Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

El pulldown convencional es ampliamente utilizado para estudiar las interacciones proteína-proteína¹. Sin embargo, las proteínas purificadas a menudo no interactúan eficazmente in vitro^2,3, y algunas de ellas son insolubles sin su compañero de unión ^4,5. Tales proteínas pueden requerir ensamblaje co-traduccional o la presencia de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Otra limitación del pulldown convencional es el ensayo de una posible actividad de heteromultimerización entre dominios que pueden existir como homooligómeros estables ensamblados co-traduccionalmente ^8,10, ya que muchos de ellos no pueden disociarse y reasociarse in vitro durante el tiempo de incubación. La coexpresión fue encontrada útil para superar tales problemas ^3,11. La coexpresión utilizando vectores compatibles en bacterias se utilizó con éxito para purificar grandes complejos macromoleculares de múltiples subunidades, incluido el complejo represivo polycomb PRC2¹², el módulo¹³ de la cabeza mediadora de la ARN polimerasa II, la placa base del bacteriófago T4 14, el módulo^15,16 de la desubiquitinasa del complejo SAGA y la ferritina¹⁷. Los orígenes de replicación comúnmente utilizados para la coexpresión son ColE1, p15A¹⁸, CloDF13¹⁹ y RSF²⁰. En el sistema de expresión Duet disponible comercialmente, estos orígenes se combinan con diferentes genes de resistencia a antibióticos y sitios de clonación múltiples convenientes para producir vectores policistrónicos, lo que permite la expresión de hasta ocho proteínas. Estos orígenes tienen diferentes números de copias y pueden ser utilizados en combinaciones variables para lograr niveles de expresión equilibrados de proteínas diana²¹. Para probar las interacciones proteína-proteína, se utilizan varias etiquetas de afinidad; las más comunes son 6xHistidina, glutatión-S-transferasa (GST) y proteína de unión a maltosa (MBP), cada una de las cuales tiene una afinidad específica con la resina correspondiente. GST y MBP también mejoran la solubilidad y estabilidad de las proteínas marcadas²².

También se han desarrollado varios métodos que involucran la coexpresión de proteínas en células eucariotas, el más destacado de los cuales es el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H)²³. El ensayo Y2H es barato, fácil y permite probar múltiples interacciones; sin embargo, su flujo de trabajo tarda más de 1 semana en completarse. También hay algunos ensayos basados en células de mamíferos menos utilizados, por ejemplo, el ensayo fluorescente de dos híbridos (F2H)²⁴ y el ensayo de interacción proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)²⁵. El ensayo F2H es relativamente rápido, lo que permite observar las interacciones de proteínas en su entorno celular nativo, pero implica el uso de costosos equipos de imágenes. Todos estos métodos tienen una ventaja sobre la expresión procariota que proporciona la traducción eucariota nativa y el entorno de plegado; Sin embargo, detectan la interacción indirectamente, ya sea por activación transcripcional o por transferencia de energía fluorescente, que a menudo produce artefactos. Además, las células eucariotas pueden contener otros socios de interacción de proteínas de interés, que pueden interferir con la prueba de interacciones binarias entre proteínas de eucariotas superiores.

El presente estudio describe un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente seguido de técnicas convencionales de pulldown. El método permite estudiar las interacciones entre proteínas diana que requieren coexpresión. Es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional, lo que permite la prueba por lotes de múltiples objetivos, lo que lo hace ventajoso en la mayoría de los casos. La coexpresión utilizando vectores compatibles es más conveniente que la coexpresión policistrónica, ya que no requiere un paso laborioso de clonación.

La representación esquemática del flujo de trabajo del método se muestra en la figura 1.

1. Cotransformación de E. coli

1. Preparar vectores de expresión para proteínas diana utilizando métodos de clonación estándar.
   NOTA: Típicamente, un buen punto de partida es utilizar vectores pGEX/pMAL convencionales con un gen de resistencia a la ampicilina y un origen ColE1 para la expresión de proteínas marcadas con GST/MBP y un vector compatible con origen p15A o RSF y resistencia a la kanamicina para expresar proteínas marcadas con 6xHis, en algunos casos combinadas con tiorredoxina o etiqueta SUMO para aumentar la solubilidad. Por lo general, varias combinaciones de etiquetas deben probarse antes del experimento. El método descrito en sí mismo es conveniente para probar por lotes las condiciones de expresión de las proteínas objetivo. Es importante tener en cuenta que la mayoría de las cepas de Rosetta ya contienen el plásmido con origen p15A para expresar los ARNt para codones raros; por lo tanto, si el uso de tales cepas es una opción posible, se deben evitar los plásmidos p15A. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.
   1. Cultivar bacterias de una cepa apropiada en medios Luria-Bertani (LB) a 37 °C hasta una densidad óptica (OD) de 0,1-0,2. La cepa BL21 (DE3) se utilizó como ejemplo en este estudio.
      NOTA: Se recomienda utilizar células competentes recién preparadas para lograr una cotransformación eficiente con dos vectores. Si es necesario co-transformar más de dos vectores, es mejor transformarlos secuencialmente para lograr una buena eficiencia de transformación. La electroporación es una buena alternativa.
   2. Centrifugar 1,0 ml de la suspensión bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   3. Agregue 0,5 ml de tampón de transformación del tampón (TB) helado (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 y 15 mM CaCl₂) e incube durante 10 min en hielo.
   4. Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.
   5. Agregue 100 μL de tampón TB, agregue 100 ng de cada vector e incube durante 30 minutos en hielo. Transformar por separado vectores individuales para estudiar el comportamiento de las proteínas sin coexpresión. Además, cotransforme vectores de expresión en pares con vectores de coexpresión vacíos para controles de enlace no específicos.
      NOTA: En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron vectores pGEX/pMAL con ADNc correspondientes fusionados con ADNc GST/MBP en combinación con vectores compatibles derivados de pACYC que llevaban dominios de proteínas asociadas que codifican ADNc fusionados con ADNc de tiorredoxina.
   6. Calentar a 42 °C durante 150 s, luego enfriar durante 1 minuto sobre hielo.
   7. Añadir 1 ml de medio LB líquido sin antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa en placas de agar LB que contienen 0,5% de glucosa y antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Incubar las placas durante la noche a 37 °C.

2. Expresión

1. Enjuague las células de la placa con 2 ml de medio LB líquido en 50 ml de medio LB con los antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Agregue iones metálicos u otros cofactores conocidos (en los ejemplos proporcionados en este estudio, se agregó 0.2 mM ZnCl₂ a los medios). Conservar una alícuota con glicerol al 20% a -70 °C para repetir posteriormente el experimento.
   NOTA: Se recomienda eliminar varias colonias directamente de la placa para excluir la posibilidad de mala expresión en un solo clon aislado debido a eventos ocasionales de recombinación entre dos plásmidos.
2. Cultivar las células con una rotación constante de 220 rpm a 37 °C a un OD de 0.5-0.7, enfriar a temperatura ambiente (RT) y agregar isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 mM. Almacenar una alícuota de 20 μL de suspensión celular como control de la muestra no inducida.
3. Incubar las células con una rotación constante de 220 rpm a 18 °C durante la noche.
   NOTA: El tiempo y la temperatura óptimos de incubación pueden variar; 18 ° C durante la noche funciona mejor para la mayoría de las proteínas y se recomienda probarlo por defecto. Reduzca el tiempo de incubación a 2-3 h si se observa una fuerte unión no específica.
4. Divida la suspensión bacteriana en dos partes (o más si se usaron más de dos etiquetas diferentes) y almacene una alícuota de 20 μL de la suspensión celular para confirmar la expresión de proteínas. Centrifugadora a 4.000 x g durante 15 min.
   NOTA: Punto de pausa: los pellets bacterianos pueden almacenarse a -70 °C durante al menos 6 meses.

3. Ensayo pulldown

NOTA: Los procedimientos detallados se describen para las proteínas marcadas con 6xHis o MBP/GST. Todos los procedimientos se realizan a 4°C.

1. Resuspender los gránulos bacterianos en 1 ml de tampón de lisis helada con inhibidores de la proteasa y agentes reductores (ver más abajo) agregados inmediatamente antes del experimento. Evite el ditiotreitol (DTT) cuando use resinas quelantes de metales, ya que elimina los iones metálicos. Ajuste la composición tampón para las proteínas probadas. Las recetas comunes de tampones de lisis que se encuentran adecuados para la mayoría de las proteínas son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 1 mM fenilmetilsfulfonilfluoruro (PMSF) y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).
   2. Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).
2. Interrumpir las células por sonicación en hielo. Conservar una alícuota de 20 μl para electroforesis.
   NOTA: Normalmente, se requieren 20-25 pulsos de 5 s con intervalos de 15 s con una potencia de salida de 20 W por muestra. La potencia de sonicación adecuada debe ajustarse para cada instrumento para evitar el sobrecalentamiento y garantizar la interrupción total de la celda. Para lograr un mejor rendimiento, se recomienda encarecidamente utilizar sondas sonicadoras multipunta de alto rendimiento.
3. Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min. Recoger 20 μL del lisado clarificado para su posterior análisis SDS-PAGE.
4. Equilibrar la resina (50 μL para cada muestra) con 1 ml de tampón de lisis helada durante 10 min, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
5. Añadir lisados celulares (concentración total de proteínas: 20-50 mg/ml) a la resina, incubar durante 10 min a una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Recoger 20 μL de la fracción no unida para su posterior análisis SDS-PAGE.
6. Agregue 1 ml de tampón de lavado helado e incubar durante 1 minuto. Centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Las recetas comunes para los tampones de lavado son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM beta-mercaptoetanol.
   2. Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl₂, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM DTT.
7. Realice dos lavados largos: agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 10-30 minutos con una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
8. Agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 1 minuto, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.
9. Eluya las proteínas unidas con 50 μL del tampón de elución en un agitador a 1.200 rpm durante 10 min. Las recetas comunes de tampones de elución son:
   1. 6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol y 5 mM beta-mercaptoetanol.
   2. GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathione (ajustado a pH 7.5 con Tris básico) y 5 mM TDT.
   3. MBP-pulldown: Mezclar 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltosa y 5 mM TDT.
10. Analizar las proteínas eluidas con SDS-PAGE.
    NOTA: El porcentaje de acrilamida debe ajustarse al tamaño de las proteínas. En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron geles de acrilamida al 12%, que funcionan en tampón tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) a un voltaje constante de 180 V. Los geles se tiñeron hirviendo en azul de Coomassie al 0,2% R250, ácido acético al 10% y isopropanol al 30%, y se decoloraron hirviendo en ácido acético al 10%. La cantidad de proteína cargada no debe ser igual, ya que varias cantidades de proteínas que interactúan pueden reducirse en diferentes experimentos.

El método descrito se utilizó rutinariamente con muchos objetivos diferentes. Aquí se presentan algunos resultados representativos que probablemente no se puedan obtener utilizando técnicas convencionales de pulldown. El primero es el estudio de la dimerización específica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Los ZAD forman dímeros estables y específicos, con heterodímeros posibles solo entre dominios estrechamente relacionados dentro de grupos parálogos. Los dímeros formados por estos dominios son estables y no se disocian durante al menos unos días; por lo tanto, la mezcla de ZAD purificados no produce ninguna unión detectable. Al mismo tiempo, la coexpresión de MBP y ZADs fusionados con tiorredoxina-6xHis muestra una actividad de homodimerización buena y reproducible (Figura 2A), apareciendo como una banda adicional en los resultados de SDS-PAGE del ensayo de extracción de MBP. Se puede observar una pequeña porción de heterodímeros con M1BP coexpresada con otro dominio; esta interacción no se confirmó con Y2A y lo más probable es que sea el resultado de una asociación no específica debido a la alta concentración de proteínas, ya que estos dominios son ricos en cisteína y extremadamente propensos a la agregación. En particular, en este caso, 6xHis-pulldown es inapropiado ya que los ZAD son dominios de coordinación de metales que se unen de forma no específica a la resina quelante de metales. Tal actividad debe examinarse cuidadosamente en un experimento paralelo.

Otro ejemplo es el ensayo de competencia entre la proteína ENY2 y sus socios de unión Sgf11 (1-83aa) y el dominio zinc-dedo (460-631 aa) de la proteína CTCF26. Cuando se expresa sola, la proteína ENY2 forma dímeros que le impiden interactuar con sus socios de unión nativos. Presumiblemente, tanto las proteínas Sgf11 como CTCF se unen a la misma superficie molecular de ENY2, lo que hace que su interacción sea mutuamente excluyente. En el ensayo de coexpresión, ENY2 marcado con 6xHis interactuó tanto con Sgf11 como MBP-CTCF marcados con GST, pero no hubo GST-Sgf11 en los pulldowns de MBP y viceversa (Figura 2B). Estos resultados sugieren que no se puede formar un complejo triple, y las interacciones son mutuamente excluyentes. Estos datos se confirmaron de forma independiente con otros ensayos y apoyan los diferentes roles funcionales de ENY2 en estos complejos. Debe prestarse atención al hecho de que las grandes etiquetas de afinidad pueden imponer obstáculos estéricos por sí mismas, evitando la formación de complejos; Por lo tanto, la conclusión no debe basarse únicamente en datos de coexpresión.

En la Figura 3A se muestra una comparación paso a paso de los flujos de trabajo de los pulldowns de coexpresión convencionales y acoplados. El pulldown acoplado a coexpresión es al menos dos veces más eficiente en el tiempo, incluso con un pequeño número de muestras, y permite una buena escalabilidad. Los resultados de la utilización de ambas técnicas para estudiar la misma interacción entre el dominio BTB de la proteína CP190 (1-126aa) y el dominio C-terminal marcado con GST (610-818aa) de la proteína Drosophila CTCF (dCTCF) se muestran en la Figura 3B. Ambos métodos muestran buena eficiencia y reproducibilidad (los ensayos se realizaron en tres réplicas); para este caso, la tirada de tracción acoplada a la coexpresión mostró una menor unión no específica, como se puede ver en las muestras de control con la proteína GST sola.

Figura 1: La representación esquemática del protocolo. El esquema muestra el flujo de trabajo del método empleado en este estudio. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2: Resultados representativos . (A) Estudio de la homodimerización del dominio asociado a dedos de zinc (ZAD) en ensayos de MBP y 6xHis-pulldown. Los ZAD fusionados con MBP (40 kDa) o con 6xHis-Tiorredoxina (20 kDa) se coexpresaron en células bacterianas y la afinidad se purificó con resina de amilosa (se une a proteínas marcadas con MBP) o con resina Ni-NTA (se une a proteínas marcadas con 6xHis). Las proteínas co-purificadas se visualizaron con SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. Los resultados de MBP-pulldown se muestran en los paneles superiores, los resultados de 6xHis-pulldown están en los paneles inferiores (utilizados solo como control de expresión de proteínas ya que muchos ZAD se unen no específicamente a Ni-NTA). (B) Estudio de interacciones mutuamente excluyentes entre las proteínas ENY2 y Sgf11/CTCF. Las proteínas Sgf11 (1-81aa) marcadas con GST, CTCF con dedo de zinc marcadas con MBP (460-631aa) y ENY2 marcadas con 6xHis se coexpresaron en varias combinaciones y la afinidad se purificó con resina de amilosa, resina de glutatión (se une a proteínas marcadas con GST) o con resina Ni-NTA. Las proteínas co-purificadas se visualizaron con SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. La figura de los paneles A y B ha sido modificada con permiso de Bonchuk et al.11 y Bonchuk et al.26. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 3: Comparación de flujos de trabajo de ensayos pulldown de coexpresión convencionales y acoplados. (A) Comparación paso a paso de los intervalos de tiempo requeridos en el flujo de trabajo del ensayo pulldown convencional en comparación con pulldown acoplado a la coexpresión. (B) Comparación de dos técnicas diferentes de pulldown en el estudio de la interacción entre el dominio C-terminal dCTCF (610-818aa) y el dominio BTB de la proteína CP190 (1-126aa) en ensayos GST-pulldown. dCTCF (610-818aa) fusionado con GST (25kDa) o GST solo se coexpresó en células bacterianas o se incubó in vitro con Thioredoxin-6xHis-markged CP190 BTB y afinidad purificada con resina de glutatión. Se muestran tres réplicas independientes de cada ensayo. Las proteínas co-purificadas se visualizaron con SDS-PAGE seguido de tinción de Coomassie. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.