Name: Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-12-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 3 s
Description: Aprende el ensayo pulldown con coexpresión en células bacterianas para estudiar interacciones proteína-proteína desafiantes. Este método permite el ensamblaje eficiente de complejos proteicos heterodiméricos.

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Este trabajo fue apoyado por los proyectos de la Fundación Rusa de Ciencias 19-74-30026 (desarrollo y validación de métodos) y 19-74-10099 (ensayos de interacción proteína-proteína); y por el Ministerio de Ciencia y Educación Superior de la Federación de Rusia-subvención 075-15-2019-1661 (análisis de interacciones representativas proteína-proteína).

La representación esquemática del flujo de trabajo del método se muestra en la figura 1.
1. Cotransformación de E. coli
<ol><li>Preparar vectores de expresión para proteínas diana utilizando métodos de clonación estándar. NOTA: Típicamente, un buen punto de partida es utilizar vectores pGEX/pMAL convencionales con un gen de resistencia a la ampicilina y un origen ColE1 para la expresión de proteínas marcadas con GST/MBP y un vector compatible con origen p15A o RSF y resistencia a la kanamicina para expresar proteínas marcadas con 6xHis, en algunos casos combinadas con tiorredoxina o etiqueta SUMO para aumentar la solubilidad. Por lo general, varias combinaciones de etiquetas deben probarse antes del experimento. El método descrito en sí mismo es conveniente para probar por lotes las condiciones de expresión de las proteínas objetivo. Es importante tener en cuenta que la mayoría de las cepas de Rosetta ya contienen el plásmido con origen p15A para expresar los ARNt para codones raros; por lo tanto, si el uso de tales cepas es una opción posible, se deben evitar los plásmidos p15A. Consulte la Tabla de materiales para obtener más detalles.<ol><li>Cultivar bacterias de una cepa apropiada en medios Luria-Bertani (LB) a 37 °C hasta una densidad óptica (OD) de 0,1-0,2. La cepa BL21 (DE3) se utilizó como ejemplo en este estudio. NOTA: Se recomienda utilizar células competentes recién preparadas para lograr una cotransformación eficiente con dos vectores. Si es necesario co-transformar más de dos vectores, es mejor transformarlos secuencialmente para lograr una buena eficiencia de transformación. La electroporación es una buena alternativa.</li>
		<li>Centrifugar 1,0 ml de la suspensión bacteriana durante 1 min a 9.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 0,5 ml de tampón de transformación del tampón (TB) helado (10 mM MOPS [pH 6,7], 250 mM KCl, 55 mM MnCl 2 y 15 mM CaCl2) e incube durante 10 min en hielo.</li>
		<li>Centrifugar durante 30 s a 8.000 x g a 4 °C y desechar el sobrenadante.</li>
		<li>Agregue 100 μL de tampón TB, agregue 100 ng de cada vector e incube durante 30 minutos en hielo. Transformar por separado vectores individuales para estudiar el comportamiento de las proteínas sin coexpresión. Además, cotransforme vectores de expresión en pares con vectores de coexpresión vacíos para controles de enlace no específicos. NOTA: En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron vectores pGEX/pMAL con ADNc correspondientes fusionados con ADNc GST/MBP en combinación con vectores compatibles derivados de pACYC que llevaban dominios de proteínas asociadas que codifican ADNc fusionados con ADNc de tiorredoxina.</li>
		<li>Calentar a 42 °C durante 150 s, luego enfriar durante 1 minuto sobre hielo.</li>
		<li>Añadir 1 ml de medio LB líquido sin antibióticos e incubar a 37 °C durante 90 min. Placa en placas de agar LB que contienen 0,5% de glucosa y antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Incubar las placas durante la noche a 37 °C.</li>
	</ol></li>
</ol>2. Expresión
<ol><li>Enjuague las células de la placa con 2 ml de medio LB líquido en 50 ml de medio LB con los antibióticos correspondientes (las concentraciones comunes son: 50 mg / L de ampicilina; 20 mg / L de kanamicina; 50 mg / L de estreptomicina; 35 mg / L de cloranfenicol). Agregue iones metálicos u otros cofactores conocidos (en los ejemplos proporcionados en este estudio, se agregó 0.2 mM ZnCl2 a los medios). Conservar una alícuota con glicerol al 20% a -70 °C para repetir posteriormente el experimento. NOTA: Se recomienda eliminar varias colonias directamente de la placa para excluir la posibilidad de mala expresión en un solo clon aislado debido a eventos ocasionales de recombinación entre dos plásmidos.</li>
	<li>Cultivar las células con una rotación constante de 220 rpm a 37 °C a un OD de 0.5-0.7, enfriar a temperatura ambiente (RT) y agregar isopropil β-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) a 1 mM. Almacenar una alícuota de 20 μL de suspensión celular como control de la muestra no inducida.</li>
	<li>Incubar las células con una rotación constante de 220 rpm a 18 °C durante la noche. NOTA: El tiempo y la temperatura óptimos de incubación pueden variar; 18 ° C durante la noche funciona mejor para la mayoría de las proteínas y se recomienda probarlo por defecto. Reduzca el tiempo de incubación a 2-3 h si se observa una fuerte unión no específica.</li>
	<li>Divida la suspensión bacteriana en dos partes (o más si se usaron más de dos etiquetas diferentes) y almacene una alícuota de 20 μL de la suspensión celular para confirmar la expresión de proteínas. Centrifugadora a 4.000 x g durante 15 min. NOTA: Punto de pausa: los pellets bacterianos pueden almacenarse a -70 °C durante al menos 6 meses.</li>
</ol>3. Ensayo pulldown
NOTA: Los procedimientos detallados se describen para las proteínas marcadas con 6xHis o MBP/GST. Todos los procedimientos se realizan a 4°C.
<ol><li>Resuspender los gránulos bacterianos en 1 ml de tampón de lisis helada con inhibidores de la proteasa y agentes reductores (ver más abajo) agregados inmediatamente antes del experimento. Evite el ditiotreitol (DTT) cuando use resinas quelantes de metales, ya que elimina los iones metálicos. Ajuste la composición tampón para las proteínas probadas. Las recetas comunes de tampones de lisis que se encuentran adecuados para la mayoría de las proteínas son:<ol><li>6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 10 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM beta-mercaptoetanol, 1 mM fenilmetilsfulfonilfluoruro (PMSF) y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).</li>
		<li>Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl2, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol, 5 mM DTT, 1 mM PMSF y una dilución 1:1,000 del cóctel inhibidor de proteasa (ver Tabla de materiales).</li>
	</ol></li>
	<li>Interrumpir las células por sonicación en hielo. Conservar una alícuota de 20 μl para electroforesis. NOTA: Normalmente, se requieren 20-25 pulsos de 5 s con intervalos de 15 s con una potencia de salida de 20 W por muestra. La potencia de sonicación adecuada debe ajustarse para cada instrumento para evitar el sobrecalentamiento y garantizar la interrupción total de la celda. Para lograr un mejor rendimiento, se recomienda encarecidamente utilizar sondas sonicadoras multipunta de alto rendimiento.</li>
	<li>Centrifugadora a 20.000 x g durante 30 min. Recoger 20 μL del lisado clarificado para su posterior análisis SDS-PAGE.</li>
	<li>Equilibrar la resina (50 μL para cada muestra) con 1 ml de tampón de lisis helada durante 10 min, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Añadir lisados celulares (concentración total de proteínas: 20-50 mg/ml) a la resina, incubar durante 10 min a una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Recoger 20 μL de la fracción no unida para su posterior análisis SDS-PAGE.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón de lavado helado e incubar durante 1 minuto. Centrifugar a 2.000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante. Las recetas comunes para los tampones de lavado son:<ol><li>6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 30 mM Imidazol, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM beta-mercaptoetanol.</li>
		<li>Pulldown GST o MBP: mezcle 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 500 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM MgCl 2, 0.1 mM ZnCl2, 0.1% NP40, 10% [p/p] glicerol y 5 mM DTT.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice dos lavados largos: agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 10-30 minutos con una rotación constante de 15 rpm, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Agregue 1 ml de tampón de lavado helado, incubar durante 1 minuto, centrifugar a 2,000 x g durante 30 s y desechar el sobrenadante.</li>
	<li>Eluya las proteínas unidas con 50 μL del tampón de elución en un agitador a 1.200 rpm durante 10 min. Las recetas comunes de tampones de elución son:<ol><li>6xHis-pulldown: Mezcle 30 mM HEPES (pH 7.5), 400 mM NaCl, 300 mM Imidazol y 5 mM beta-mercaptoetanol.</li>
		<li>GST-pulldown: 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 50 mM Glutathione (ajustado a pH 7.5 con Tris básico) y 5 mM TDT.</li>
		<li>MBP-pulldown: Mezclar 20 mM Tris (pH 7.5 a 25 °C), 150 mM NaCl, 40 mM maltosa y 5 mM TDT.</li>
	</ol></li>
	<li>Analizar las proteínas eluidas con SDS-PAGE. NOTA: El porcentaje de acrilamida debe ajustarse al tamaño de las proteínas. En los ejemplos proporcionados en este estudio, se utilizaron geles de acrilamida al 12%, que funcionan en tampón tris-glicina-SDS (2 mM Tris, 250 mM de glicina, 0,1% SDS) a un voltaje constante de 180 V. Los geles se tiñeron hirviendo en azul de Coomassie al 0,2% R250, ácido acético al 10% y isopropanol al 30%, y se decoloraron hirviendo en ácido acético al 10%. La cantidad de proteína cargada no debe ser igual, ya que varias cantidades de proteínas que interactúan pueden reducirse en diferentes experimentos.</li>
</ol>

<ol><li>Louche, A., Salcedo, S. P., Bigot, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+Pulldown+assays%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: Pulldown assays.</a> Methods in Molecular Biology. 1615, 247-255 (2017).</li>
<li>Rose, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+dimerization%2C+coactivator+recognition+and+MODY3+mutations+in+HNF-1alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Structural+%26+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">Structural basis of dimerization, coactivator recognition and MODY3 mutations in HNF-1alpha.</a> Nature Structural & Molecular Biology. 7 (9), 744-748 (2000).</li>
<li>Bonchuk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+diversity+and+homodimerization+specificity+of+zinc-finger-associated+domains+in+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">Structural basis of diversity and homodimerization specificity of zinc-finger-associated domains in Drosophila.</a> Nucleic Acids Research. 49 (4), 2375-2389 (2021).</li>
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<li>Badonyi, M., Marsh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Large+protein+complex+interfaces+have+evolved+to+promote+co-translational+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22Elife%22%5BJournal%5D)">Large protein complex interfaces have evolved to promote co-translational assembly.</a> Elife. 11, 79602(2022).</li>
<li>Kramer, G., Shiber, A., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+maturation+of+newly+synthesized+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Reviews+in+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational maturation of newly synthesized proteins.</a> Annual Reviews in Biochemistry. 88, 337-364 (2019).</li>
<li>Koubek, J., Schmitt, J., Galmozzi, C. V., Kramer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanisms+of+cotranslational+protein+maturation+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Molecular+Biosciences%22%5BJournal%5D)">Mechanisms of cotranslational protein maturation in bacteria.</a> Frontiers in Molecular Biosciences. 8, 689755(2021).</li>
<li>Shiber, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cotranslational+assembly+of+protein+complexes+in+eukaryotes+revealed+by+ribosome+profiling%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cotranslational assembly of protein complexes in eukaryotes revealed by ribosome profiling.</a> Nature. 561 (7722), 268-272 (2018).</li>
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<li>Bonchuk, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+insights+into+highly+similar+spatial+organization+of+zinc-finger+associated+domains+with+a+very+low+sequence+similarity%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Structural insights into highly similar spatial organization of zinc-finger associated domains with a very low sequence similarity.</a> Structure. 30 (7), 1004-1015 (2022).</li>
<li>Justin, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+of+oncogenic+histone+H3K27M+inhibition+of+human+polycomb+repressive+complex+2%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Structural basis of oncogenic histone H3K27M inhibition of human polycomb repressive complex 2.</a> Nature Communications. 7, 11316(2016).</li>
<li>Lariviere, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+mediator+head+module%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the mediator head module.</a> Nature. 492 (7429), 448-451 (2012).</li>
<li>Taylor, N. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structure+of+the+T4+baseplate+and+its+function+in+triggering+sheath+contraction%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Structure of the T4 baseplate and its function in triggering sheath contraction.</a> Nature. 533 (7603), 346-352 (2016).</li>
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<li>Kohler, A., Zimmerman, E., Schneider, M., Hurt, E., Zheng, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+assembly+and+activation+of+the+heterotetrameric+SAGA+histone+H2B+deubiquitinase+module%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Structural basis for assembly and activation of the heterotetrameric SAGA histone H2B deubiquitinase module.</a> Cell. 141 (4), 606-617 (2010).</li>
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</ol>

Los autores declaran que no hay intereses contrapuestos.

El método descrito permite probar las interacciones proteína-proteína que no se pueden ensamblar eficientemente in vitro y requieren coexpresión. El método es uno de los pocos enfoques adecuados para estudiar proteínas heterodimerizantes, que también son capaces de homodimerización ya que, cuando se purifican por separado, tales proteínas forman homodímeros estables que con mayor frecuencia no pueden disociarse y volver a asociarse durante el experimento 3,11<...

El pulldown convencional es ampliamente utilizado para estudiar las interacciones proteína-proteína1. Sin embargo, las proteínas purificadas a menudo no interactúan eficazmente in vitro2,3, y algunas de ellas son insolubles sin su compañero de unión 4,5. Tales proteínas pueden requerir ensamblaje co-traduccional o la presencia de chaperonas moleculares 5,6,7,8,9. Otra limitación del pulldown convencional es el ensayo de una posible actividad de heteromultimerización entre dominios que pueden existir como homooligómeros estables ensamblados co-traduccionalmente 8,10, ya que muchos de ellos no pueden disociarse y reasociarse in vitro durante el tiempo de incubación. La coexpresión fue encontrada útil para superar tales problemas 3,11. La coexpresión utilizando vectores compatibles en bacterias se utilizó con éxito para purificar grandes complejos macromoleculares de múltiples subunidades, incluido el complejo represivo polycomb PRC212, el módulo13 de la cabeza mediadora de la ARN polimerasa II, la placa base del bacteriófago T4 14, el módulo15,16 de la desubiquitinasa del complejo SAGA y la ferritina17. Los orígenes de replicación comúnmente utilizados para la coexpresión son ColE1, p15A18, CloDF1319 y RSF20. En el sistema de expresión Duet disponible comercialmente, estos orígenes se combinan con diferentes genes de resistencia a antibióticos y sitios de clonación múltiples convenientes para producir vectores policistrónicos, lo que permite la expresión de hasta ocho proteínas. Estos orígenes tienen diferentes números de copias y pueden ser utilizados en combinaciones variables para lograr niveles de expresión equilibrados de proteínas diana21. Para probar las interacciones proteína-proteína, se utilizan varias etiquetas de afinidad; las más comunes son 6xHistidina, glutatión-S-transferasa (GST) y proteína de unión a maltosa (MBP), cada una de las cuales tiene una afinidad específica con la resina correspondiente. GST y MBP también mejoran la solubilidad y estabilidad de las proteínas marcadas22.
También se han desarrollado varios métodos que involucran la coexpresión de proteínas en células eucariotas, el más destacado de los cuales es el ensayo de dos híbridos de levadura (Y2H)23. El ensayo Y2H es barato, fácil y permite probar múltiples interacciones; sin embargo, su flujo de trabajo tarda más de 1 semana en completarse. También hay algunos ensayos basados en células de mamíferos menos utilizados, por ejemplo, el ensayo fluorescente de dos híbridos (F2H)24 y el ensayo de interacción proteína-proteína de matriz celular (CAPPIA)25. El ensayo F2H es relativamente rápido, lo que permite observar las interacciones de proteínas en su entorno celular nativo, pero implica el uso de costosos equipos de imágenes. Todos estos métodos tienen una ventaja sobre la expresión procariota que proporciona la traducción eucariota nativa y el entorno de plegado; Sin embargo, detectan la interacción indirectamente, ya sea por activación transcripcional o por transferencia de energía fluorescente, que a menudo produce artefactos. Además, las células eucariotas pueden contener otros socios de interacción de proteínas de interés, que pueden interferir con la prueba de interacciones binarias entre proteínas de eucariotas superiores.
El presente estudio describe un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente seguido de técnicas convencionales de pulldown. El método permite estudiar las interacciones entre proteínas diana que requieren coexpresión. Es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional, lo que permite la prueba por lotes de múltiples objetivos, lo que lo hace ventajoso en la mayoría de los casos. La coexpresión utilizando vectores compatibles es más conveniente que la coexpresión policistrónica, ya que no requiere un paso laborioso de clonación.

<table><tbody><tr><td>Sonda de 8 elementos</td><td>Sonics</td><td>630-0586</td><td>Las sondas sonicadoras de 8 elementos de alto rendimiento</td></tr><tr><td>Agar</td><td>AppliChem</td><td>A0949</td><td></td></tr><tr><td>Resina de amilosa</td><td>New England Biolabs</td><td>E8021</td><td>Resina para la purificación de proteínas marcadas con MBP</td></tr><tr><td>Antibióticos</td><td>AppliChem</td><td>A4789 (kanamicina); A0839 (ampicilina)</td><td></td></tr><tr><td>Beta-mercaptoetanol</td><td>AppliChem</td><td>A1108</td><td></td></tr><tr><td>BL21(DE3)&nbsp;</td><td>Novagen</td><td>69450-M</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td> <td>Centrífuga AppliChem</td><td>A4689</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R (Z605212)</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión</td><td>AppliChem</td><td>A9782</td><td></td></tr><tr><td>Glutatión agarosa</td><td>Pierce</td><td>16100</td><td>Resina para la purificación de proteínas marcadas con GST</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>AppliChem</td><td>A2926</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A3724</td><td></td></tr><tr><td>HisPur Ni-NTA Superflow Agarose</td><td>Thermo Scientific</td><td>25214</td><td>Resina para la purificación de proteínas marcadas con 6xHis</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>AppliChem</td><td>A1378</td><td></td></tr><tr><td>IPTG</td><td>AppliChem</td><td>A4773</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>AppliChem</td><td>A2939</td><td></td></tr><tr><td>LB</td><td>AppliChem</td><td>414753</td><td></td></tr><tr><td>Maltose</td><td>AppliChem</td><td>A3891</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>AppliChem</td><td>A2947</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>AppliChem</td><td>A2942</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>Roche</td><td>11754599001</td><td></td></tr><tr><td>pACYCDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71147</td><td>Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación de p15A</td></tr><tr><td>pCDFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71340</td><td>Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación de CloDF13</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>AppliChem</td><td>A0999</td><td></td></tr><tr><td>Cóctel de inhibidores de proteasa VII</td><td>Calbiochem</td><td>539138</td><td>Cóctel de inhibidores de proteasa</td></tr><tr><td>pRSFDuet-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>71341</td><td>Vector para la coexpresión de proteínas con origen de replicación RSF</td></tr><tr><td>SDS&nbsp;</td><td>AppliChem</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>Tris&nbsp;</td><td>Sonicada por AppliChem</td><td>A2264</td><td></td></tr><tr><td>VC505 Sonics</td><td></td><td>CV334</td><td>Procesador de líquidos ultrasónico</td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>AppliChem</td><td>A6285</td><td></td></tr></tbody></table>

ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Pulldown Assay Coupled with Co-Expression in Bacteria Cells as a Time-Efficient Tool for Testing Challenging Protein-Protein Interactions

Pulldown es un ensayo de interacción proteína-proteína fácil y ampliamente utilizado. Sin embargo, tiene limitaciones en el estudio de complejos de proteínas que no se ensamblan eficazmente in vitro. Tales complejos pueden requerir ensamblaje co-traduccional y la presencia de chaperonas moleculares; O bien forman oligómeros estables que no pueden disociarse y volver a asociarse in vitro o son inestables sin un compañero de unión. Para superar estos problemas, es posible utilizar un método basado en la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles seguidos por las técnicas convencionales de pulldown. El flujo de trabajo es más eficiente en el tiempo en comparación con el pulldown tradicional porque carece de los pasos que consumen mucho tiempo de purificación separada de proteínas que interactúan y su posterior incubación. Otra ventaja es una mayor reproducibilidad debido a un número significativamente menor de pasos y un período de tiempo más corto en el que las proteínas que existen dentro del ambiente in vitro están expuestas a proteólisis y oxidación. El método se aplicó con éxito para estudiar una serie de interacciones proteína-proteína cuando se descubrió que otras técnicas in vitro no eran adecuadas. El método se puede utilizar para probar por lotes las interacciones proteína-proteína. Se muestran resultados representativos para estudios de interacciones entre el dominio BTB y proteínas intrínsecamente desordenadas, y de heterodímeros de dominios asociados a dedos de zinc.

El método descrito se utilizó rutinariamente con muchos objetivos diferentes. Aquí se presentan algunos resultados representativos que probablemente no se puedan obtener utilizando técnicas convencionales de pulldown. El primero es el estudio de la dimerización específica ZAD (Zinc-finger-associated domain)11. Los ZAD forman dímeros estables y específicos, con heterodímeros posibles solo entre dominios estrechamente relacionados dentro de grupos parálogos. Los dímeros formados por estos dominios s...

Aquí, describimos un método para la coexpresión bacteriana de proteínas marcadas diferencialmente utilizando un conjunto de vectores compatibles, seguido de las técnicas convencionales de pulldown para estudiar complejos de proteínas que no pueden ensamblarse in vitro.

Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

Pulldown is an easy and widely used protein-protein interaction assay. However, it has limitations in studying protein complexes that do not assemble ...

Este método permite estudiar formaciones de complejos proteicos que requieren coexpresión para muestras de prueba eficientes, como la formación de heterodímeros. El principal potencial final de este método es explotar la coexpresión de proteínas estudiadas marcadas diferencialmente utilizando combinaciones de vectores compatibles para promover un ensamblaje complejo eficiente, junto con un flujo de trabajo eficiente y escalabilidad que permita pruebas rápidas de parches de múltiples interacciones. Este método también se puede utilizar para la detección rápida de la expresión óptima de proteínas y las condiciones de purificación.La demostración visual ayuda a realizar correctamente los pasos críticos del protocolo, como la configuración de la coexpresión, la interrupción de la celda y los pasos desplegables posteriores. Para comenzar, cultive la cepa Escherichia coli BL21 (DE3) en medios Luria-Bertani, o LB, a 37 grados centígrados a una densidad óptica, u OD, de 0.1 a 0.2. Centrifugar un mililitro de la suspensión bacteriana durante un minuto a 9, 000 G a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante.Luego, agregue 0.5 mililitros de tampón de transformación helada, o TB, e incube durante 10 minutos en hielo. Al final de la incubación, centrifugar durante 30 segundos a 8, 000 G a cuatro grados centígrados y desechar el sobrenadante. Luego, agregue 100 microlitros de tampón de TB, 100 nanogramos de cada vector e incube durante 30 minutos en hielo.Calentar a 42 grados centígrados durante 150 segundos, luego enfriar en hielo durante un minuto. A continuación, agregue un mililitro de medios LB sin antibióticos e incube a 37 grados centígrados durante 90 minutos. Después de la incubación, centrifugar y resuspender el pellet en 100 microlitros de medios LB antes de colocar la suspensión en una placa de agar LB que contenga 0,5% de glucosa y los antibióticos correspondientes.Incubar el plato durante la noche a 37 grados centígrados. Al día siguiente, enjuague las células de la placa con dos mililitros de medios LB en 50 mililitros de medios LB con los antibióticos correspondientes. Agregue iones metálicos u otros cofactores conocidos antes de almacenar una alícuota con 20% de glicerol a menos 70 grados centígrados para experimentos posteriores.Haga crecer las células con una rotación constante de 220 RPM a 37 grados centígrados a un OD de 0.5 a 0.7. Enfriar el cultivo a temperatura ambiente y añadir IPTG a una concentración final de un milimol. Almacenar una alícuota de 20 microlitros de suspensión celular como control de la muestra no inducida.Incubar las células durante la noche a 220 RPM a 18 grados centígrados. Al día siguiente, divida la suspensión bacteriana en dos partes y almacene alícuotas de 20 microlitros para confirmar la expresión de proteínas. Centrifugar la suspensión celular restante a 4, 000 G durante 15 minutos.Para el ensayo de extracción, resuspenda los gránulos en un mililitro de tampón de lisis helada con inhibidores de la proteasa y agentes reductores agregados inmediatamente antes del experimento. Ajuste la composición tampón para las proteínas probadas. Interrumpir las células por sonicación en hielo y almacenar una alícuota de 20 microlitros para electroforesis.Centrifugar a 16, 000 G durante 30 minutos y recoger 20 microlitros del lisado clarificado para la electroforesis. Equilibre la resina con un mililitro de tampón de lisis helado durante 10 minutos, luego centrifugar a 2, 000 G durante 30 segundos y desechar el sobrenadante. Añadir lisados celulares a la resina e incubar durante 10 minutos a una rotación constante de 15 RPM.Luego, centrifugar y desechar el sobrenadante antes de recolectar 20 microlitros de la fracción no unida para su análisis. A continuación, agregue un mililitro de tampón de lavado helado e incube durante un minuto. Nuevamente, centrifugar y desechar el sobrenadante.Luego, realice dos lavados largos con tampón de lavado helado. Después del segundo lavado, eluya las proteínas unidas con 50 microlitros del tampón de elución en un agitador a 1, 200 RPM a cuatro grados Celsius durante 10 minutos. Analizar las proteínas eluyentes con electroforesis en gel de poliacrilamida SDS.Aquí se muestran estudios del dominio asociado a los dedos de zinc, o ZAD, homo-dimerización en proteína de unión a maltosa, o MBP, y ensayos de pulldown de 6xHistidina. La coexpresión de MBP y TIORREDOXINA 6xHistidine-fused ZADs muestra una actividad de homodimerización buena y reproducible, apareciendo como una banda adicional en los resultados de SDS-PAGE del ensayo pulldown MBP. Aquí se muestra otro ejemplo del uso del método para estudiar la formación compleja alternativa.En el ensayo de coexpresión, 6xHistidina-tagged ENY2 interactuó tanto con GST-tagged Sgf11 como MBP-CTCF, pero no GST-Sgf11 estaba presente en los desplegables MBP y viceversa. Aquí se muestra una comparación paso a paso de los intervalos de tiempo requeridos en el flujo de trabajo del ensayo pulldown convencional en comparación con el pulldown acoplado a la coexpresión. Aquí se muestran los resultados de la utilización de ambas técnicas para estudiar la misma interacción entre el dominio BTB de la proteína CP190 y el dominio C-terminal marcado con GST de la proteína CTCF de Drosophila.La elección correcta de la prueba de afinidad y solubilidad, tiorredoxina, GST o MBP, es fundamental para la ejecución eficiente del ensayo. Otro paso crítico es la interrupción celular rápida y uniforme. Se recomienda encarecidamente utilizar sondas sonicadoras de múltiples puntas.Este método permite el estudio directo de la formación de heterodímeros entre dominios proteicos que de otro modo forman homodímeros que no se disociarían durante la incubación de proteínas purificadas en el ensayo de pulldown convencional.

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Pruebas de interacción proteína-proteína es indispensable para la disección de la funcionalidad de las proteínas. Aquí, presentamos...

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Ensayo homogéneo de proximidad luminiscente amplificado: un ensayo de proximidad basado en perlas para cribar moléculas pequeñas que inhiben las interacciones proteína-proteína

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Aprende el ensayo pulldown con coexpresión en células bacterianas para estudiar interacciones proteína-proteína desafiantes. Este método permite el ensamblaje eficiente de complejos proteicos heterodiméricos.

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Ensayo pulldown junto con coexpresión en células bacterianas como una herramienta eficiente en el tiempo para probar interacciones desafiantes proteína-proteína

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