El presente protocolo explica la generación de una monocapa 2D de células cerebelosas a partir de células madre pluripotentes inducidas para investigar las primeras etapas del desarrollo cerebeloso.
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Artículo de método
Modelado del desarrollo cerebeloso humano in vitro en estructura 2D
En este artículo
Resumen
Resumen
El desarrollo preciso y oportuno del cerebelo es crucial no solo para la coordinación y el equilibrio motor precisos, sino también para la cognición. Además, la interrupción en el desarrollo cerebeloso se ha implicado en muchos trastornos del desarrollo neurológico, como el autismo, el trastorno por déficit de atención con hiperactividad (TDAH) y la esquizofrenia. Las investigaciones del desarrollo cerebeloso en humanos anteriormente solo han sido posibles a través de estudios post-mortem o neuroimágenes, sin embargo, estos métodos no son suficientes para comprender los cambios moleculares y celulares que ocurren in vivo durante el desarrollo temprano, que es cuando se originan muchos trastornos del desarrollo neurológico. La aparición de técnicas para generar células madre pluripotentes inducidas por humanos (iPSC) a partir de células somáticas y la capacidad de volver a diferenciar aún más las iPSC en neuronas han allanado el camino para el modelado in vitro del desarrollo temprano del cerebro. El presente estudio proporciona pasos simplificados hacia la generación de células cerebelosas para aplicaciones que requieren una estructura monocapa de 2 dimensiones (2D). Las células cerebelosas que representan las primeras etapas del desarrollo se derivan de iPSC humanas a través de los siguientes pasos: primero, los cuerpos embrioides se hacen en cultivo tridimensional (3D), luego se tratan con FGF2 e insulina para promover la especificación del destino cerebeloso, y finalmente, se diferencian terminalmente como una monocapa en sustratos recubiertos de poli-l-ornitina (PLO) / laminina. A los 35 días de diferenciación, los cultivos de células cerebelosas derivadas de iPSC expresan marcadores cerebelosos que incluyen ATOH1, PTF1α, PAX6 y KIRREL2, lo que sugiere que este protocolo genera precursores neuronales cerebelosos glutamatérgicos y GABAérgicos, así como progenitores de células de Purkinje. Además, las células diferenciadas muestran una morfología neuronal distinta y son positivas para marcadores de inmunofluorescencia de identidad neuronal como TUBB3. Estas células expresan moléculas de guía axonal, incluyendo semaforina-4C, plexina-B2 y neuropilina-1, y podrían servir como modelo para investigar los mecanismos moleculares del crecimiento de neuritas y la conectividad sináptica. Este método genera neuronas cerebelosas humanas útiles para aplicaciones posteriores, incluyendo expresión génica, estudios fisiológicos y morfológicos que requieren formatos monocapa 2D.
Introducción
Comprender el desarrollo cerebeloso humano y las ventanas de tiempo críticas de este proceso es importante no solo para decodificar las posibles causas de los trastornos del desarrollo neurológico, sino también para identificar nuevos objetivos para la intervención terapéutica. Modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro ha sido un desafío, sin embargo, con el tiempo, han surgido muchos protocolos que diferencian las células madre embrionarias humanas (hESC) o iPSC con destinos de linaje cerebeloso 1,2,3,4,5,6,7,8
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Protocolo
La investigación con sujetos humanos fue aprobada bajo el número de aprobación de la Junta de Revisión Institucional de la Universidad de Iowa número 201805995 y el número de aprobación del Comité de Células Madre Pluripotentes Humanas de la Universidad de Iowa 2017-02. Las biopsias de piel se obtuvieron de los sujetos después de obtener el consentimiento informado por escrito. Los fibroblastos se cultivaron en DMEM con 15% de suero fetal bovino (FBS) y 1% de solución de aminoácidos no esenciales MEM a 37 °C y 5% deCO2. Los fibroblastos se reprogramaron utilizando un kit de reprogramación episomal siguiendo el protocolo del fabricante (ver Tabla de ....
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Resultados
Descripción general de la diferenciación cerebelosa 3D a 2D
Las células cerebelosas se generan a partir de iPSCs. La figura 1A muestra el flujo de trabajo general y la adición de componentes principales para la diferenciación. El día 0, los EB se fabrican levantando suavemente las colonias iPSC (Figura 1B) utilizando una pipeta de vidrio tirado en CDM que contiene SB431542 e Y-27632 y se colocan en placas de fijación ultrabaja. FGF2 se añade .......
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Discusión
La capacidad de modelar el desarrollo cerebeloso humano in vitro es importante para el modelado de enfermedades, así como para promover la comprensión del desarrollo normal del cerebro. Los protocolos menos complicados y rentables crean más oportunidades para la generación de datos replicables y una amplia implementación en múltiples laboratorios científicos. Aquí se describe un protocolo de diferenciación cerebelosa utilizando un método modificado de generación de EB que no requiere enzimas o agentes de disocia.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen conflictos de intereses que declarar.
Agradecimientos
Agradecemos a Jenny Gringer Richards por su minucioso trabajo en la validación de nuestros sujetos de control, a partir de los cuales generamos las iPSC de control. Este trabajo fue apoyado por NIH T32 MH019113 (a D.A.M. y K.A.K.), el Nellie Ball Trust (a T.H.W. y A.J.W.), NIH R01 MH111578 (a V.A.M. y J.A.W.), NIH KL2 TR002536 (a A.J.W.) y Roy J. Carver Charitable Trust (a V.A.M., J.A.W. y A.J.W.). Las figuras fueron creadas con BioRender.com.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10 mL Pipeta serológica | Fisher Scientific | 13-678-26D | |
| 1-tio-glicerol | Sigma | M6145 | |
| 2 mL Pipeta serológica | Fisher Scientific | 13-678-26B | |
| 250 mL Unidad de filtro, 0,2 y micro; m aPES, 50 mm Dia | Fisher Scientific | FB12566502 | |
| 35 mm Plato de clutura de tejidos de fácil agarre | Falcon | 353001 | |
| 4D Unidad central Nucleofector | Lonza | 276885 | Nucleofector |
| 5 mL Pipeta serológica | Fisher Scientific | 13-678-25D | |
| 60 mm Plato de cultivo de tejidos de fácil agarre | Falcon | 353004 | |
| 6 pocillos placas de fijación ultra bajas | Corning | 3471 | |
| Pasteur desechables de 9" Fisher | Scientific | 13-678-20D | |
| Apo-transferrina | Sigma | T1147 | |
| Albúmina sérica bovina (BSA) | Sigma | A9418 | |
| Agua de grado de cultivo celular | Cytiva | SH30529.02 | |
| Concentrado lipídico químicamente definido | Gibco | 11905031 | |
| Chroman 1 | Cayman | 34681 | |
| Clase II, Tipo A2, Gabinete de seguridad biológica | NuAire, Inc. | NU-540-600 | Campana, luz ultravioleta |
| Placa Costar de 24 pocillos, tratada | TC Corning | 3526 | |
| Costar Placa de 6 pocillos, tratada TC | Solución Corning | 3516 | |
| DAPI Thermo | Scientific | 62248 | |
| DMEM | Gibco | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Gibco | 11320033 | |
| DMSO (Dimetlisulfóxido) | Sigma | D2438 | |
| DPBS+/+ | Gibco | 14040133 | |
| Emricasan | Cayman | 22204 | |
| Epi5 Kit de reprogramación episomal iPSC | Life Technologies | A15960 | |
| Essential 8-Flex | Gibco | A2858501 | medio PSC con sistema de imagen FGF2 |
| EVOS XL Core termoestable Life | Technologies | AMEX1000 | |
| Suero fetal bovino - Premium | Select Atlanta Biologicals | S11150 | |
| FGF2 | Peprotech | 100-18B | |
| Suplemento GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Suplemento de L-alanina-L-glutamina |
| Ham's F12 Nutrient Mix | Gibco | 11765054 | |
| HERAcell VIOS 160i Incubadora de CO2 | Thermo Scientific | 50144906 | |
| Anti-EN2 humano, ratón | Santa Cruz Biotechnology | sc-293311 | |
| Anti-Ki67/MKI67 humano, conejo | R& D Systems | MAB7617 | |
| Humano anti-PTF1a, conejo | Novus Biologicals | NBP2-98726 | |
| Anti-TUBB3 humano, ratón | Biolegend | 801213 | |
| IMDM | Gibco | 12440053 | |
| Insulina | Gibco | 12585 | |
| Laminina Proteína de ratón | Gibco | 23017015 | |
| Matrigel Matrix | Corning | 354234 | Matriz de membrana basal |
| MEM-NEAA | Gibco | 11140050 | |
| Mini centrífuga | Labnet International | C1310 | Mini centrífuga de sobremesa |
| Kit de limpieza de ARN monarca (50 µ g) | New England BioLabs | T2040 | Columnas de centrifugación de sílice |
| Monarch Total RNA Miniprep Kit | England BioLabs | T2010 | Columnas de espín de sílice |
| N-2 suplemento | Gibco | 17502-048 | |
| Medio neurobasal | Gibco | 21103049 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| PFA 16% | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 15710 | |
| Suplemento de poliamina | Sigma | P8483 | |
| Poly-L-Ornithine (PLO) | Sigma | 3655 | |
| Cloruro de potasio | Sigma | 746436 | |
| SB431542 | Sigma | 54317 | |
| Bolsas transparentes autosellables | Steriking | SS-T2 (90x250) | Bolsas de autoclave |
| Sodio citrato dihidratado | Fisher Scientific | S279-500 | |
| Filtros de jeringa, estériles, PES 0.22 y micro; m, 30 mm Dia | Research Products International | 256131 | |
| Trans-ISRIB | Cayman | 16258 | |
| TRIzol Reactivo | Invitrogen | 15596018 | Fenol e isotiocianato de guanidina |
| Enzima TrypLE Express (1x) | Gibco | 12604039 | Reactivo de disociación celular |
| Osmómetro de presión de vapor | Wescor, Inc. | Osmómetro | modelo 5520 |
| Y-27632 | Biogems | 1293823 |
Referencias
- Erceg, S., Lukovic, D., Moreno-Manzano, V., Stojkovic, M., Bhattacharya, S. S. Derivation of cerebellar neurons from human pluripotent stem cells. Current Protocols in Stem Cell Biology. , Chapter 1, Unit 1H.5 (2012).
- Erceg, S., et al.
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Reimpresiones y permisos
