Los sistemas CRISPR-Cas y las proteínas anti-CRISPR se integraron en el esquema de puertas booleanas en Saccharomyces cerevisiae. Los nuevos circuitos lógicos pequeños mostraron un buen rendimiento y profundizaron la comprensión de los factores de transcripción basados en dCas9 / dCas12a y las propiedades de las proteínas anti-CRISPR.
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Artículo de método
Circuitos digitales genéticos basados en sistemas CRISPR-Cas y proteínas anti-CRISPR
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Resumen
Resumen
Las puertas booleanas de genes sintéticos y los circuitos digitales tienen una amplia gama de aplicaciones, desde el diagnóstico médico hasta el cuidado del medio ambiente. El descubrimiento de los sistemas CRISPR-Cas y sus inhibidores naturales, las proteínas anti-CRISPR (Acrs), proporciona una nueva herramienta para diseñar e implementar circuitos digitales de genes in vivo . Aquí, describimos un protocolo que sigue la idea del ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" y hace uso de dCas9/dCas12a junto con sus correspondientes Acrs para establecer pequeñas redes transcripcionales, algunas de las cuales se comportan como puertas booleanas, en Saccharomyces cerevisiae. Estos resultados señalan las propiedades de dCas9/dCas12a como factores de transcripción. En particular, para lograr la activación máxima de la expresión génica, dSpCas9 necesita interactuar con un ARN de andamio diseñado que recolecta múltiples copias del dominio de activación VP64 (AD). Por el contrario, dCas12a se fusionará, en el extremo C, con el fuerte VP64-p65-Rta (VPR) AD. Además, la actividad de ambas proteínas Cas no se ve reforzada por el aumento de la cantidad de sgRNA/crRNA en la célula. Este artículo también explica cómo construir puertas booleanas basadas en la interacción CRISPR-dCas-Acr. El dominio de unión a hormonas fusionado AcrIIA4 del receptor de estrógeno humano es el núcleo de una puerta NOT que responde al β-estradiol, mientras que los AcrVA sintetizados por el promotor GAL1 inducible permiten imitar las puertas SÍ y NO con galactosa como entrada. En estos últimos circuitos, AcrVA5, junto con dLbCas12a, mostró el mejor comportamiento lógico.
Introducción
En 2011, los investigadores propusieron un método computacional y desarrollaron una pieza correspondiente de software para el diseño automático de circuitos genéticos sintéticos digitales1. Un usuario tenía que especificar el número de entradas (tres o cuatro) y rellenar la tabla de verdad del circuito; Esto proporcionó toda la información necesaria para derivar la estructura del circuito utilizando técnicas de la electrónica. La tabla de verdad se tradujo a dos fórmulas booleanas a través del método 2 del mapa de Karnaugh. Cada fórmula booleana está hecha de cláusulas que describen operaciones lógicas (suma o m....
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Protocolo
1. Diseño y construcción del casete de expresión sgRNA/crRNA
NOTA: Hay dos tipos de casetes de expresión de sgRNA/crRNA: SNR5210-está compuesto por el promotor SNR52 dependiente de la ARN polimerasa III, la secuencia sgRNA/crRNA y el terminador SUP4; otro, abreviado como RGR11, consiste en el promotor ADH1 dependiente de la ARN polimerasa II, la estructura RGR (ribozima-ribozima de ARN guía de ribozima) que contiene dos ribozimas (una ribozima de cabeza de martillo-HH y una ribozima del virus delta de la hepatitis HDV) y la secuencia del sgRNA / crRNA ....
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Resultados
Expresión de sgRNA/crRNA por un promotor de tipo ARN polimerasa III
Primero, este trabajo abordó la ingeniería del circuito de activación transcripcional (circuito 1) que se muestra en la Figura 1A. Contenía tres componentes básicos: 1) el gen que codifica para yEGFP (el informador), que fue precedido por una serie de diferentes promotores sintéticos que proporcionaron sitios objetivo para dCas9 / dCas12a-AD; 2) una versión optimizada para codones de levadura de dCas9 o d.......
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Discusión
El protocolo mostró un posible flujo de trabajo completo para los circuitos digitales de genes sintéticos, siguiendo el ciclo de ingeniería biológica "Diseñar-Construir-Probar-Aprender" (DBTL) y con respecto a los experimentos de laboratorio seco y laboratorio húmedo. Aquí, nos centramos en el sistema CRISPR-Cas, principalmente dSpCas9, denAsCas12a, dLbCas12a y las proteínas anti-CRISPR correspondientes, diseñando y construyendo en S. cerevisiae pequeñas redes transcripcionales. Algunos de ellos imitaban las pue.......
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Divulgaciones
Los autores declaran que no hay intereses financieros contrapuestos.
Agradecimientos
Queremos agradecer a todos los estudiantes del laboratorio de Biología Sintética -SPST, TJU- por su ayuda general, junto con Zhi Li y Xiangyang Zhang por su asistencia en los experimentos de FACS.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Tubos de PCR de 8 tiras de 0,1 mL | NEST | 403112 | |
| Tubos de PCR de 0,2 mL | Axygen | PCR-02-C | |
| Microtubos de 1,5 mL | Axygen | MCT-150-C | |
| Tubos de centrífuga de 15 mL | BIOFIL | CFT011150 | |
| 2 mL Microtubos | Axygen | MCT-200-C | |
| Tubos de centrífuga de 50 mL | BIOFIL | CFT011500 | |
| Agarosa-grado de biología molecular | Invitrogen | 75510-019 | |
| Sal sódica de ampicilina | Solarbio | 69-52-3 | |
| Biosystems aplicado: veriti termociclador de 96 pocillos | Thermo Fisher Scientific | 4375786 | |
| AxyPrep Kit de extracción de gel de ADN | Axygen | AP-GX-250 | |
| BD FACSuite CS& amperio; Perlas de investigación T | BD | 650621 | Perlas fluorescentes |
| BD FACSCitómetro de flujo de Verse | |||
| Centrífuga | Eppendorf | 5424 | |
| Centrífuga Sorvall ST 16R | Thermo Fisher Scientific | 75004380 | |
| E. coli células competentes (cepa DH5α) | Life Technologies | 18263-012 | |
| ECL seleccionar reactivo de detección de Western Blotting | GE Healthcare | RPN2235 | |
| Aparato de electroforesis | Beijing JUNYI Electroforesis Co., Ltd | JY300C | |
| Tapas planas de 8 tiras | NEST | 406012 | |
| Empresa de síntesis génica | Azenta Life Sciences | https://web.azenta.com/zh-cn/azenta-life-sciences | |
| Anticuerpo secundario adsorbido cruzado anti-IgG (H+L) anti-ratón de cabra Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A-11004 | |
| HiFiScript Kit de síntesis de ADNc | CWBIO | CW2569M | Kit utilizado en el paso 6.2.2.1 |
| Solución de lisado (Zymoliasa) | zymoresearch | E1004-A | |
| Microscopio de fluorescencia Nikon Eclipse 80i | Nikon | - | Microscopio de fluorescencia |
| Puntas de pipeta— 10 μ L | Axygen | T-300-R-S | |
| Puntas de pipeta— 1000 μ L | Axygen | T-1000-B-R-S | |
| Puntas de pipeta— 200 μ L | Axygen | T-200-Y-R-S | |
| pRSII403 | Addgene | 35436 | |
| pRSII404 | Addgene | 35438 | |
| pRSII405 | Addgene | 35440 | |
| pRSII406 | Addgene | 35442 | |
| pRSII424 | Addgene | 35466 | |
| pTPGI_dSpCas9_VP64 | Addgene | 49013 | |
| Q5 ADNomerasa de alta fidelidad | New England Biolabs | M0491 | |
| Enzima de restricción-Acc65I | New England Biolabs | R0599 | |
| Enzima de restricción-BamHI | New England Biolabs | R0136 | |
| Enzima de restricción-SacI-HF | New England Biolabs | R3156 | |
| Enzima de restricción-XhoI | New England Biolabs | R0146 | |
| Roche LightCycler 96 | Roche-Real-Time PCR Instrument | ||
| S. cerevisiae CEN. PK2-1C | : | la cepa principal. El genotipo es: MATa; his3D1; leu2-3_112; URA3-52; TRP1-289; MAL2-8c; Kit | |
| de bucle de vástago | SparkJade | AG0502 | Kit utilizado en el paso 6.2.1.3 |
| Termociclador T100 | BIO-RAD | 186-1096 | |
| T4 ADN ligasa | New England Biolabs | M0202 | |
| T5 Exonucleasa | New England Biolabs | M0363 | |
| Taq ADN ligasa | New England Biolabs | M0208 | |
| Taq ADN polimerasa | New England Biolabs | M0495 | |
| TB Green Premix Ex Taq II (Tli RNaseH Plus)(2x) (SYBR Green I dye) | Takara | RR820Q | |
| YeaStar RNA kit | Zymo Research | R1002 | |
| β-estradiol | Sigma-Aldrich | E8875 |
Referencias
- Marchisio, M. A., Stelling, J. Automatic design of digital synthetic gene circuits. PLOS Computational Biology. 7 (2), 1001083(2011).
- Karnaugh, M. The map method for synthesis of combinational logic circuits. Transactions of the Ameri....
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Reimpresiones y permisos
