*2H2O)en 400 ml de agua estéril de cultivo celular (ver Tabla de materiales).
    2. Mida el volumen de la solución y anístrelo como el volumen inicial (Vi).
    3. Mida la osmolaridad y ajústela a 570 mOsm agregando agua estéril de grado de cultivo celular utilizando la fórmula Vi × Oi = Vf × 570 mOsm.
    4. Filtrar-esterilizar la solución con un filtro de 0,20 μm y hacer 10 ml de alícuotas. Guarde las alícuotas a temperatura ambiente (RT) hasta por 6 meses.
  4. Preparar el medio de células madre pluripotentes (PSC).
    NOTA: Las iPSC se mantienen en un medio que contiene FGF2 termoestable (consulte la Tabla de materiales), lo que proporciona un horario de alimentación libre de fines de semana. Otros medios PSC disponibles comercialmente no han sido probados para este protocolo.
    1. Descongele el suplemento medio de PSC durante la noche a 4 °C.
    2. Añadir 10 ml de suplemento de medio PSC a 500 ml de medio de PSC basal. Preparar 25 ml de alícuotas y almacenar a −20 °C.
      NOTA: Las alícuotas congeladas pueden almacenarse a -20 °C durante 6 meses. Las alícuotas descongeladas deben conservarse a 4 °C y utilizarse en un plazo de 2 semanas. Las células se pueden congelar para su almacenamiento a largo plazo en un medio PSC con 10% (v / v) de dimetilsulfóxido (DMSO).
  5. Prepare el medio de descongelación PSC.
    1. Suplemento de medio PSC con 50 nM de cromano, 1,5 μM de emricasan, 1x suplemento de poliamina y 0,7 μM trans-ISRIB (CEPTcocktail 11) (ver Tabla de materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm y conservar a 4 °C durante un máximo de 4 semanas.
  6. Preparar pipetas de vidrio desmenuzado.
    1. Tire de las pipetas Pasteur de vidrio de 22,9 cm (9 pulgadas) en dos piezas por encima de un quemador Bunsen, ~ 2 cm por debajo del cuello, creando dos pipetas, con el lado más delgado siendo ~ 4 cm más corto que el otro.
    2. Con la ayuda de la llama, doble las puntas del lado tirado para crear una "r" suave.
    3. Coloque las pipetas tiradas en manguitos de autoclave y autoclave para esterilización.
  7. Preparar el medio de diferenciación cerebelosa (MDL).
    1. Mezcle IMDM y la mezcla de nutrientes F12 de Ham en una proporción de 1: 1. Complemente la mezcla con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina, concentrado de lípidos químicamente definido al 1% (v/v), 0.45 mM 1-tio-glicerol, 15 μL/ml de apotransferrina, 5 mg/ml de albúmina sérica bovina (BSA) y 7 μg/ml de insulina (ver Tabla de materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en el plazo de 1 mes.
  8. Preparar el medio de maduración cerebelosa (MMC).
    1. Suplemento de medio neurobasal con 1x suplemento de L-alanina-L-glutamina y 1x suplemento de N-2 (ver Tabla de Materiales).
    2. Filtrar-esterilizar con un filtro de 0,20 μm, almacenar a 4 °C y utilizar en un plazo de 2 semanas.

2. Cultura iPSC sin alimentador

  1. Descongele las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Introducir una placa BMM (paso 1.1) en la incubadora a 37 °C para gelificar durante al menos 1 h o durante la noche antes de descongelar las células.
    2. Precaliente 10 ml de medio de descongelación PSC (paso 1.5) a 37 °C.
    3. Transfiera el criovial con células de nitrógeno líquido a un baño de agua a 37 ° C.
      NOTA: Para evitar generar una fuente de contaminación en el espacio de cultivo celular, no se recomienda el uso de un baño de agua estándar. En cambio, el agua dulce se puede calentar en un vaso pequeño a 37 ° C para generar un baño de agua de un solo uso.
    4. Cuando quede un pequeño trozo de hielo en el tubo, retírelo del baño de agua, seque el tubo y rocíe con etanol al 70%. Transfiera el tubo a la campana y use una pipeta serológica de 2 ml o 5 ml (consulte la Tabla de materiales) para transferir suavemente las células a un tubo cónico de 15 ml.
    5. Agregue 8 ml de medio de descongelación de PSC a las células gota a gota mientras gira el tubo cónico. Centrifugar a 200 x g durante 5 min en RT.
    6. Aspire cuidadosamente el sobrenadante con un aspirador de vacío sin alterar la bolita celular. Resuspender las células en 2 mL de medio de descongelación PSC.
    7. Aspire el BMM de la placa y agregue las células resuspendidas gota a gota por toda la placa para una distribución uniforme.
    8. Colocar la placa en la incubadora a 37 °C, 5%CO2. Actualice el medio al día siguiente con el medio PSC. Después de eso, cambie el medio diariamente.
  2. Mantenga las celdas siguiendo los pasos a continuación.
    1. Precaliente el volumen necesario de medio PSC a 37 °C (por ejemplo, 1 ml de medio por placa de 35 mm).
    2. Investigar las placas en busca de células o colonias diferenciadas y extraer las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado (paso 1.6).
      NOTA: Las colonias iPSC tienen bordes lisos con células morfológicamente idénticas.
    3. Cambiar el medio gastado diariamente y el paso cada 3-4 días o cuando se alcance el 70% de confluencia.
  3. Paso de las celdas.
    1. Coloque la cantidad necesaria de placas BMM en la incubadora durante al menos 1 h o durante la noche antes de pasar. Precaliente la cantidad necesaria de PSC medio (paso 1.3) a 37 °C.
    2. Con una pipeta de vidrio tirado, limpie cualquier célula o colonia diferenciada.
    3. Aspirar el medio gastado con un aspirador de vacío y añadir medio de disociación PSC, 1 ml por plato de 35 mm. Incubar a 37 °C durante 1-3 min.
      NOTA: Si las colonias se están levantando en la solución de paso de PSC antes de agregar el medio PSC, el tiempo de incubación se puede reducir.
    4. Aspire la solución de paso de PSC y agregue el medio PSC precalentado.
    5. Usando una punta de pipeta estéril de 200 μL, raye las líneas paralelas entre sí en una dirección, gire la placa 90° y haga un segundo conjunto de líneas de rayado perpendiculares a las anteriores (haciendo un patrón de rayado cruzado a través de la placa).
    6. Aspire la solución BMM de las placas fijas. Recoger las colonias mediante una pipeta serológica y distribuirlas en nuevas placas BMM.
    7. Incubar a 37 °C, 5%CO2. Cambie el medio diariamente.
  4. Congelar las células.
    1. Prepare los crioviales etiquetando el contenido y esterilice bajo luz ultravioleta (UV) en la campana (consulte la Tabla de materiales) durante 30 minutos.
    2. Prepare el medio de congelación PSC complementando el medio PSC con DMSO al 10% (v / v). Siga los pasos 2.3.2-2.3.5.
    3. Transfiera las células a un tubo cónico de 15 ml con una pipeta serológica de 5 ml y centrifuga a 200 x g durante 5 min a RT.
    4. Aspirar cuidadosamente el medio y resuspender el pellet celular en medio de congelación PSC.
    5. Distribuir en crioviales. Coloque los viales en un recipiente de congelación y colóquelos en un congelador a -80 °C.
    6. Al día siguiente, transfiera los crioviales a nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo.

3. Diferenciación cerebelosa

NOTA: Antes de comenzar la diferenciación, las iPSC se pasan a seis platos de 35 mm y están listas para la diferenciación cuando están al 70% de confluencia. Cada placa de 35 mm se transferirá a un pocillo de la placa de 6 pocillos.

  1. El día 0, levante las colonias sanas de iPSC para la formación de EB.
    1. Agregue 1 ml de CDM (paso 1.7) suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542 (consulte la Tabla de materiales) a cada pocillo de una placa de fijación ultra baja (ULA) de 6 pocillos y colóquela en la incubadora hasta que las colonias levantadas estén listas para agregarse a los pocillos.
    2. Limpie las células diferenciadas con una pipeta de vidrio tirado. Aspirar el medio y añadir 1 ml de solución de paso PSC por cada plato de 35 mm. Incubar durante 3 min a 37 °C, aspirar y añadir 2 mL de MDL suplementado con 10 μM Y-27632 y 10 μM SB431542.
      NOTA: Si las colonias despegan en la solución de paso de PSC antes de agregar CDM, el tiempo de incubación se puede reducir.
    3. Bajo un microscopio invertido de luz transmitida, levante suavemente las colonias usando el borde doblado de la pipeta de vidrio tirado con un aumento de 4x. Una vez que se levante cada colonia, transfiera suavemente todo a un pocillo de la placa ULA de 6 pocillos con una pipeta serológica de 10 ml. Repita este proceso para cada placa iPSC. Incubar las células a 37 °C con 5% deCO2.
      NOTA: Si las colonias son demasiado grandes o están fusionadas, se pueden cortar con la punta de la pipeta de vidrio extraído para crear EB más pequeños.
  2. El día 2, agregue FGF2 a cada pocillo a una concentración final de 50 ng / ml.
    NOTA: El FGF2 utilizado para la diferenciación cerebelosa no es estable al calor. Este protocolo no ha sido probado con FGF2 termoestable.
  3. El día 7, haz un cambio medio de 1/3. Para 3 ml de medio total en un pozo, con una pipeta de 1.000 μL, aspire suavemente 1 ml de medio gastado y reemplácelo con 1 ml de MDL fresco. Incubar los EB durante 7 días.
  4. El día 14, aspire suavemente casi todo el medio gastado con un pipetor de 1.000 μL. Para garantizar un daño mínimo a los EB, gire la placa para reunir todos los EB en el centro de la placa, y luego incline la placa y aspire lentamente desde el borde.
    1. A medida que la cantidad media disminuye, coloque lentamente la placa plana y continúe aspirando. Deje suficiente medio para evitar que se resequen los EB. Después, agregue 3 ml de CDM fresco suplementado con 10 μM Y-27632. Transfiera los EB utilizando una pipeta serológica de 10 ml a un plato recubierto de OLP/laminina (paso 1.2).
      NOTA: Dependiendo de la aplicación posterior, los EB se pueden transferir a una placa OLP/laminina de 6 pocillos o los EB individuales se pueden transferir a un solo pocillo de una placa o cubrecubierta de 24 pocillos recubierta de OLP/laminina.
  5. El día 15, aspirar el medio y reemplazarlo con CDM fresco.
    NOTA: Es importante agregar suficiente medio a los pocillos para asegurar suficiente medio entre alimentaciones ya que, con el tiempo, habrá evaporación (por ejemplo, para un pozo en una placa de 6 pocillos, agregue 3 ml de medio). Si el medio ha comenzado a acidificarse (se vuelve claro y amarillo), refresque el medio incluso si no está en el horario de alimentación hasta el final del protocolo.
  6. El día 21, aspirar el medio gastado y reemplazarlo con MMC. El día 28, cambie el medio con MMC fresca. En el día 35, cosecha las células para otras aplicaciones.

4. Preparación de la muestra para el aislamiento de ARN

  1. Aspirar el medio y añadir 500 μL de reactivo de disociación celular (ver Tabla de materiales) a cada pocillo de la placa de 6 pocillos. Déjalo actuar durante un par de segundos y aspira.
  2. Incubar el plato, con la tapa puesta, a temperatura ambiente durante 2 min. Golpee los lados de la placa para separar las celdas.
  3. Añadir 1 ml de MMC (paso 1.8) y recoger las células en un tubo de 1,5 ml.
  4. Granular las células por centrifugación utilizando una mini centrífuga de sobremesa (ver Tabla de materiales) durante 30 s a RT (velocidad máxima 2000 x g), desechar el medio y agregar 1 ml de 1x PBS pH 7.4 para lavar el pellet celular.
  5. Vuelva a granular las células con una mini centrífuga de sobremesa durante 30 s en RT y lavar con PBS una vez más.
  6. Granular las células y desechar el PBS. Lise las células en fenol y guanidina isotiocianato que contiene reactivo (ver Tabla de materiales).
    NOTA: Las células lisadas en fenol e isotiocianato de guanidina que contienen reactivo pueden almacenarse a −80 °C hasta por 1 año. Las células se pueden lisar directamente en el plato dependiendo del método de aislamiento de ARN y los reactivos que se utilicen. Debido al bajo número de células en un plato, el aislamiento de ARN utilizando columnas de espín de sílice (ver Tabla de materiales) dará como resultado mayores rendimientos de ARN.

5. Preparación de células para la tinción inmunofluorescente

NOTA: Para una placa de 24 pocillos, un EB por pocillo es suficiente.

  1. En el día 35, aspirar el medio gastado y lavar las células agregando 1 ml de DPBS+/+ por pocillo (para un pocillo de una placa de 24 pocillos).
  2. Aspirar el DPBS+/+ y añadir 500 μL de paraformaldehído frío al 4% (PFA, ver Tabla de materiales) preparado en DPBS+/+ por pocillo. Incubar durante 20 min en RT.
  3. Retire el PFA al 4% y lave las células dos veces con DPBS+/+, como en el paso 5.1. Añadir 1 ml de DPBS+/+ y almacenar las células a 4 °C hasta que se realice la tinción.
    NOTA: Se aconseja hacer la tinción inmunofluorescente dentro de 1 semana después de la fijación para evitar el desprendimiento de células y la pérdida de antígenos. Sin embargo, dependiendo del anticuerpo y la ubicación celular del objetivo, la tinción se puede hacer en momentos posteriores hasta 4 semanas después de la fijación.

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Descripción general de la diferenciación cerebelosa 3D a 2D
Las células cerebelosas se generan a partir de iPSCs. La figura 1A muestra el flujo de trabajo general y la adición de componentes principales para la diferenciación. El día 0, los EB se fabrican levantando suavemente las colonias iPSC (Figura 1B) utilizando una pipeta de vidrio tirado en CDM que contiene SB431542 e Y-27632 y se colocan en placas de fijación ultrabaja. FGF2 se añade ...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La capacidad de modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro es importante para el modelado de enfermedades, así como para promover la comprensión del desarrollo normal del cerebro. Los protocolos menos complicados y rentables crean más oportunidades para la generación de datos replicables y una amplia implementación en múltiples laboratorios científicos. Aquí se describe un protocolo de diferenciación cerebelosa utilizando un método modificado de generación de EB que no requiere enzimas o agentes de disocia...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Agradecemos a Jenny Gringer Richards por su minucioso trabajo en la validación de nuestros sujetos de control, a partir de los cuales generamos las iPSC de control. Este trabajo fue apoyado por NIH T32 MH019113 (a D.A.M. y K.A.K.), el Nellie Ball Trust (a T.H.W. y A.J.W.), NIH R01 MH111578 (a V.A.M. y J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.) y Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. y A.J.W.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10 mL Pipeta serológicaFisher Scientific13-678-26D
1-tio-glicerolSigmaM6145
2 mL Pipeta serológicaFisher Scientific13-678-26B
250 mL Unidad de filtro, 0,2 y micro; m aPES, 50 mm DiaFisher ScientificFB12566502
35 mm Plato de clutura de tejidos de fácil agarreFalcon353001
4D Unidad central NucleofectorLonza276885Nucleofector
5 mL Pipeta serológicaFisher Scientific13-678-25D
60 mm Plato de cultivo de tejidos de fácil agarreFalcon353004
6 pocillos placas de fijación ultra bajasCorning3471
Pasteur desechables de 9" FisherScientific13-678-20D
Apo-transferrinaSigmaT1147
Albúmina sérica bovina (BSA)SigmaA9418
Agua de grado de cultivo celularCytivaSH30529.02
Concentrado lipídico químicamente definidoGibco11905031
Chroman 1Cayman34681
Clase II, Tipo A2, Gabinete de seguridad biológicaNuAire, Inc.NU-540-600Campana, luz ultravioleta
Placa Costar de 24 pocillos, tratadaTC Corning3526
Costar Placa de 6 pocillos, tratada TCSolución Corning3516
DAPI ThermoScientific62248
DMEMGibco11965092
DMEM/F12Gibco11320033
DMSO (Dimetlisulfóxido)SigmaD2438
DPBS+/+Gibco14040133
EmricasanCayman22204
Epi5 Kit de reprogramación episomal iPSCLife TechnologiesA15960
Essential 8-FlexGibcoA2858501medio PSC con sistema de imagen FGF2
EVOS XL Core termoestable LifeTechnologiesAMEX1000
Suero fetal bovino - PremiumSelect Atlanta BiologicalsS11150
FGF2Peprotech100-18B
Suplemento GlutaMAXGibco35050061Suplemento de L-alanina-L-glutamina
Ham's F12 Nutrient MixGibco11765054
HERAcell VIOS 160i Incubadora de CO2Thermo Scientific50144906
Anti-EN2 humano, ratónSanta Cruz Biotechnologysc-293311
Anti-Ki67/MKI67 humano, conejoR& D SystemsMAB7617
Humano anti-PTF1a, conejoNovus BiologicalsNBP2-98726
Anti-TUBB3 humano, ratónBiolegend801213
IMDMGibco12440053
InsulinaGibco12585
Laminina Proteína de ratónGibco23017015
Matrigel MatrixCorning354234Matriz de membrana basal
MEM-NEAAGibco11140050
Mini centrífugaLabnet InternationalC1310Mini centrífuga de sobremesa
Kit de limpieza de ARN monarca (50 µ g)New England BioLabsT2040Columnas de centrifugación de sílice
Monarch Total RNA Miniprep KitEngland BioLabsT2010Columnas de espín de sílice
N-2 suplementoGibco17502-048
Medio neurobasalGibco21103049
PBS, pH 7.4Gibco10010023
PFA 16%Ciencias de la Microscopía Electrónica15710
Suplemento de poliaminaSigmaP8483
Poly-L-Ornithine (PLO)Sigma3655
Cloruro de potasioSigma746436
SB431542Sigma54317
Bolsas transparentes autosellablesSterikingSS-T2 (90x250)Bolsas de autoclave
Sodio citrato dihidratado  Fisher ScientificS279-500
Filtros de jeringa, estériles, PES 0.22 y micro; m, 30 mm DiaResearch Products International256131
Trans-ISRIBCayman16258
TRIzol ReactivoInvitrogen15596018Fenol e isotiocianato de guanidina
Enzima TrypLE Express (1x)Gibco12604039Reactivo de disociación celular 
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Referencias

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