Las técnicas mínimamente invasivas y un dispositivo de laboratorio simple mejoran la reproducibilidad del modelo de lesión de la médula espinal al reducir el daño operatorio a los animales de experimentación y permitir el mantenimiento de la morfología anatómica. El método vale la pena porque los resultados confiables y el procedimiento reproducible facilitan las investigaciones de los mecanismos de reparación de enfermedades.
Artículo de método
Establecimiento de un modelo de lesión de la médula espinal por contusión en ratones basado en una técnica mínimamente invasiva
En este artículo
Resumen
Resumen
El uso de métodos mínimamente invasivos para modelar la lesión de la médula espinal (LME) puede minimizar las diferencias de comportamiento e histológicas entre los animales de experimentación, mejorando así la reproducibilidad de los experimentos.
Estos métodos necesitan dos requisitos para cumplirse: claridad de la vía anatómica quirúrgica y simplicidad y conveniencia del dispositivo de laboratorio. De manera crucial para el operador, una vía anatómica clara proporciona una exposición mínimamente invasiva, lo que evita daños adicionales al animal experimental durante los procedimientos quirúrgicos y permite al animal mantener una morfología anatómica consistente y estable durante el experimento.
En este estudio, se investiga el uso de una novedosa plataforma integrada llamada plataforma coaxial SCI para lesiones de la médula espinal en animales pequeños para exponer la médula espinal a nivel T9 de una manera mínimamente invasiva y estabilizar e inmovilizar la vértebra de ratones utilizando un estabilizador vertebral y, finalmente, se utiliza un impactador de gravedad coaxial para contusar la médula espinal de ratones para acercarse a diferentes grados de lesión de la médula espinal T9. Finalmente, los resultados histológicos se proporcionan como referencia para los lectores.
Introducción
La lesión traumática de la médula espinal (LME) predispone fácilmente al individuo a consecuencias graves1; Sin embargo, actualmente no existe un tratamiento eficaz 1,2. Los modelos de contusión animal son uno de los principales métodos para estudiar la LME 3,4.
De 2004 a 20144, las ratas se utilizaron como organismos modelo en 289 de 407 estudios (71%) y ratones en 69 (16,9%). De hecho, la proporción de experimentos con ratones ha aumentado gradualmente a lo largo de los años debido a sus ventajas sobre otros modelos, especialmente el gran potencial para los estudios de regulación génica 3,4,5. Por lo tanto, se requieren herramientas más compatibles para realizar más estudios utilizando el ratón como modelo debido a la gran importancia otorgada a la consistencia del modelo6. Los dispositivos comunes reportados en estudios anteriores se basan básicamente en el principio de impacto de la médula espinal de Allen, por ejemplo, el impactador básico de caída de peso7,8, el impactador 1,9 de la Universidad de Nueva York (NYU) / Multicenter Animal Spinal Cord Injury Studies (MASCIS) y elimpactador Infinite Horizon (IH)10,11 . El impactador de pérdida de peso y el impactador NYU / MASCIS comparten el mismo principio de apuntar a la médula espinal objetivo y dejar caer un peso fijo desde diferentes alturas para hacer diferentes gravedades de lesión. El impactador IH crea la lesión de la médula espinal de acuerdo con diferentes fuerzas.
Para facilitar el uso del modelo de ratón en estudios de LME y para establecer las bases para métodos de tratamiento efectivos, se desarrolla una plataforma integrada de lesión por impacto de la médula espinal en ratones, llamada plataforma coaxial de lesión de la médula espinal (SCICP). La plataforma consta de cuatro componentes principales: (1) una mesa de operaciones para animales diseñada para una posición adecuada para ratones operados, que es muy compacta y proporciona comodidad sin restricción de posición; (2) un micro-retractor en ambos lados para sostener los músculos paravertebrales durante la operación; (3) un estabilizador vertebral para sostener la vértebra antes del procedimiento de LME (dos estabilizadores vertebrales están disponibles para operar en animales más grandes como ratas); (4) un manguito, una punta de impactador, pesas y un pasador de tracción. Las tres partes deben ensamblarse en un brazo extraíble X-Y-Z. Para una orientación precisa, se coloca una punta de impacto en la superficie de la médula espinal, y el brazo X-Y-Z se desciende suavemente a la altura esperada con la ayuda de la marca entre la punta del impactador y el manguito. La punta del impactador está hecha de una aleación de aluminio de 0,12 g para evitar daños en la médula espinal atribuidos a la compresión de gran peso antes del procedimiento. El pasador de tracción es para sostener los pesos en la parte superior de la manga para preparar la caída de peso (Figura 1).
En estudios anteriores, la división de la fuerza de impacto se definió de acuerdo con los datos de fuerza de impacto del dispositivo IH, que son 30 Kdyn, 50 Kdyn y 70 Kdyn, respectivamente 6,10. Durante el proceso de investigación, se demostró que los grados seriados de los modelos de LME se establecieron con base en SCICP, que se pueden utilizar en diversos estudios. Por lo tanto, antes de comenzar oficialmente el experimento, las fuerzas de impacto generadas por varios pesos de diferentes masas se probaron utilizando un dispositivo de prueba de presión máxima. Como resultado, se seleccionaron tres modelos de ratón SCI representativos estandarizados como tres grados diferentes de lesión, incluidos los grupos leves, moderados y severos graduados, respectivamente 6,10, y los pesos se liberaron a la misma altura, con un peso de 1,3 g para daño leve, 2,0 g para moderado y 2,7 g para daño severo.
Como otro medio para garantizar la operatividad y la precisión, se informa de un enfoque operativo novedoso y mínimamente invasivo. A través de la investigación de la anatomía de ratones normales, se encuentra un nuevo método para localizar el espacio interespinoso de T12-T13. El método de localización de vértebras en los pasos de operación es fácil de dominar y preciso, lo que garantiza una localización precisa para operaciones mínimamente invasivas.
Con suerte, esta técnica de lesión por contusión puede ayudar a la investigación y comprensión de la lesión de la médula espinal, incluida la comprensión fisiopatológica, la evaluación del manejo, etc.
Protocolo
NOTA: Todos los experimentos fueron aprobados por el Comité de Ética y Bienestar de Animales de Laboratorio de la Facultad de Medicina Cheeloo de la Universidad de Shandong (número de aprobación: 21L60) y se realizaron de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por los Institutos Nacionales de Salud (NIH Publications No. 85-23, revisada en 1996).
1. Mecanismo de la lesión de la médula espinal plataforma coaxial y pruebas mecánicas
- Ensamble la plataforma con una mesa de operaciones quirúrgica, un estabilizador vertebral y una punta de impactador (Figura 1).
NOTA: Mantenga limpias las ranuras de caída de peso y escape, que evitan que el peso se encuentre con corrientes de aire, porque cualquier suciedad en la caída de peso o en el manguito podría afectar la precisión de la plataforma. - Coloque la punta, que permite la localización precisa de la médula espinal, en la manga.
- Seleccione las masas adecuadas de las caídas de peso para el experimento, que son 1.3 g, 2.0 g y 2.7 g para los grupos leve, moderado y severo, respectivamente.
- Enchufe el pasador de tracción en los orificios de la caída de peso.
- Ensamble la caída de peso en la parte superior del manguito con el pasador de tracción instalado en la ranura del brazo X-Y-Z de modo que, una vez que se complete la localización, el peso se libere para golpear la punta del impactador, contencionando consecuentemente la médula espinal, y se observen cambios en la médula espinal bajo el microscopio.
- Ajuste el brazo extraíble X-Y-Z de precisión de 0,1 mm para mayor comodidad del operador y proporcionar un espacio de trabajo adecuado (Figura 1D, E).
NOTA: Para confirmar la consistencia de los resultados del estudio, antes de que comience el experimento, mida la fuerza generada cuando el peso se deja caer dentro del manguito utilizando un dispositivo de detección de presión máxima. No es necesario repetir la confirmación para estudios futuros. - Encienda el dispositivo, coloque el receptor de presión de metal debajo de la punta, ponga a cero el adaptador, suelte el pasador de tracción y registre la fuerza de impacto real.
2. Localización y laminectomía de la9ª vértebra torácica (T9)
NOTA: Los ratones hembra C57BL / 6J de 9-10 semanas de edad fueron comprados a Jinan Pengyue Experimental Animal Company (Jinan, China).
- Autoclave: un conjunto de instrumentos quirúrgicos para el experimento y esterilizar la mesa de operaciones con alcohol al 75% antes de la cirugía.
- Inyecte buprenorfina para analgesia (0.05-2.0 mg / kg, SQ) 30 minutos antes de la anestesia para operaciones de lesión. Luego, anestesiar al ratón con isoflurano (inducción: ~ 3% -5%, mantenimiento: ~ 1.5% -2%). Compruebe si el animal está completamente anestesiado por los reflejos del pellizco de la cola o del dedo del pie. Una vez que la anestesia esté en efecto, coloque el ratón en una posición prona en una parte designada de la mesa de operaciones y cubra la córnea con ungüento oftálmico (aplique ungüento oftálmico a las córneas para proteger los ojos de la sequedad durante la cirugía).
- Afeite el cabello desde la caudal hasta el rostral con una afeitadora eléctrica sobre la columna toracolumbar. Esterilizar la piel varias veces con movimientos circulares con yodóforo durante 30 s y seguido de alcohol al 75%. Aplique un paño quirúrgico estéril y haga una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 cm sobre la piel de aproximadamente T6 a T13 con un bisturí y una cuchilla.
NOTA: Palpar a lo largo del margen costal hasta la línea media, donde se encuentra el espacio interespinoso T12-T13. Haga una incisión de 1,5 cm en el rostral, y la incisión está aproximadamente al ras con vértebras T6-T13.
- Afeite el cabello desde la caudal hasta el rostral con una afeitadora eléctrica sobre la columna toracolumbar. Esterilizar la piel varias veces con movimientos circulares con yodóforo durante 30 s y seguido de alcohol al 75%. Aplique un paño quirúrgico estéril y haga una incisión longitudinal de aproximadamente 1,5 cm sobre la piel de aproximadamente T6 a T13 con un bisturí y una cuchilla.
- Explore la costilla 13 en un lado de la porción ósea bajo el microscopio operativo. Explore el proceso espinoso en la línea media tocando ligeramente el área del ángulo costovertebral y luego hacia el rostral para localizar el espacio interespinoso del T12-T13. Explore el espacio interespinoso de la T9-T10 desde el espacio de la T12-T13 hasta el lado rostral. (Figura 2A, 3A)
- Diseccionar el músculo paraespinal a lo largo de la apófisis espinosa de la T9 hasta las articulaciones facetarias anterior y posterior de ambos lados con microtijeras (Figura 3B). Retraiga los músculos paraespinales con micro-retractores y limpie el tejido blando en la lámina y en el espacio interespinoso de la T8-T9 y T9-T10 con micro tijeras.
- Realice la laminectomía T9, sujete el proceso espinoso de T9 con pinzas de microcirugía, levántelo ligeramente, inserte las micro tijeras paralelamente a lo largo del lado dorsolateral derecho de la lámina, evitando daños en la médula espinal, y corte la lámina con micro tijeras. Repita en el lado izquierdo y la médula espinal puede quedar expuesta (Figura 2B, 3C).
- Antes de fijar la vértebra, afloje el brazo universal y sujete lentamente las articulaciones facetarias 9 a 10 a ambos lados de la vértebra con las pinzas de micromosquito del estabilizador vertebral. Apriete los tornillos de las pinzas de micromosquito y la vértebra se estabilizará. Ajuste la médula espinal al plano horizontal, apriete el brazo universal y la vértebra se fija (Figura 3D).
3. Lesión por contusión T9
- Una vez que la médula espinal de nivel T9 esté expuesta y la vértebra esté fija, apunte a la médula espinal por la punta dentro de la manga debajo del microscopio operativo (Figura 3E).
- Compruebe si la superficie de la punta es paralela a la médula espinal desde los aspectos posterior y lateral de la médula espinal, ya que es fácil observar la relación entre la médula espinal y la punta bajo el microscopio, y que la mesa de operaciones se puede girar fácilmente.
- Compruebe si la superficie de la punta es paralela a los bordes bilaterales de la lámina preservada antes de que la punta esté en contacto con la médula espinal después de la laminectomía, ya que es un plano de referencia natural paralelo a la médula espinal.
- Después de localizar el espacio interespinoso del T12-T13, baje el manguito hasta que el extremo del impactador sea consistente con la marca en la ventana de observación y se alcance la altura especificada de 22 mm. Saque el pasador de tracción para liberar el peso (1,3 g, 2,0 g o 2,7 g según el grupo, con cada grupo incluyendo 3 ratones y cada grupo con un ratón para cada punto de tiempo).
NOTA: La médula espinal debe ser paralela al suelo y perpendicular a la punta; Mueva la mesa de operaciones para garantizar el campo visual microscópico, ya que la mesa es muy compacta. - Retire el impactador cuando se realice la contusión y observe el grado de LME bajo el microscopio de operación. En el grupo leve, se puede observar una alteración del color rojo claro, mientras que en el grupo moderado, el sitio de la lesión exhibe rojo oscuro en 3-4 s y, posiblemente, se puede observar eminencia. En el grupo severo, las manifestaciones de color rojo oscuro pueden aparecer inmediatamente, y se manifiesta una eminencia obvia en la duramadre, pero la duramadre todavía está en una forma consistente (Figura 3F).
- Sutura la fascia superficial y la piel con suturas (sutura no absorbible de polipropileno, tamaño: 6-0).
- Después de completar la sutura, esterilice el área quirúrgica, coloque al ratón en una almohadilla con temperatura controlada hasta que se restaure la plena conciencia y luego coloque al ratón en las jaulas del ratón.
4. Cuidado de los animales
- Coloque al animal en la almohadilla térmica para su recuperación y observe el movimiento de ambas extremidades posteriores.
NOTA: Los animales que se han sometido a cirugía no deben ser devueltos a la compañía de otros animales hasta que estén completamente recuperados. - Ponga una dieta alta en agua en el piso de la jaula para que los animales puedan alcanzar fácilmente la comida. Alternativamente, use una jaula con una mesa de alimentación más baja.
- Vacíe las vejigas de los ratones dos veces al día después de la operación porque es difícil para los grupos de lesiones moderadas y graves recuperar la función de la vejiga. Inyecte buprenorfina para analgesia (0.05-2.0 mg/kg, SQ) 8-12 h/día durante 3 días.
5. Perfusión transcárdica, tinción e inmunotinción
- En los días 1, 28 y 56 después de la lesión, sacrifique un ratón de cada grupo, respectivamente, por perfusión.
- Perfundir los ratones con 60 ml de solución salina tamponada con fosfato (PBS) y 20 ml de paraformaldehído al 4% después de la anestesia excesiva (4% -6% de isoflurano).
- Recoja la columna vertebral con micro tijeras, extendiéndose rostralmente y caudalmente 1 cm, respectivamente, desde el centro de la lesión.
- Resecar el exceso de músculo, reservar los segmentos intactos de la columna vertebral con costillas parciales para que los instrumentos se mantengan en el paso 5.1.4 y remojarlo en paraformaldehído al 4% durante 24 h.
- Sujetar las costillas con pinzas hemostáticas para la fijación y definir el centro de la lesión bajo el microscopio de acuerdo con la lámina resecada y la alteración del color en el centro de la lesión de la médula espinal.
- Resecar todas las láminas y procesos articulares con microtijeras desde el caudal.
- Cortar las raíces nerviosas con micro tijeras y sacar la médula espinal.
- Recoger 0,5 cm de la médula espinal extendiéndose caudal y rostralmente, respectivamente, desde el centro de la lesión con micro tijeras.
- Poner la médula espinal en sacarosa al 30% a 4 °C durante 48 h.
- Cortar los tejidos en secciones de 6 μm de espesor después de la congelación de acuerdo con el tipo de examen histológico.
- Realizar tinción de hematoxilina y eosina (H&E).
- Vuelva a calentar las secciones a temperatura ambiente y remoje las secciones de 6 μm de espesor en formaldehído al 4% durante aproximadamente 15 minutos, seguido de remojo en 1x PBS durante 1 minuto cuatro veces para eliminar la OCT residual.
- Manchar las secciones con hematoxilina durante 90 s y enjuagar con agua de doble destilación.
- Luego, lave las secciones con agua corriente durante 3 minutos.
- Manchar con eosina durante 4 min y remojar en alcohol al 95% durante 30 s dos veces para enjuagar el exceso de eosina.
- Finalmente, deshidratar con alcohol degradado (95% alcohol y 50% alcohol una vez, sucesivamente) durante 30 s y remojar en xileno para mayor transparencia durante 2 min. Luego, selle las muestras con gel de resina (sección del plano coronal: Figura 4; sección del plano sagital: Figura 5).
- Realizar tinción inmunofluorescente.
- Vuelva a calentar las secciones a temperatura ambiente y remoje las secciones de 6 μm de espesor en formaldehído al 4% durante aproximadamente 2 min.
- Lave las secciones en TBST durante 5 minutos durante tres veces.
- Incubar las secciones con solución bloqueante (suero normal de cabra al 10% en PBS) y bloquear durante 1 h para bloquear la unión no específica de inmunoglobulina.
- Incubar las secciones de la médula espinal durante la noche a 4 °C con proteína ácida fibrilar anti-glía de ratón (GFAP, un marcador de astrocitos reactivos), anticuerpo policlonal (1:600) y anticuerpo anti-NF200 de conejo (1:2000), un marcador de neurofilamento en 0,4 ml de solución de bloqueo.
- Enjuague las secciones con PBS y agregue 0,4 ml de solución de bloqueo con anticuerpos secundarios IgG conjugada con Alexa 594 (1:1,000) y Alexa 488 conjugada IgG (1:1.000) de cabra durante 1 h a temperatura ambiente.
- Tome imágenes con un microscopio fluorescente a 10x mediante barrido panorámico automático a longitudes de onda de 594 nm y 488 nm, respectivamente (Figura 6).
- Encienda el microscopio de fluorescencia, coloque el portaobjetos en la platina del microscopio, cambie al canal de fluorescencia, use la tecla de posicionamiento para colocar de tres a cuatro puntos en el tejido y enfoque para completar el disparo. Después de terminar de disparar, guarde las imágenes de diferentes canales en el formato deseado y luego guarde la imagen combinada.
Resultados
Para probar la precisión del dispositivo, se midió la fuerza que tres masas diferentes de pesos hicieron desde la misma altura utilizando un dispositivo de prueba de presión máxima. Se realizaron veinticuatro pruebas con diferentes grupos de pesos, resultando en (media ± DE) 0,323 N ± 0,02 N para pesos de 1,3 g, 0,543 N ± 0,15 N para pesos de 2,0 g y 0,723 N ± 0,26 N para pesos de 2,7 g (Figura 7). Estudios previos adoptaron dyne (dyn) o Kilodyne (Kdyn) como unidades para medir las intensidades de contusión. Para una mejor comparación con estudios previos, se enumeran las conversiones entre Newtons (N) y dina/Kilodina (1 N = 1 kg × 1 m/s 2 = 1 × 10 3 g × 1 × 100 cm/s2 = 1 × 105 dina; 0,323 N = 32,3 Kdyn; 0,543 N = 54,3 Kdyn; 0,723 N = 72,3 Kdyn).
La Tabla 1 y la Figura 4 muestran datos de las lesiones de los grupos leve, moderado y severo en secciones coronales. A juzgar por la Figura 4, en el día 28 después de la lesión, la continuidad de los límites distinguibles de la materia gris y blanca en los grupos leve, moderado y severo disminuyó sucesivamente, con el área de tejido cicatricial creciendo y una proporción creciente en la sección transversal del centro de la lesión. Hubo diferencias morfológicas obvias en todos los grupos experimentales en comparación con el grupo normal. Esto demostró la racionalidad de la división de los grados de lesión en los grupos experimentales.
La Tabla 2 y la Figura 5 describen la lesión de la médula espinal en el 1er y 56º día después de la lesión en las secciones sagitales. Se puede ver que el área de la lesión aumentó gradualmente significativamente de los grupos leves a severos en el 1er día después de la lesión. Mientras tanto, la continuidad de la sustancia blanca en ambos lados de la médula espinal fue mejor en el grupo leve, con pequeñas vacuolas redondas observables, que son las características del edema intersticial. En el grupo moderado, la sustancia blanca mostró poca continuidad, y la estructura de la sustancia blanca ventral no fue ordenada. En el grupo severo, la sustancia blanca ventral exhibió una interrupción más severa, y apareció una gran área de la cavidad en el centro de la lesión. Además, el tejido circundante mostró un llenado obvio de los glóbulos rojos, y los glóbulos rojos cerca del canal central se reunieron en tiras. En el día 56 después de la lesión, se observó formación de cicatrices en el centro de lesiones de los tres grupos, cuya área aumentó de acuerdo con la gravedad de la lesión.
La integridad del neurofilamento de la médula espinal en el día 56 después de la lesión también se puede derivar del análisis de los resultados de la tinción de inmunofluorescencia (Figura 6). La figura también muestra que los astrocitos formadores de cicatrices superpuestos eran visibles en el centro de los tres grupos de lesiones, con la longitud del área de la lesión aumentando con la gravedad de la lesión, mientras que el diámetro de la cicatriz disminuyó. Esto sugiere la presencia de contractura cicatricial, que puede conducir a una disminución en el diámetro de la médula espinal.
Figura 1: Una exposición completa y parcial de la plataforma coaxial de la lesión de la médula espinal. (A) El brazo X-Y-Z y la mesa de operaciones se pueden separar, lo que deja espacio adecuado para el procedimiento de operación durante el cual la médula espinal de un animal pequeño está expuesta. La mesa de operaciones se puede mover libremente durante la operación, lo que reduce la posible dificultad operativa atribuida a las limitaciones de posición. El cuerpo del estabilizador vertebral tiene un brazo universal de tres articulaciones para la asistencia de dirección, lo que aumenta su flexibilidad. (B) Coloque la punta del impactador en el manguito y ensamble este último en el brazo X-Y-Z. Coloque la punta del pasador de tracción en los orificios del peso para evitar que el peso caiga y coloque el peso en la manga. Con las piezas ensambladas, ubique el área de lesión objetivo bajo el microscopio. Luego, baje el brazo X-Y-Z hasta que el extremo de la punta del impactador sea consistente con el nivel inferior de la ventana de observación, lo que indica que se ha alcanzado una altura de contusión unificada (la altura entre el peso y la punta del impactador es de 22 mm cuando comienza la caída). Tire del pasador de tracción y el impacto estará hecho. (C) Después de que el área de la lesión esté expuesta, use los clips para sujetar y fijar la columna vertebral del ratón y el perno de apriete para estabilizar el estabilizador vertebral. (D) Funciones recomendadas para ranuras en la mesa de operaciones. Se supone que el animal experimental debe colocarse en el surco medio, con la cabeza hacia la parte torácica anterior en la pendiente. El brazo X-Y-Z está separado de la mesa de operaciones. (E) Una exhibición del SCICP ensamblado. Las flechas indican las piezas. Con la punta apuntando al área de contusión objetivo, para iniciar la contusión, saque el pasador de tracción y el peso caerá sobre la punta del impactador para conusar la médula espinal. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Un gráfico de imágenes del método de localización de vértebras costovertebrales T13. (A) La 13ª costilla y T13 son estructuras anatómicas relativamente constantes. El ángulo costovertebral T13 se puede detectar fácilmente bajo el microscopio, desde el cual el operador puede sondear hacia el proceso espinoso y encontrar el espacio interespinoso T12-T13. Luego, sondee hacia el lado rostral sucesivamente para encontrar la vértebra de la lesión objetivo (por ejemplo, T9). (B) Una 9ª laminectomía torácica mínimamente invasiva puede preservar la lámina adecuada y las articulaciones facetarias entre los cuerpos vertebrales adyacentes. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Exposición y contusión de la médula espinal a nivel de T9 en ratones . (A) Sondear el ángulo costovertebral T13. (B) Con el músculo paraespinal retraído por micro-retractores para hacer espacio adecuado para la operación, exponga el T9. (C) Realizar laminectomía T9 con micro tijeras. (D) Estabilizar la vértebra con los clips del estabilizador vertebral. (E) Apunte al área de contusión objetivo con la punta del impactador. (F) Se observa edema y congestión en el área de la lesión después de la contusión. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Secciones representativas en el día 28 después de diferentes grados de LME en ratones (secciones coronales). (A) Médula espinal torácica normal del ratón. Barra de escala = 500 μm. (B) Para el grupo leve, se puede observar una lesión leve en la cara dorsal de la médula espinal, mientras que la morfología de la sustancia blanca y gris preservadas se conserva sustancialmente. (C) Para el grupo moderado, se observa tejido cicatricial obvio en la médula espinal (indicado por el asterisco rojo). Las características diferenciadoras entre la materia blanca y la materia gris apenas se pueden distinguir. (D) Comparativamente, la médula espinal del grupo severo casi ha perdido su morfología original y casi ha sido reemplazada por tejido cicatricial. La línea discontinua verde indica el área de daño, y la línea discontinua negra indica el límite de la materia gris observable. A medida que aumentaba la gravedad de la lesión, apareció una lesión más grande y una estructura menos preservada en la médula espinal del ratón, con el borde de la materia gris apenas distinguible. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 5: Secciones representativas en los días 1 y 56 después de la lesión de la médula espinal de ratones (secciones sagitales). (A) Médula espinal torácica normal del ratón. (B) B1-B3 representan, respectivamente, la médula espinal en el primer día después de la lesión en los grupos leve, moderado y grave. Se puede ver que, a medida que aumentaba el daño, un área más grande se interrumpía o licuaba en el centro de la lesión. La continuidad de la sustancia blanca en la médula espinal ventral difirió debido a diferentes intensidades de lesión. B1 muestra que la sustancia blanca en la médula espinal ventral tiene una mejor continuidad con un ligero edema. B2 muestra una continuidad más pobre de la sustancia blanca en la médula espinal ventral y un edema más severo. El tejido en el centro de la LME B3 ha perdido casi toda continuidad, y hay edema extenso en el área fuera del centro de la lesión. (C) C1-C3 representan, respectivamente, la médula espinal en el día 56 después de la lesión en los grupos leve, moderado y grave. Diferentes grados de contractura cicatricial se manifestaron en el centro de lesión entre diferentes grupos, y hubo una diferencia significativa en el diámetro del área de la lesión. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 6: Secciones representativas en el día 56 después de la lesión de la médula espinal en ratones (secciones sagitales). (A) Sección representativa del grupo leve. NF200 indica el neurofilamento, mientras que GFAP indica astrocitos. Se observan astrocitos superpuestos en el epicentro de la lesión, mientras que el neurofilamento en la parte ventral de la médula espinal está en buena continuidad. (B) Sección representativa del grupo moderado. Se pueden observar dos centros cicatriciales (indicados con asteriscos rojos) además de astrocitos superpuestos, mientras que el neurofilamento en la cara ventral tiene continuidad. (C) Sección representativa del grupo severo, con un amplio rango de lesiones y astrocitos formadores de cicatrices masivas. No se observa un centro de cicatriz obvio, y el neurofilamento tiene poca continuidad. Barra de escala = 500 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 7: Fuerza generada desde la misma altura pero con diferentes pesos. Antes del experimento, la fuerza generada por diferentes masas de pesos liberadas desde la misma altura se detectaba utilizando un dispositivo de detección de presión máxima. Después de que cada grupo completó 24 detecciones, se obtuvieron datos de gravedad más confiables para la referencia de la fuerza de golpeo. Los datos fueron analizados utilizando el software estadístico SPSS19.0. Los datos se presentan como media ± DE, n = 24 en cada grupo. Las comparaciones entre más grupos se basaron en un análisis unidireccional de varianza (ANOVA) utilizado para probar las diferencias; p < 0,05 fue considerado estadísticamente significativo. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
| 28 dpi | |||
| Grupo | GMR (%) | WMR (%) | DR (%) |
| Normal | 35.44 | 64.57 | 0 |
| Leve | 11.59 | 64.88 | 23.53 |
| Moderado | 0 | 41.14 | 58.86 |
| Muy fuerte | 0 | 0 | 100 |
Tabla 1: Tasa de sustancia blanca, materia gris y daño en el día 28 después de la lesión. Abreviaturas: dpi = días después de la lesión, DA = área dañada; GMR = tasa de materia gris; WMR = tasa de sustancia blanca; DR = tasa de daños.
| Grupo | 1dpi DA (μm2) | 56dpi DA (μm2) |
| Normal | 0 | 0 |
| Leve | 2391250 | 666091 |
| Moderado | 4383381 | 1263191 |
| Muy fuerte | 5118833 | 1943962 |
Tabla 2: Comparaciones entre la lesión en secciones sagitales en el 1er y 56º día después de la lesión.
Discusión
A través del procedimiento estandarizado, se pueden obtener datos estables, especialmente en experimentos in vivo con animales pequeños, que pueden minimizar la desviación de los resultados causada por diferencias individuales entre los animales. Sobre la base de las condiciones anteriores y los instrumentos de aplicación convenientes, se pueden establecer modelos de SCI estandarizados, mínimamente invasivos, precisos y repetibles.
Debido a su practicidad y conveniencia, anteriormente, el impactador de caída de peso se usaba principalmente3. El impactador introducido en este estudio comparte el mismo principio con el modelo12 de Allen. Afortunadamente, debido a las ventajas de fabricación precisas de la tecnología de mecanizado moderna, el equipo de investigación diseñó un impactador de caída de peso con los beneficios de ser fácil de operar, fuertemente estable y rara vez inexacto. Se utilizó un dispositivo de detección de presión máxima para medir la gravedad de diferentes pesos. Estudios previos6,10 sobre el impactador Infinite Horizons informaron que se acepta un rango de fuerza de ±5 Kdyn que se desvía de la fuerza prevista en los grupos de 30 Kdyn, 50 Kdyn y 70 Kdyn, lo que proporciona una referencia para el presente estudio en términos de división de grupos y selección de grados de contusión. En la presente investigación, se midió previamente la posible fuerza de diferentes grupos y se obtuvieron datos más precisos.
Más crítico que el dispositivo en los experimentos con modelos animales es la comprensión y utilización de la anatomía del ratón. Hacer un buen uso de la anatomía puede hacer que los procedimientos sean mínimamente invasivos. La cirugía mínimamente invasiva afecta directamente la estabilidad del estado funcional del animal experimental y la consistencia de la recuperación posterior del ratón. Estudios previos han demostrado que el establecimiento mínimamente invasivo de modelos de LME aumenta la estabilidad de la estructura vertebral y evita daños adicionales causados por la inestabilidad espinal durante la recuperación en ratas1. La premisa de la cirugía mínimamente invasiva es el uso razonable de estructuras anatómicas naturales. Por lo tanto, la localización rápida y precisa de los segmentos de la médula espinal debe hacerse de acuerdo con la estructura anatómica de los ratones. Como se informó, se utilizó el método de imagen para encontrar la vértebra13. Aunque tiene una alta precisión, en el proceso de operación experimental real, el método de imagen para localizar tiene las desventajas de una operación inconveniente, un largo tiempo de operación, una adquisición de equipos complejos y altos requisitos de precisión del equipo. McDonough et al. describieron la localización de la T7 a través de los ángulos inferiores de las escápulas14, mientras que los ratones actúan en una próstata de mentira, por lo que se supone que los ángulos inferiores mencionados son ángulos posteriores. Además, el uso de las puntas escapulares inferiores para encontrar el T7 es un método de localización para una posición específica en la anatomía humana15, que no es adecuado para ratones. Finalmente, los datos de Micro-CT también validaron la hipótesis de que los ángulos posteriores de las escápulas no están al ras con T7, independientemente de si el ratón está en su posición corporal natural o específica. McDonough et al.14 también mencionaron ubicar el punto más alto de la espalda cuando el ratón está arqueado y definir el punto más alto como T12. Comparativamente, en la presente investigación, el T9 se encuentra con la ayuda del espacio interespinoso T12-T13, que no está asociado ni afectado por la postura del ratón. Además, con este método, la vértebra objetivo se puede localizar y operar fácilmente. Uno debe sondear la costilla 13 bajo el microscopio, tocar suavemente el área del ángulo costovertebral, dibujar una línea hacia el proceso espinoso y luego sondear el espacio entre los procesos espinosos del T12-T13 hacia la cabeza. El equipo de investigación utilizó el espacio interespinoso T12-T13 para localizar el T9 de 12 ratones. Finalmente, 12 ratones hembra C57BL / 6J se sometieron a una micro-tomografía computarizada después de la ubicación de T9 y la laminectomía. El resultado de la micro-tomografía computarizada indicó que las láminas eliminadas en los 12 ratones eran T9. Los resultados del Micro-CT mostraron que todos los T9 estaban localizados con precisión, y la precisión fue significativamente mayor que el método de localización de la escápula. Este método nos proporciona una forma rápida y precisa de localizar, lo que contribuye a la consistencia del modelo de lesiones.
La mínima invasividad del presente protocolo es pronunciada principalmente en tres aspectos. En primer lugar, después de localizar, los músculos paraespinales en el nivel T9 solo se retraen mediante micro-retractores, sin dañar los músculos en los niveles T8 o T10. Además, la exposición de la lámina por los micro-retractores no interfiere con el campo visual. En segundo lugar, la pérdida de sangre, que se debe principalmente a la laminectomía, que puede causar la salida de sangre del hueso esponjoso, es muy baja en el procedimiento de operación, casi no más que el volumen para teñir una pieza triangular de algodón de 2 mm x 2 mm x 3 mm. En tercer lugar, la laminectomía se realizó limitada al área necesaria en la mayor medida, manteniendo la continuidad de la parte lateral de la lámina y atenuando en gran medida la inestabilidad de las vértebras. En comparación con los protocolos anteriores16,17, el protocolo actual reduce mucho el daño innecesario.
Para evaluar los diferentes grados de LME, se compararon los resultados entre todos los grupos en histopatología con lo que estudios previos ya han mostrado 9,11,18. Estos resultados son suficientes para completar un estudio observacional de diferentes grados de lesión y cambios en diferentes períodos. La HE y la inmunofluorescencia mostraron que, con los aumentos en la gravedad de la LME, apareció una morfología más anormal en el tejido de la médula espinal, y el aumento en el grado de daño también condujo a un aumento en el grado de trastorno estructural de la médula espinal. Desde la perspectiva de la observación de la morfología tisular, el grado y la regularidad de los cambios en la morfología tisular en cada grupo experimental en este estudio son altamente consistentes con estudios previos.
De acuerdo con los resultados actuales de las pruebas histológicas, se indican cambios claros en varios indicadores después de diferentes grados de LME traumática, lo que confirma aún más la confiabilidad del modelo establecido en este estudio.
Aunque la técnica es precisa y efectiva, podrían existir limitaciones potenciales para los métodos. Con respecto a la laminectomía, el operador debe ser hábil con las operaciones bajo el microscopio para evitar que la médula espinal se dañe por error. Además, la configuración de toda la plataforma se basa en estructuras mecánicas, estableciendo una mayor demanda para el operador en comparación con los equipos automatizados. De hecho, todos los problemas mencionados pueden mejorarse mediante el entrenamiento repetido de la operación.
Se puede ver que el modelado mínimamente invasivo y estandarizado es beneficioso para hacer que los resultados sean más uniformes, estables y repetibles, evaluar la eficacia de varios planes de tratamiento con precisión y optimizar el plan de investigación para LME traumática.
Divulgaciones
El profesor Shiqing Feng es propietario de la plataforma coaxial de la lesión de la médula espinal.
Agradecimientos
Este trabajo fue apoyado por el Programa Estatal Clave de Ciencias Naturales Nacionales de China (81930070).
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Solución fijadora al 4% | Solarbio | P1110 | 4% |
| Anticuerpo polipeptídico pesado anti-neurofilamento | ABCAM | AB8135 | Relación de dilución (1:2000) |
| Solución de tinción de eosina (soluble en agua) | biosharp | BL727B | |
| Etanol | Fuyu Reactivo | 64-17-5 | |
| Microscopio fluorescente | KEYENCE | BZ-X800 | |
| Cortadora de pelo congelada | leica | CM3050 S | |
| GFAP (GA5) Ratón mAb | Señalización celular TECNOLOGÍA | #3670 | Relación de dilución (1:600) |
| IgG anti-ratón de cabra (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor Plus 488 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32723TR Relación de dilución (1:1000) | |
| IgG anti-conejo de cabra (H+L) Anticuerpo secundario altamente adsorbido cruzado, Alexa Fluor Plus 594 | ThermoFisher SCIENTIFIC | A32740 | Relación de dilución (1:1000) |
| Hematoxilina Solución de tinción | biosharp | BL702A | |
| Ratones | Jinan Pengyue Animal ExperimentalCompany | C57BL/6J | |
| Aparatos de microcirugía | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Todos los instrumentos de cirugía son | tijeras oftálmicas hechas a medida, micro pinzas para mosquitos, pinzas de microcirugía, micro tijeras |
| Suero de oveja normal para bloquear (solución de trabajo) | Zhong Shan Jin Qiao | ZLI-9022 | solución de trabajo |
| O.C.T. Compuesto | SAKURA | 4583 | |
| PBS (solución tamponada con fosfato) | Solarbio | P1020 | pH 7.2-7.4 |
| RWD Estación de anestesia inhalatoria de laboratorio | RWD Life Science Co., Ltd | R550 | |
| Sistema de imagen microCT in vivo para animales pequeños | PerkinElmer | Quantum GX2 | |
| Plataforma coaxial de lesión de la médula espinal | Shandong ULT Biotechnology Co., Ltd | Hecho a medida (estándar de Feng) | (https://shop43957633.m.youzan.com/wscgoods/detail/367x5ovgn69q18g?banner_id=f.81386274~goods.7~1 ~ b0yRFKOq& alg_id=0& slg=tagGood List-default%2COpBottom%2Cuuid %2CabTraceId& components_style_ layout=1& reft=1659409105184& sp m=g.930111970_f.81386274& alias =367x5ovgn69q18g& from_uuid=136 2cc46-ffe0-6886-2c65-01903dbacbb a& sf=qq_sm& is_share=1& shopAuto Enter=1& share_cmpt=native_ wechat& is_silence_auth=1) |
| Microscopio quirúrgico | Zumax Médico Co., Ltd. | zumax, OMS2355 | |
| TBST (Tris Buffered Saline+Tween) | Solarbio | T1082 | Relación de dilución (1:19) |
| Reactivo Xileno | Fuyu | 1330-20-7 |
Referencias
- Duan, H., et al. A novel, minimally invasive technique to establish the animal model of spinal cord injury. Annals of Translational Medicine. 9 (10), 881(2021).
- Piao, M. S., Lee, J. -K., Jang, J. -W., Kim, S. -H., Kim, H. -S. A mouse model of photochemically induced spinal cord injury. Journal of Korean Neurosurgical Society. 46 (5), 479-483 (2009).
- Sharif-Alhoseini, M., et al. Animal models of spinal cord injury: A systematic review. Spinal Cord. 55 (8), 714-721 (2017).
- Zhang, N., Fang, M., Chen, H., Gou, F., Ding, M. Evaluation of spinal cord injury animal models. Neural Regeneration Research. 9 (22), 2008-2012 (2014).
- Borges, P. A., et al. Standardization of a spinal cord lesion model and neurologic evaluation using mice. Clinics. 73, 293(2018).
- Ghasemlou, N., Kerr, B. J., David, S. Tissue displacement and impact force are important contributors to outcome after spinal cord contusion injury. Experimental Neurology. 196 (1), 9-17 (2005).
- Siddall, P., Xu, C. L., Cousins, M. Allodynia following traumatic spinal cord injury in the rat. Neuroreport. 6 (9), 1241-1244 (1995).
- Ford, J. C., et al. MRI characterization of diffusion coefficients in a rat spinal cord injury model. Magnetic Resonance in Medicine. 31 (5), 488-494 (1994).
- Basso, D. M., Beattie, M. S., Bresnahan, J. C. Graded histological and locomotor outcomes after spinal cord contusion using the NYU weight-drop device versus transection. Experimental Neurology. 139 (2), 244-256 (1996).
- Nishi, R. A., et al. Behavioral, histological, and ex vivo magnetic resonance imaging assessment of graded contusion spinal cord injury in mice. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 674-689 (2007).
- Ma, M., Basso, D. M., Walters, P., Stokes, B. T., Jakeman, L. B. Behavioral and histological outcomes following graded spinal cord contusion injury in the C57Bl/6 mouse. Experimental Neurology. 169 (2), 239-254 (2001).
- Allen, A. R. Surgery of experimental lesion of spinal cord equivalent to crush injury of fracture dislocation of spinal column. The Journal of the American Medical Association. (11), 878-880 (1911).
- Kuhn, P. L., Wrathall, J. R. A mouse model of graded contusive spinal cord injury. Journal of Neurotrauma. 15 (2), 125-140 (1998).
- McDonough, A., Monterrubio, A., Ariza, J., Martinez-Cerdeno, V. Calibrated forceps model of spinal cord compression injury. Journal of Visualized Experiments. (98), e52318(2015).
- Ernst, M. J., Rast, F. M., Bauer, C. M., Marcar, V. L., Kool, J. Determination of thoracic and lumbar spinal processes by their percentage position between C7 and the PSIS level. BMC Research Notes. 6, 58(2013).
- Wu, X., et al. A tissue displacement-based contusive spinal cord injury model in mice. Journal of Visualized Experiments. (124), e54988(2017).
- Bhalala, O. G., Pan, L., North, H., McGuire, T., Kessler, J. A. Generation of mouse spinal cord injury. Bio-protocol. 3 (17), 886(2013).
- Shinozaki, M., et al. Novel concept of motor functional analysis for spinal cord injury in adult mice. Journal of Biomedicine and Biotechnology. 2011, 157458(2010).
Reimpresiones y permisos
