Artículo de método

Detección de transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos naturales en E. coli

DOI:

10.3791/64523

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24 de marzo de 2023

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1School of Biological Sciences, University of California Irvine, 2Department of Microbiology & Environmental Toxicology, University of California Santa Cruz

En este artículo

Resumen

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La conjugación media la transferencia horizontal de genes mediante la movilización de ADN plásmido a través de dos células diferentes, facilitando la propagación de genes beneficiosos. Este trabajo describe un método ampliamente utilizado para la detección eficiente de la transferencia conjugativa de plásmidos, basado en el uso de marcadores diferenciales en el plásmido conjugativo, donante y receptor para detectar la transconjugación.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La conjugación representa uno de los principales mecanismos que facilitan la transferencia horizontal de genes en bacterias gramnegativas. Este trabajo describe métodos para el estudio de la movilización de plásmidos conjugativos naturales, utilizando dos plásmidos naturales como ejemplo. Estos protocolos se basan en la presencia diferencial de marcadores seleccionables en donante, receptor y plásmido conjugativo. Específicamente, los métodos descritos incluyen 1) la identificación de plásmidos conjugativos naturales, 2) la cuantificación de las tasas de conjugación en cultivo sólido, y 3) la detección diagnóstica de los genes de resistencia a antibióticos y los tipos de replicón plásmido en receptores transconjugados por reacción en cadena de la polimerasa (PCR). Los protocolos descritos aquí se han desarrollado en el contexto del estudio de la ecología evolutiva de la transferencia horizontal de genes, para detectar la presencia de plásmidos conjugativos portadores de genes de resistencia a los antibióticos en bacterias que se encuentran en el medio ambiente. La transferencia eficiente de plásmidos conjugativos observada en estos experimentos en cultivo destaca la relevancia biológica de la conjugación como un mecanismo que promueve la transferencia horizontal de genes en general y la propagación de la resistencia a los antibióticos en particular.

Introducción

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En 1946, Lederberg y Tatum1 describieron un proceso sexual en Escherichia coli K-12 que ahora se conoce como conjugación. La conjugación bacteriana es el proceso por el cual una célula bacteriana (el donante) transfiere material genético unidireccional a otra célula (el receptor) por contacto directo de célula a célula. La conjugación está ampliamente distribuida en las bacterias2,3, aunque la fracción de células donantes que expresan la maquinaria de conjugación es típicamente muy pequeña4.

Los plásmidos son elementos de ADN extracromosómico que se replican de forma autónoma. Además de los genes involucrados en la replicación y mantenimiento de plásmidos, los plásmidos con frecuencia llevan una carga de genes involucrados en la adaptación a desafíos ambientales, como metales pesados o exposición a antibióticos5. Los plásmidos conjugativos son una clase de plásmidos con un conjunto de genes especializados que permiten su transferencia a las células receptoras y apoyan su persistencia después de la transferencia6. Los plásmidos conjugativos varían en tamaño de 21,8 kb a 1,35 Mb en bacterias del filo Pseudomonadota (sinónimo de Proteobacteria), con una mediana de alrededor de 100 kb 5,7. También generalmente tienen un número bajo de copias, posiblemente para mantener la carga metabólica en el huésped baja 8,9.

El aparato conjugativo típico consta de cuatro componentes: un origen de transferencia (oriT), una relaxasa, una proteína de acoplamiento tipo IV y un sistema de secreción tipo IV (una estructura tubular llamada pilus que permite a los donantes contactar a los receptores)6. Sólo una fracción muy pequeña de células portadoras de plásmidos conjugativos expresan la maquinaria de conjugación4, pero si los plásmidos proporcionan una ventaja de aptitud, los transconjugantes pueden expandirse rápidamente en la población. Entre el 35% y más del 80% de los aislados de E. coli recolectados en diferentes hábitats tienen plásmidos conjugativos con genes que confieren resistencia a al menos un antibiótico10,11; Por lo tanto, la transferencia horizontal de genes mediada por plásmidos conjugativos es un mecanismo importante que impulsa la propagación global de genes de resistencia a antibióticos12.

Los experimentos de apareamiento realizados en cultivo de laboratorio han demostrado que la frecuencia de conjugación se ve afectada por múltiples factores, incluida la naturaleza de las células receptoras, la fase de crecimiento, la densidad celular, la relación donante-receptor, si la conjugación se realiza en medios líquidos o sólidos, carbono, oxígeno, sales biliares, concentraciones de metales, presencia de células de mamíferos, temperatura, pH y tiempo de apareamiento13,14, 15.

Este trabajo describe protocolos para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en una cepa huésped dada, cuantificar las tasas de conjugación en cultivo sólido y verificar su transferencia a las células receptoras. Estos protocolos pueden ser utilizados como un primer paso para la identificación de plásmidos conjugativos naturales adecuados para la investigación. Utilizan un número mínimo de pasos simplificados porque están diseñados para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en bacterias obtenidas de múltiples fuentes (ambientales, comensales y patógenas) a escala (docenas a cientos de donantes).

Además, se muestran pruebas para detectar si la movilización de un plásmido conjugativo dado es independiente del antibiótico utilizado para la detección (es decir, la relevancia del gen de resistencia a antibióticos bajo selección) y para comparar las tasas de conjugación de dos plásmidos conjugativos encontrados en diferentes aislados ambientales.

Sobre la base de la composición genética de los plásmidos conjugativos relevantes (replicón plásmido y composición génica de resistencia a antibióticos), cada paso del protocolo puede modificarse para estudiar el impacto de una variedad de factores que probablemente afecten la tasa de conjugación.

Diseño experimental general:
Los componentes esenciales necesarios para establecer un experimento de apareamiento son células donantes, una cepa receptora y medios sólidos para seleccionar donantes (antibiótico A), receptores (antibiótico B) y transconjugantes (antibiótico A y B). Los transconjugantes son células receptoras que mantienen de manera estable el plásmido conjugativo del donante.

Las células del donante son resistentes a un antibiótico (antibiótico A) y son susceptibles al marcador o marcadores utilizados para seleccionar las células receptoras (antibiótico B). La ubicación genómica del gen de resistencia a antibióticos (es decir, si se encuentra en el cromosoma o en un plásmido de la célula donante) no tiene que conocerse a priori, porque la movilización de marcadores de resistencia a antibióticos al receptor (después de un contacto directo donante-receptor) implica que los marcadores proporcionados por el donante estaban en un plásmido.

Una cepa receptora (conocida por tomar plásmidos conjugativos) necesita tener un marcador seleccionable estable que no esté presente en el donante; Este marcador seleccionable es generalmente resistente a un antibiótico o biocida localizado en el cromosoma. La selección del receptor para ser utilizado en experimentos de apareamiento es crítica, ya que algunas cepas de E. coli varían en su capacidad para tomar plásmidos conjugativos16.

Una vez establecidos estos componentes, cualquier colonia que crezca en medios con ambos antibióticos (A y B) después de un contacto entre la pareja donante-receptor es un transconjugado putativo (Figura 1). Esto supone que los donantes pueden crecer en medios con antibiótico A pero no pueden crecer en medios con antibiótico B, y que los receptores pueden crecer en medios con antibiótico B, pero no pueden crecer con antibiótico A. La transconjugación se puede confirmar mediante dos pruebas diagnósticas. La primera prueba consiste en la detección (mediante la amplificación de genes por reacción en cadena de la polimerasa [PCR] u otros métodos) de genes encontrados en el plásmido conjugativo en colonias transconjugadas. La segunda prueba implica el uso de marcadores de color de colonias diferenciales basados en el metabolismo de la lactosa. El color diferencial de la colonia se revela por el uso de agar MacConkey; La lactosa en el agar puede ser utilizada como fuente de fermentación por microorganismos fermentadores de lactosa (LAC +). Estos microorganismos producen ácidos orgánicos, particularmente ácido láctico, que disminuyen el pH. El rojo neutro es un indicador de pH incluido en el medio que cambia de blanco roto a rojo / rosa brillante a medida que el pH cae por debajo de 6.817. Por lo tanto, las cepas positivas para lactosa de E. coli producen colonias rosadas más grandes en agar MacConkey, mientras que las cepas negativas para lactosa producen colonias de color amarillo pálido y más pequeñas en agar MacConkey.

Diagrama de transferencia de plásmidos conjugativos; donante a receptor a través de la conjugación; resistencia a antibióticos, análisis de PCR.
Figura 1: Diseño experimental utilizado para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en cepas de donantes. En este ejemplo, el donante lleva un plásmido conjugativo con un gen de resistencia a antibióticos que confiere resistencia al antibiótico A, pero son susceptibles al antibiótico B. Por el contrario, el receptor tiene un determinante de resistencia cromosómica que confiere protección contra el antibiótico B, pero es susceptible al antibiótico A. Los transconjugantes son resistentes a ambos antibióticos (A y B), porque tienen el plásmido conjugativo del donante que confiere resistencia al antibiótico A y el cromosoma del receptor que confiere protección contra el antibiótico B. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

La tasa de conjugación para un par donante-receptor (en determinadas condiciones experimentales) puede calcularse dividiendo el número de transconjugantes por el número de donantes o por el número de receptores; La primera tasa indica la fracción de células donantes que exhiben expresión funcional de la maquinaria de conjugación por el donante16,18, mientras que la segunda tasa indica la capacidad del receptor para tomar plásmidos conjugativos 19,20. En este estudio, a menos que se indique lo contrario, la tasa de conjugación representa la fracción de células receptoras que se vuelven transconjugantes (es decir, tasa por receptor).

Aquí, se reportan dos experimentos de apareamiento independientes, que involucran a un receptor de E. coli y dos donantes de E. coli. Además, se utilizaron diferentes antibióticos para seleccionar transconjugantes para uno de los donantes para confirmar que se puede seleccionar un solo plásmido multirresistente con cualquiera de los genes de resistencia a antibióticos encontrados en el plásmido conjugativo.

Las cepas donante y receptora utilizadas en este trabajo han sido secuenciadas completamente para comprender todos los componentes de este sistema experimental; Sin embargo, estos protocolos fueron diseñados para detectar la presencia de plásmidos conjugativos en huéspedes de secuencia desconocida, y también pueden usarse en este contexto experimental; Sin embargo, en este caso, los genes relevantes se secuencian primero.

Las cepas donante y receptora utilizadas en el protocolo son las siguientes:

Donante 1. E. coli SW4955 fue recolectado en un lago en Baton Rouge (LA, EUA). Tiene un plásmido conjugativo de 134.797 pb (p134797) con replicones IncFIC(FII) e IncFIB (AP001918). Este plásmido conjugativo tiene genes que confieren resistencia a cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55), aminoglucósidos (aac(3)-IIa y aadA1), fenicoles (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprima (dfrA14) y sulfonamidas (sul3). Para obtener un mapa completo de p134797, consulte la Figura 2A. E. coli SW4955 es lactosa positiva, produciendo colonias rosadas en agar MacConkey.

Donante 2. E. coli SW7037 fue recolectado en Lake Erie (Ottawa County, OH, EUA). Lleva un plásmido conjugativo de 101.718 pb (p101718) con un replicón IncI1-I(Alfa). Este plásmido conjugativo tiene un gen que confiere resistencia a los betalactámicos (blaCMY-2). Para obtener un mapa completo de p101718, consulte la Figura 2B. E. coli SW7037 también es positivo para lactosa, produciendo colonias rosadas en agar MacConkey.

Mapas circulares del genoma de los plásmidos de E. coli p134797 y p101718, destacando los genes de resistencia.
Figura 2: Mapa genético de los plásmidos conjugativos utilizados en este estudio . (A) Plásmido p134797, el plásmido conjugativo encontrado en la cepa SW4955 de E. coli. (B) Plásmido p101718, el plásmido conjugativo encontrado en la cepa SW7037 de E. coli. Los genes de resistencia a los antibióticos se resaltan en azul, y los genes que pertenecen al aparato conjugativo se resaltan en rojo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Destinatario. E. coli LMB100 se utiliza como receptor. Se trata de una cepa sin plásmidos resistente a la rifampicina (100 mg/L) y a la estreptomicina (100 mg/L). Tener resistencia a dos antibióticos reduce la posibilidad de que surjan mutaciones de resistencia en el donante que interfieran con la interpretación de los resultados. Además, E. coli LMB100 es lactosa negativa, y se puede distinguir de las dos cepas donantes porque produce colonias de color amarillo pálido y pequeñas (a diferencia de las colonias más grandes y rosadas) en agar MacConkey.

Cuando el donante es lactosa negativa, recomendamos el uso de un receptor con lactosa positiva (por ejemplo, E. coli J53). Las cepas LMB100 y J53 están disponibles para otros laboratorios para su uso. Envíe una solicitud al Dr. Gerardo Cortés-Cortés junto con una dirección y un número de FedEx.

El medio sólido necesario para seleccionar y contar donantes, receptores y transconjugantes es el agar MacConkey en placas de Petri de 100 mm de diámetro. Se necesita la adición de los siguientes antibióticos: (i) Media A: carbenicilina (100 mg / L) para contar donantes y garantizar que los receptores no puedan crecer con este antibiótico. (ii) Media B: rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para contar receptores y asegurar que los donantes no puedan crecer en estos dos antibióticos. (iii) Media AB: carbenicilina (100 mg/L) + rifampicina (100 mg/L) + estreptomicina (100 mg/L) para obtener y contar transconjugantes. (iv) Media C: no hay antibióticos para rayar todos los aislamientos estudiados.

Se comparan las tasas de conjugación de plásmidos conjugativos de E. coli SW4955 y E. coli SW7037 a E. coli LMB100. Además, en el caso del plásmido conjugativo p134797 (cepa SW4955), el antibiótico carbenicilina (100 mg/L) se sustituye por gentamicina (2 mg/L), cloranfenicol (25 mg/L), tetraciclina (10 mg/L), trimetoprima (20 mg/L) o sulfametoxazol (100 mg/L) en experimentos posteriores para establecer si el marcador de resistencia a antibióticos utilizado para la selección tiene algún impacto en los resultados.

Protocolo

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1. Método 1: Conjugación

  1. Día 1: Rayar a los donantes y receptores. Rayar por separado de las reservas de glicerol en medios C (agar MacConkey sin antibióticos) e incubar durante la noche a 37 °C.
    NOTA: Este paso es necesario para asegurar que el experimento se realiza con aislados puros y para confirmar el fenotipo de lactosa por el color de las colonias.
  2. Día 2: Etiquete un tubo de cultivo de 14.0 ml para cada donante y receptor. Seleccione una sola colonia de cada donante y receptor, y críelos durante la noche (18 h) en tubos de cultivo separados de 14,0 ml que contienen 2 ml de caldo Mueller Hinton a 37 °C y agitando a 200 rpm.
    NOTA: En las cepas utilizadas, la fase estacionaria se alcanza después de un cultivo nocturno de 18 h.
  3. Día 3: Mida la densidad óptica a 600 nm (OD600) del cultivo nocturno de cada donante y receptor (sin vórtice) utilizando una dilución 1:10 de 900 μL de solución salina y 100 μL del cultivo nocturno.
  4. Ajustar la densidad óptica de cada donante y receptor a 2,0 (OD600 = 2,0) con solución salina esterilizada (NaCl al 0,85% en agua).
    NOTA: Un cultivo nocturno de E. coli con un OD600 = 2.0 tiene 1.6 x 109 UFC/ml.
  5. Etiquete un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml como "tubo de acoplamiento", indicando las cepas donante y receptora. Transfiera 500 μL de la suspensión ajustada (OD600 = 2,0) de cada donante y receptor, y colóquelos en el tubo de acoplamiento (este tubo de acoplamiento tendría 0,8 x 109 UFC/ml de cada donante y receptor). Mezclar suavemente el tubo de acoplamiento por inversión.
  6. Centrifugar el tubo de acoplamiento durante 10 min a 500 x g a temperatura ambiente.
  7. Sin perturbar el pellet, pipetear 800 μL del tubo de conjugación. Debe quedar 200 μL en el tubo de conjugación.
    NOTA: Deseche el sobrenadante en un recipiente de lejía al 10% para inactivar las bacterias en la suspensión.
  8. Incubar el tubo de apareamiento durante 18 h (durante la noche) a 37 °C en una incubadora. El apareamiento ocurre durante el tiempo de incubación.
    NOTA: Este paso debe hacerse sin agitar para no romper los pili conjugativos.
  9. Como control negativo, rayar la cultura de los donantes durante la noche en el medio B y los receptores en el medio A. Incubar las placas durante la noche a 37 °C
  10. Día 4: Agregue 800 μL de solución salina al tubo de acoplamiento y vórtice para resuspender (esto reconstituye la mezcla de apareamiento a 1 ml).
    NOTA: El vórtice rompe las bacterias de apareamiento y homogeneiza el cultivo para cuantificar la UFC/ml.
  11. Preparar diluciones 1:10 (de 1 x 100 a 1 x 10-7) de la mezcla de apareamiento. Placa 100 μL de diluciones 10-5 a 10-7 en medios A y B, y todas las diluciones en medios AB.
    NOTA: Dlución 100 se refiere al tubo limpio.
  12. Deje que las placas se sequen antes de colocarlas boca abajo en la incubadora. Incubar las placas durante 18 h (durante la noche) a 37 °C.
  13. Día 5: Inspeccione los controles negativos para asegurarse de que las rachas de cultivos puros de la noche a la mañana de los donantes no crecieron en los medios B, y la cultura pura de la noche a la mañana de los receptores no creció en los medios A.
  14. Registre el número de colonias y diluciones que se pueden contar:
    1. Contar las colonias en el medio A; Estos son los donantes. Las colonias deben ser rosadas (Figura 3A, B).
    2. Contar las colonias en medios B; Estos son los receptores y transconjugantes. Las colonias deben ser de color amarillo pálido (Figura 3C).
    3. Contar las colonias en medios AB; Estos son los transconjugados. Las colonias deben ser de color amarillo pálido.
      NOTA: Seleccione una placa contable. Una placa contable tiene entre 30 y 300 colonias (más de 300 colonias serían difíciles de contar, y menos de 30 colonias se consideran un tamaño de muestra demasiado pequeño para presentar una representación precisa de la muestra original).
  15. Calcular la frecuencia de conjugación por donante o por receptor
    Frecuencia de conjugación por donante = (UFC/ml del transconjugado [media AB])/ (UFC/ml de donantes [media A]) x 100
    Frecuencia de conjugación por receptor = (UFC/ml del transconjugado [medio AB])/ (UFC/ml de receptores y transconjugantes [medio B]) x 100
    NOTA: La frecuencia de conjugación para este protocolo se calculó como transconjugantes dividido por el número del receptor, multiplicado por 100. De acuerdo con la literatura, la cantidad resultante de conjugación podría denominarse como frecuencia exconjugante, frecuencia de transferencia génica, frecuencia de conjugación, rendimiento recombinante, eficiencia de transferencia de plásmidos, frecuencia de conjugación basada en el recuento bacteriano total, proporción de transconjugantes, fracción de transconjugantes en la población receptora, frecuencia transconjugante, frecuencia de conjugación, el logaritmo de la tasa de conjugación, constante de la tasa de transferencia, tasa de conjugación por par de apareamiento, coeficiente de conjugación, o eficiencia de conjugación20. Este protocolo se refiere al término eficiencia de conjugación.
  16. Almacenar los transconjugantes en existencias de glicerol a -80 °C. Siga los subpasos para preparar las existencias de glicerol.
    1. Seleccione una sola colonia de transconjugantes y cultive durante la noche (18 h) en tubos de cultivo de 5,0 ml que contienen 2 ml de caldo Mueller Hinton suplementado con carbenicilina (100 mg/L), a 37 °C y agitando a 200 rpm.
    2. Etiquetar viales criogénicos, indicando el nombre del transconjugante, de la siguiente manera: Tc + nombre del donante + antibiótico de selección en medio A (como son transconjugantes, se sabe que su fondo es la cepa receptora, que ya es resistente a la estreptomicina y la rifampicina pero que además alberga el plásmido portador de un gen de resistencia a los betalactámicos); por ejemplo, TcU1Carb. Agregue números continuos en caso de que sea necesario almacenar más de un transconjugado del mismo donante (por ejemplo, TcU1Carb1, TcU1Carb2, etc.).
    3. Transfiera 1 ml del cultivo nocturno a 1 ml de glicerol al 50% (v / v; la concentración final de glicerol debe ser del 25%) y mezcle suavemente por inversión. Poner los viales criogénicos en hielo seco durante 15 minutos y almacenar los crioviales a -80 °C para futuros experimentos.
  17. Para la extracción de ADN, rayar los trasnconjugantes de las existencias de glicerol en agar Mueller Hinton suplementado con carbenicilina (100 mg / L) e incubar durante la noche a 37 ° C; A continuación, siga las recomendaciones del paso 2.1.

2. Método 2: Reacción en cadena de la polimerasa (PCR) para amplificar genes de resistencia a antibióticos y replicones plásmidos en transconjugantes de E. coli

NOTA: La reacción en cadena de la polimerasa (PCR) fue desarrollada por el Dr. Kary Mullis en 1983. La PCR depende de cebadores específicos (una pieza corta de ADN complementaria a una secuencia de ADN dada que actúa como un punto en el que puede proceder la replicación, generalmente de 20-40 nucleótidos de longitud e idealmente con un contenido de guanina-citosina de 40% -60%), que se recocen a hebras opuestas de una plantilla de ADN bicatenario desnaturalizada y se extienden a través de una ADN polimerasa termoestable, generando así una plantilla adicional para el siguiente ciclo de reacciones, lo que lleva a la amplificación exponencial de la plantilla original21. En este protocolo, los replicones y genes de resistencia presentes en los plásmidos conjugativos se amplificaron para confirmar la transferencia en células receptoras transconjugadas.

  1. Extracción de ADN
    1. Para detectar la transferencia de genes de resistencia transportados por plásmidos conjugativos, use ADN transconjugado como plantilla. Use la extracción simple de preparación para hervir para lisar las paredes celulares bacterianas.
      NOTA: La extracción simple de preparación para hervir es un enfoque simple para lisar las paredes celulares bacterianas. Esta extracción contiene ADN plásmido mezclado con ADN genómico, pero como los cebadores están diseñados de acuerdo con secuencias de ADN específicas de interés, esta plantilla también es útil para la PCR. Los plásmidos también se pueden purificar específicamente, aunque los rendimientos tienden a disminuir con el aumento del tamaño del plásmido22. Este es un punto de parada conveniente. El ADN puede almacenarse durante varios meses a -20 °C.
  2. PCR
    1. Dado que el experimento tiene un control negativo y otro positivo, es beneficioso configurar una piscina para todas las reacciones en un tubo de 1,5 ml. Etiquete un tubo de 1,5 ml como "piscina" y los tubos de PCR requeridos con el nombre del gen y la muestra (por ejemplo, OXA-U1).
    2. Pipetear los reactivos de PCR en el siguiente orden en un tubo de 1,5 ml: agua estéril, 2x Master Mix, cebadores y polimerasa (excepto el ADN plantilla) (ver Tabla 1). Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces. Manténgase en hielo todo el tiempo.
      NOTA: Use guantes para evitar contaminar la mezcla de reacción o los reactivos. Trate de evitar abrir y mezclar reactivos y manipular muestras en la misma área para evitar la contaminación del reactivo. Coloque los reactivos en el cubo de hielo para suprimir la actividad de la nucleasa y el cebado inespecífico. Déjelos descongelarse completamente antes de establecer una reacción. Mantenga los reactivos en hielo durante todo el experimento. La polimerasa Taq se agrega al final porque es sensible a los cambios de pH; Necesita ser amortiguado para evitar la degradación o el plegamiento incorrecto. La secuencia de los cebadores se recoge en la Tabla 2 -genes de resistencia a antibióticos- y en la Tabla 3-replicones 23,24,25,26,27,28.
    3. Agregue el ADN de la plantilla al tubo correspondiente. Evite introducir burbujas y tapas seguras en los tubos de PCR.
    4. Coloque los tubos de PCR en el termociclador.
    5. Inicie el programa. Consulte la configuración del programa enumerada para cada gen en la Tabla 2 (genes de resistencia) y la Tabla 3 (replicones).
      NOTA: Configure los programas de PCR para que mantengan las muestras a 4 °C después de la ejecución.
      1. Condiciones de PCR para replicones: un ciclo de desnaturalización a 94 °C durante 5 min, seguido de 30 ciclos de desnaturalización a 94 °C durante 1 min, recocido a 60 °C durante 30 s, elongación a 72 °C durante 1 min, y una extensión final de un ciclo a 72 °C durante 5 min.
        NOTA: Estas son las condiciones estandarizadas por Carattoli et al.29.
    6. Cuando finalice el programa, conservar los tubos de PCR a 4 °C.
      NOTA: Este es un punto de parada conveniente. Los productos de PCR se pueden almacenar durante varios meses a -20 °C
    7. Preparar un gel de agarosa al 1% pesando 0,6 g de agarosa en un matraz de 250 ml y añadiendo 60 ml de 1x tampón Tris-acetato-EDTA (TAE) (ajustar los reactivos si se necesita un tamaño de gel diferente). Derretir la agarosa con cuidado y lentamente en un microondas para evitar que la agarosa se derrame sobre el matraz, y dejar que se enfríe a aproximadamente 55 °C (10-15 min).
      1. Preparar todos los reactivos utilizando agua desionizada ultrapura y reactivos de grado analítico:
      2. TAE 50x Tampón (Tris base, ácido acético y EDTA) (1 L): Mezclar 121.1 g de Tris base + 372.24 g de EDTA y agregar 500 mL de agua destilada. Disolver con un agitador magnético. Agregue 57.1 ml de ácido acético y agregue agua destilada a un volumen total de 1,000 ml.
      3. Autoclave a 15 psi, 121 °C durante 15 min, y mantener a temperatura ambiente hasta que esté listo hasta 6 meses.
      4. TAE 1x Tampón (1 L): Combine 20 mL de tampón TAE 50x con 980 mL de agua destilada y mezcle.
    8. Bajo una campana extractora, agregue 6 μL de SYBR Green a la agarosa derretida, mezcle y vierta en la bandeja (y peine), previamente sellada con cinta adhesiva para evitar derrames. Deje que el gel se asiente durante 15-25 minutos hasta que aparezca la turbidez.
      NOTA: Otros colorantes alternativos también están disponibles30,31,32,33.
    9. Retire la cinta adhesiva y coloque el gel en la cámara de electroforesis, agregando suficiente tampón TAE 1x para cubrir el gel.
    10. Mezclar 5 μL de 6x colorante de carga de gel de ADN con 25 μL de cada reacción. Mezclar suavemente pipeteando hacia arriba y hacia abajo al menos 10 veces.
      NOTA: No es necesario cargar todo el producto de PCR en el gel para visualizar el producto esperado (ajustar la cantidad de tinte según corresponda). La muestra de PCR restante podría guardarse y almacenarse a -20 °C durante varios meses.
    11. Cargue la mezcla en pozos (evite introducir burbujas) y baje la tapa de la cámara.
      NOTA: Cargue la primera muestra en el segundo pocillo (reserve la primera a la escalera), comenzando con el control negativo.
    12. Cargue 4 μL de escalera de ADN de 1 kb en el primer pozo.
    13. Ejecute la electroforesis a 120 V, 400 mA y 60 min.
    14. Visualice el gel bajo luz UV (con un iluminador UV) y grabe la imagen.
      NOTA: Si hay un producto de PCR, las bandas de ADN teñidas se pueden detectar utilizando un transiluminador UV estándar, un transiluminador de luz visible o un escáner basado en láser.
ReactivoSolución de stockVolumen añadido a la reacción de 50 μL (1x)FinalEjemplo: volumenEjemplo: volumenEjemplo: volumen añadido a cada tubo Final Vol. 50 μLVolumen añadido al control positivoVolumen añadido al control negativo
Concentraciónañadido a 1xAñadido a 3x (grupo)
Agua estéril-21,5 μL (c.s.p. a 50 μL)-21,5 μL64,5 μL49 μL/tubo49 μL/tubo49 μL/tubo
Mezcla maestra2x25 μL1x25 μL75 μL
Imprimación directa25 μM1 μL0,5 μM1 μL3 μL
Cebador inverso25 μM1 μL0,5 μM1 μL3 μL
ADN de plantillaVariable (100–200 ng/μL)Variable (1 μL)Variable0,5 μL1,5 μL
Polimerasa5 Unidades/μL0,5 μL2.5 Unidades--1 μL (transconjugante)1 μL (donante)1 μL (receptor)
NOTA: q.s. es una abreviatura latina de quantum satis que significa la cantidad que se necesita.

Tabla 1: Reactivos de PCR y pool para tres reacciones (un ejemplo). 

Imprimadores (secuencia listada en la orientación 5' - 3')Programa de PCRTamaño esperado
(bp) Ref.
blaCTX-M grupo 194 oC 7 min(864) 23
CTX-M: GGTTAAAAAATCACTGCGYC94 oC 50 s (35 ciclos)
CTX-M: TTGGTGACGATTTTAGCCGC50 oC 40 s
68 oC 1 min
68 oC 5 min
blaCMY-295 oC 3 min(1855) 24
CMY-2-F: GATTCCTTGGACTCTTCAG95 oC 30 s (30 ciclos)
CMY-2-R: TAAAACCAGGTTCCCAGATAGC53 oC 30 s
72 oC 30 s
72 oC 3 min
aac(3')-II94 oC 5 min(237) 25
aac(3')-II-F: ACTGTGATGGGATACGGTC94 oC 30 s (32 ciclos)
aac(3')-II-R: CTCCGTCAGCGTTTCAGCTA60 oC 45 s
72 oC 2 mín
72 oC 8 min
aadA94 oC 5 min(283) 26
aadA1: GCAGCGCAATGACATTCTTG94 oC 1 min (35 ciclos)
aadA2: ATCCTTCGGCGCGATTTTG60 oC 1 mín
72 oC 1 min
72 oC 8 min
sul-394 oC 5 min(799) 27
sul-3-F: GAGCAAGATTTTTGGAATCG94 oC 1 min (30 ciclos)
sul-3-R: CATCTGCAGCTAACCTAGGGCTTTGGA51 oC 1 mín
72 oC 1 min
72 oC 5 min
tet(A)95 oC 5 min(957) 28
TETA-1: GTAATTCTGAGCACTGTCGC95 oC 30 s (23 ciclos)
TETA-2: CTGCCTGGACAACATTGCTT62 oC 30 s
72 oC 45 s
72 oC 7 mín
DFR Un95 oC 5 min(302) Esta obra
dfrA-F: CATACCCTGGTCCGCGAAAG95 oC 1 min (30 ciclos)
55 oC 1 mín
DFRA-R: CGATGTCGATCGTCGATAAGTG72 oC 1 min
72 oC 7 mín
catA295 oC 5 min
catA2-F: GACCCGGTCTTTACTGTCTTTC95 oC 1 min (25 ciclos)(225) Esta obra
catA2-R: TCCGGTGATATTCAGATTAAAT60 oC 1 mín
72 oC 1 min
72 oC 7 mín

Tabla 2: Cartillas y programas de PCR utilizados para amplificar los genes de resistencia diagnóstica. 

ReplicónImprimación (secuencia listada en la orientación 5' - 3')BlancoPrograma de PCRTamaño esperado (pb)
IncFIBF: TCTGTTTATTCTTTTACTGTCCACrepA94 oC 5 min683
R: CTCCCGTCGCTTCAGGGCATT94 oC 1 min (30 ciclos)
60 oC 30 s
IncFICF: GTGAACTGGCAGATGAGGAAGGrepA272 oC 1 min262
R: TTCTCCTCGTCGCCAAACTAGAT72 oC 5 min
IncI1F: CGAAAGCCGGACGGCAGAARNAI (en inglés)139
R: TCGTCGTTCCGCCAAGTTCGT

Tabla 3: Cartilla y programa de PCR utilizados para clasificar los plásmidos p134797 y p101718 por tipificación de replicón basada en PCR29. 

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dado que los donantes SW4955 y SW7037 han sido secuenciados, se espera que estas dos cepas donantes tengan los fenotipos de resistencia correspondientes al perfil del gen de resistencia identificado en su secuencia genómica. El plásmido p134797 (de SW4955) tiene genes que confieren resistencia a cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55) y resistencia a aminoglucósidos (aac(3)-IIa y aadA1), fenicoles (catA2), tetraciclinas (tet(A)), trimetoprima (dfrA14) y sulfonamidas (sul3); no se encontraron genes de resistencia a antibióticos en el cromosoma SW4955. El plásmido p101718 (de SW7037) solo lleva un gen de resistencia a antibióticos (bla CMY-2), que se espera que confiera resistencia a las cefalosporinas de tercera generación (blaCTX-M-55). Una vez más, no se encontraron genes de resistencia a los antibióticos en el cromosoma SW7037.

Después del apareamiento, se esperaba la detección de la transferencia de los dos plásmidos conjugativos portadores de todos los genes de resistencia mencionados anteriormente. La detección de conjugación positiva implica que los receptores identificados como transconjugantes deben haber adquirido los plásmidos conjugativos. También se esperaba la presencia de los genes de resistencia diagnóstica para los plásmidos conjugativos en los transconjugantes (detectados por PCR).

Para ilustrar los métodos descritos aquí, se probó la capacidad de dos aislados ambientales de E. coli para transferir ADN plásmido por conjugación. En la figura 1 se muestra una representación esquemática de la configuración experimental. Dos donantes (E. coli SW4955 y SW7037) y un receptor (E. coli LMB100) se aparearon de forma independiente. El mapa genético de plásmidos conjugativos encontrados en E. coli SW4955 (p134797) y SW7037 (p101718) se muestra en la Figura 2.

Los plásmidos conjugativos fueron seleccionados con carbenicilina y contraseleccionados mediante rifampicina y estreptomicina, cuyos determinantes de resistencia se encuentran en el cromosoma del receptor. Se utilizó agar MacConkey para distinguir los donantes positivos para lactosa (que producen colonias grandes y rosadas) del receptor y los transconjugantes (que son lactosa negativos y producen colonias más pequeñas de color amarillo pálido) (Figura 3).

Resultados de conjugación bacteriana; cultivos en placa de Petri con aumento de colonias; Estudio de transferencia genética.
Figura 3: Ilustración de los marcadores de color diferenciales para colonias donantes y receptoras en agar MacConkey. Las colonias correspondientes a los donantes son rosadas en agar MacConkey porque son lactosa positiva. Esto distingue a las colonias donantes de las receptoras, que son de color amarillo pálido y más pequeñas (lactosa negativa). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Se detectó la movilización del plásmido conjugativo p134797, correspondiendo cada uno de los cinco antibióticos a las cinco clases diferentes de genes de resistencia encontrados en el plásmido.

Se presenta un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de conjugación (CE) para la cepa SW4955. Del ensayo con la cepa SW4955, se contaron 172 UFC de transconjugantes en la placa de dilución 10-2; el recuento del receptor de la dilución correspondiente (10-2) fue de 10.300.000 UFC/ml (Tabla 4).

El CE se calcula de la siguiente manera:

CE = (174 UFC/ml)/(10.300.000 UFC/ml)

CE= 1,67 x 10-5 transconjugantes/receptor

LMB100Transconjugantes de la cepa SW4955 seleccionada con carbelicilinaEficiencia de conjugación
DiluciónCFU (placa contable)Aprox. UFC/mlCFU (placa contable)
100confluente1.03E+09
10-1confluente1.03E+08
10-2confluente103000001721,67 x 10-5 transconjugantes/receptor
10-3confluente1030000
10-4confluente103000
10-5confluente10300
10-6confluente1030
10-7103103
Los valores utilizados para calcular el CE se resaltan en negrita.

Tabla 4: Un ejemplo de cómo calcular la eficiencia de conjugación (CE) para la cepa SW4955.

Los resultados se muestran en la Tabla 5, expresada como eficiencia de conjugación por receptor. Las cinco eficiencias de conjugación obtenidas utilizando la cepa SW4955 como donante estaban todas dentro del mismo orden de magnitud. Estos resultados indican que la movilización del plásmido conjugativo puede detectarse independientemente de la selección utilizada para la identificación transconjugante.

Utilizando la cepa SW7037 como donante, la eficiencia de conjugación obtenida fue tres órdenes de magnitud menor; Estos resultados permiten comparar las eficiencias de conjugación de diferentes donantes y tipos de plásmidos con los mismos receptores.

Eficiencia de conjugación
ColarCarbenicilina (100 mg/L)Gentamicina (2 mg/L)Cloranfenicol (25 mg/L)Tetraciclina (10 mg/L)Trimetoprima (20 mg/L)
SW49551,67 x 10-55,67 x 10-52,17 x 10-57,62 x 10-51,36 x 10-5
SW70372,14 x 10-6

Tabla 5: Eficiencias de conjugación de las cepas donantes de E. coli SW4955 y SW7037 dependiendo del antibiótico utilizado para la selección.

En los transconjugados, la presencia de replicones y todos los genes de resistencia codificados en dos plásmidos conjugativos probados, y sus correspondientes replicones, se verificó mediante PCR. Las condiciones utilizadas para estas reacciones de PCR diagnósticas se muestran en la Tabla 3.

Los geles de diagnóstico se muestran en la Figura 4. Estos geles confirman la presencia de los replicones esperados en transconjugantes (IncFIC e IncFIB en p1347975, e IncI1 en p101718). También confirman la presencia de los genes de resistencia a antibióticos esperados, a saber, el grupo bla CTX-M-55 (betalactámico), aac (3) -II y aadA (aminoglucósido), catA2 (fenicol), tet (A) (tetraciclina), dfrA14 (trimetoprima) y sul3 (sulfonamida) para p1347975, y blaCMY-2 para p101718 (Figura 4).

Electroforesis en gel de agarosa que muestra patrones de escalera y banda de ADN para el análisis de genes de resistencia a antibióticos.
Figura 4: Geles de electroforesis diagnóstica. Electroforesis en gel de productos de PCR de genes de resistencia a antibióticos y replicones plásmidos encontrados en plásmidos conjugativos p134797 y p101718 en las células donantes (cepas SW4955 y SW7037, respectivamente) y en los correspondientes transconjugantes LMB100. La carbenicilina se utilizó para la selección de plásmidos. Abreviaturas. -: control negativo (se utilizó ADN de la cepa LMB100 como control negativo); D: donante; T: transconjugante. Tamaños de amplicón esperados: blaCTX-M-55: 864 pb; aac(3)-IIa: 237 pb; aadA1: 283 pb; catA2 : 225 pb; tet(A): 957 pb; dfrA14: 302 pb; SUL3: 799 pb; IncFIC(FII): 262 pb; IncFIB: 683 pb; blaCMY-2: 1.855 pb; IncI1-I: 139 pb. El gel tiene un 1% de agarosa. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los plásmidos conjugativos proporcionan acceso a un conjunto comunitario de genes dentro de un entorno ambiental particular a través de la recombinación y la transferencia horizontal de genes34. Así, los plásmidos conjugativos son entidades evolutivas capaces de adquirir y conferir funciones que permiten a las bacterias adaptarse a múltiples condiciones (incluyendo resistencia a antibióticos, resistencia a metales, adquisición de metales, formación de biopelículas y genes patógenos, entre otras) dentro de una escala temporal de horas.

Este trabajo presenta un protocolo para la identificación de plásmidos conjugativos en bacterias. Para que el protocolo funcione, los marcadores utilizados necesitan diferenciar las cepas donante y receptora, como lo demuestran los controles en los medios A y B. También necesitan seleccionar eficazmente las células que llevan el plásmido. La reacción de apareamiento es crítica. En esta reacción, los donantes y receptores necesitan hacer contacto prolongado (a través de pili) para que ocurra la conjugación. Cualquier cosa que pueda interrumpir el contacto de célula a célula, como un tiempo de incubación insuficiente o agitar o agitar el cultivo, disminuye la eficiencia de la conjugación. La elección del receptor también es crítica, ya que algunas cepas receptoras son refractarias a la conjugación35,36. LMB100 se propone como el receptor de elección, ya que es capaz de tomar plásmidos de múltiples tipos de incompatibilidad.

La tasa de conjugación es específica para cada par cromosómico plásmido-donante, receptor y condición ambiental. Se ha encontrado que la conjugación de plásmidos específicos es sensible a un gran número de variables, incluyendo la fase de crecimiento, la densidad celular, la relación donante-receptor, si la conjugación se realiza en medios líquidos o sólidos, carbono, oxígeno, sales biliares, concentraciones de metales, presencia de células de mamíferos, temperatura, pH y tiempo de apareamiento13,14,15 . El estudio de estas interacciones depende de la detección inicial de un plásmido conjugativo a estudiar en profundidad. Por lo tanto, el protocolo descrito aquí también se puede modificar para explorar el impacto de diferentes variables experimentales, aunque esto se produce a costa de restringir el número de donantes seleccionados. También puede identificar plásmidos movilizables en huéspedes que tienen plásmidos auxiliares (es decir, plásmidos que permiten la conjugación al proporcionar funciones que faltan en los plásmidos movilizables en trans6).

Se recomienda conocer la secuencia del plásmido conjugativo (pero no es necesario para detectar la conjugación, como se discutió anteriormente). Cuando los donantes son negativos para lactosa (produciendo colonias amarillas en agar MacConkey), se puede usar un receptor positivo para lactosa (produciendo colonias rosadas en agar MacConkey) para distinguir los transconjugantes verdaderos de las células donantes que pueden crecer en los medios para seleccionar transconjugantes. El protocolo descrito aquí está diseñado para detectar plásmidos conjugativos de miembros ambientales, comensales y patógenos de la familia Enterobacteriaceae; Sin embargo, se puede usar con cualquier especie bacteriana con un donante, receptor, antibiótico (s) y marcadores de color adecuados. La identificación de estos componentes críticos en otras bacterias requiere estudios sistemáticos utilizando múltiples donantes, receptores y marcadores (antibióticos y colores). Este protocolo no ha sido probado en bacterias Gram-positivas.

Varias variantes del método presentado aquí han sido reportadas en la literatura, recientemente revisada20. El resultado cualitativo también puede ser referido de diferentes maneras (por ejemplo, frecuencia exconjugada y frecuencia de transferencia génica), y las unidades adimensionales pueden ser utilizadas para informar la eficiencia de la conjugación (mL/UFC x h)20.

El protocolo descrito aquí resuelve varias limitaciones previamente no abordadas por los métodos existentes16,18,19,20. En primer lugar, se ha identificado un destinatario adecuado. En segundo lugar, el uso de dos antibióticos (rifampicina y estreptomicina) para seleccionar transconjugantes verdaderos minimiza la posibilidad de que los donantes desarrollen resistencia a uno de los antibióticos utilizados para seleccionar transconjugantes a través de mutagénesis espontánea. Los transconjugantes falsos también pueden ser el resultado de la protección del espectador por hidrólisis del antibiótico utilizado para seleccionar transconjugantes por enzimas (por ejemplo, betalactamasas) producidas en grandes cantidades por el donante. En tercer lugar, se incluyen varios controles experimentales para asegurar que el producto del apareamiento sea un verdadero transconjugado (es decir, una célula receptora que haya incorporado de manera estable el plásmido conjugativo del donante). Aquí, presentamos dos métodos independientes para probar la autenticidad de los transconjugantes, a saber, un marcador colorimétrico en agar MacConkey y la detección por PCR de los replicones y genes de resistencia a antibióticos del plásmido conjugativo en el receptor. Además, el protocolo descrito aquí está diseñado para aislar y caracterizar plásmidos conjugativos de miembros ambientales, comensales y patógenos de la familia Enterobacteriaceae (Escherichia, Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Salmonella, Shigella y otras especies).

Para comprender la mecánica de la conjugación, las observaciones experimentales se han modelado utilizando simulaciones por computadora. Estos modelos predictivos estiman la frecuencia de transferencia de plásmidos para densidades de crecimiento dadas de donantes, receptores y transconjugantes. Un modelo conocido como el modelo de punto final encontró umbrales por encima de los cuales la tasa de transferencia de plásmidos en cultivo líquido, y concluyó que la tasa de transferencia no se ve afectada por la densidad celular, la relación donante: receptor y el tiempo de apareamiento19. La hibridación fluorescente in situ (FISH) se ha utilizado como un método alternativo de detección de plásmidos transconjugados. FISH permite la visualización de plásmidos mediante microscopía de fluorescencia a través de la hibridación de una sonda de ADN y un ADN objetivo. Así, FISH permite la detección visual de flujos de plásmidos a través de diferentes poblaciones celulares37, aunque no tiene el mismo nivel de sensibilidad que el método presentado aquí si los transconjugantes son detectados por cribado visual en lugar de selección.

Existe una enorme necesidad de comprender la biología de los plásmidos conjugativos que dispersan genes de resistencia a antibióticos a través de diferentes componentes del ecosistema (clínica, agricultura, aguas residuales, vida silvestre, animales domésticos, suelos, ríos y lagos). En resumen, las condiciones experimentales simplificadas presentadas en los protocolos aquí descritos facilitan la selección de donantes a escala, y por lo tanto representan una herramienta clave para el estudio de la transferencia horizontal de genes originados en plásmidos conjugativos de una variedad de fuentes. Se pueden utilizar para investigar la prevalencia de genes de resistencia a antibióticos u otros genes clínicamente relevantes en plásmidos conjugativos de múltiples fuentes y bacterias. También se pueden adaptar para el estudio de la conjugación in vivo (por ejemplo, en el intestino de los vertebrados) y para estudiar las condiciones que modulan la eficiencia de la conjugación. Todos estos estudios contribuirán en gran medida a comprender cómo la movilización de plásmidos conjugativos resistentes a múltiples fármacos contribuye a la propagación de la resistencia a múltiples fármacos.

Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

LM-B, IMG, AT e IS fueron apoyados por la subvención GM055246 de los NIH otorgada a LM-B. GC-C recibió la beca postdoctoral UC MEXUS-CONACYT por dos años consecutivos: AY 2017-18 y 2018-19. Agradecemos enormemente a los estudiantes Sage Chavez y Pepper St. Clair del programa de mentores Academic Inspiration Network (GAIN) patrocinado por Genentech-Foundation por su apoyo técnico en experimentos.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Gradillas de tubos de 1,5 mLThermo Fisher Scientific22-313630Se puede sustituir por otra marca
Viales criogénicos de 2,0 mLCorning430659Se puede sustituir por
tubos cónicos de 14 mLde149597Se puede sustituir por
gradillas de tubos de 14 mLThermo Fisher Scientific8850Se puede sustituir por otra marca
Escalera de ADN de 1 kbNew England BiolabsN0552G 
Matraces estériles de 250 mL PYREX5320Se puede sustituir por otro marcador permanente de la marca
Ácido acéticoFisher ScientificA38SI-212Se puede sustituir por otra marca
Agarosa (grado de biología molecular, multipropósito)Fisher ScientificBP160-500Se puede sustituir por otra marca
CarbenicillinaGOLD BIOTECHNOLOGYC-103-50Se puede sustituir por otra marca
Asas de inoculación desechables: 1 y micro; LFisherbrand22-363-595Se puede reemplazar por otra marca
Tinte de carga de gel de ADN 6x  New England BiolabsB7024SSe puede sustituir por otra marca
EDTAFisher ScientificBP119-500Se puede sustituir por otra marca
Báscula electrónica digitalDenver InstrumentAPX-2001Se puede sustituir por
tubos cónicos Eppendorf de otra marca: 1,5 mLEppendorf14-282-302Se puede sustituir por otra marca
Equipo para electroforesis en gel de agarosaFisher ScientificFP300Se puede reemplazar por otra marca
Marcadores resistentes al etanolSharpie37001; 37002; 37003Se puede reemplazar por
otros sistemas de documentación de gel de marca (UVP GelSolo)AnalytakjenaSP-1108; 849-97-0936-01; 95-0612-01Se puede reemplazar por otra marca
GuantesX-GEN44-100MCualquier marca de guantes de nitrilo funciona
CubiteraThermo Fisher Scientific432128Se puede sustituir por otra marca
de agar MacConkey BD DIFCO212123
Mezcla Maestra BioLabsM0496S Se puede sustituir por otra marca
MetanolFisher ScientificA452-4Puede ser reemplazado por otra marca
Tubos de microcentrífuga: 2.0 mLFisherbrand05-408-138Puede ser reemplazado por otra marca
Mueller Hinton agarBD DIFCODF0479-17-3
Mueller Caldo HintonBD DIFCO275730
NucleoSpin Plasmidio, Mini kit para ADNplasmídicoTakara Bio USA, Inc., MACHEREY-NAGEL740588. 250
Bastidores de tubos PCRAXYGEN   R96PCRFSPSe puede sustituir por
tubos de PCR de otra marca (0,2 mL)AXYGEN PCR-02-CPuede ser sustituida por otra marca
RifampicinaFisher Scientific50-164-7517
Juego de micropipetas que dispensan entre 1 - 10 μ L (P10), 2– 20 μ L (P20), 20– 200 μ L (P200) y 200– 1000 μ L (P1000)RAININ17008648; 17008650; 17008652; 17008653Las micropipetas deben calibrarse; se pueden reemplazar por otra marca
Cloruro de sodioFisher ScientificS671-3Se puede reemplazar por otra marca
EspectrofotómetroThermo Scientific335905PSe puede reemplazar por otra marca
Puntas esterilizadas para 10 μ L, 200 μ L y 1000 μ L Eclipse1011-260-000-9; 1018-260-000; 1019-260-000-9Puede ser reemplazado por otra marca
EstreptomicinaFisher ScientificBP910-50
SYBR Tinción de gel de ADN seguro Thermo Fisher ScientificS33102
Taq ADN polimerasaBioLabsM0273S
Termociclador C1000 Touch Bio-Rad1851196Puede ser reemplazado por otra marca
Tris Fisher ScientificBP153-500Puede ser reemplazado por otra marca
otra marca FALCON de otra marca

Referencias

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