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Summary
这里介绍的是一种协议，使用由磁共振引导的高强度聚焦超声产生的受控热疗来触发横纹肌肉瘤小鼠模型中温度敏感脂质体的药物释放。
Abstract
磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）是一种产生局部热疗的既定方法。考虑到实时成像和声能调制，这种模式可以在定义的区域内实现精确的温度控制。这种非侵入性、非电离技术正在探索许多热应用，例如热疗产生，以从热敏脂质体载体中释放药物。这些药物可以包括化疗，如阿霉素，由于剂量限制性全身副作用，即心脏毒性，需要靶向释放。多柔比星是治疗多种恶性肿瘤的主要药物，通常用于复发或复发性横纹肌肉瘤 （RMS）。RMS是儿童和年轻人中最常见的实体性软组织颅外肿瘤。尽管进行了积极的多模式治疗，但RMS存活率在过去30年中保持不变。为了探索解决这一未满足需求的解决方案，开发了一种实验方案，以评估使用MRgHIFU作为药物释放热疗源的免疫功能正常的同系RMS小鼠模型中热敏脂质体阿霉素（TLD）的释放。
Introduction
横纹肌肉瘤 （RMS） 是一种骨骼肌肿瘤，最常见于儿童和年轻人1.局部疾病通常采用多模式治疗，包括化疗、电离放疗和手术。多药化疗方案的使用在儿科患者中更为普遍，与成人患者相比，结局有所改善2;然而，尽管正在进行研究努力，在最具侵略性的疾病中，5 年生存率仍保持在 30% 左右3，4。化疗标准治疗是一种多药方案，包括长春新碱、环磷酰胺和放线菌素 D。在疾病复发或复发的情况下，使用替代化疗，包括标准（游离）多柔比星 （FD） 和异环磷酰胺1。虽然所有这些化疗都具有全身毒性，但阿霉素的心脏毒性施加了终生剂量限制5-7。为了增加递送到肿瘤的药物量并尽量减少全身毒性，已经开发了替代制剂，包括脂质体包封。这些可以是非热敏性阿霉素，已被批准用于治疗乳腺癌和肝细胞癌，也可以是热敏性阿霉素，其临床试验正在进行中8，9，10，11，12，13。递送脂质体包封药物的替代方法，例如多泡脂质体和配体靶向脂质体已经得到评估，并显示出治疗肿瘤的希望9。在这项研究中，热量的增加具有多因素影响，包括药物释放14。热疗（HT）与磁共振引导的高强度聚焦超声（MRgHIFU）和热敏脂质体阿霉素（TLD）的组合是一种新颖的多模式治疗方法，用于使用这种有毒但有效的药物治疗RMS，同时最大限度地减少剂量限制毒性并可能增加对肿瘤的免疫反应。
阿霉素在>39°C的温度下从TLD迅速释放，远高于人体平均体温37°C，但不足以引起组织损伤或消融;这在43°C时开始发生，但随着温度接近60°C15，发生得更快。已经使用了多种方法在体内产生HT，包括激光，微波，射频消融和聚焦超声，其中许多是侵入性加热方法16。MRgHIFU是一种无创、非电离的加热方法，有助于在原位目标组织内精确设置温度。磁共振（MR）成像至关重要地提供了实时成像，其中可以使用计算机软件来计算整个治疗过程中组织的测温测量值;随后，该数据可用于实时控制超声治疗以达到并保持所需的温度设定点17。MRgHIFU已在各种组织类型中进行了测试，可用于从轻度激素疗法到消融术的各种温度治疗，以及临床上成功治疗疼痛的骨转移18。此外，HT已被证明可引起肿瘤细胞毒性，调节蛋白表达并改变肿瘤微环境中的免疫反应19，20，21，22。一项研究将轻度激素疗法与TLD相结合，然后用MRgHIFU消融，在协同R1大鼠模型23中，导致肿瘤核心坏死和药物输送到外围。传统上，放疗被用作辅助疗法，以破坏肿瘤细胞并减少局部疾病复发。然而，它的使用受到终生剂量和脱靶损伤的限制1.因此，HT的独特之处在于它可以引起一些相同的效果而没有相同的毒性或限制。
RMS的临床前动物模型包括免疫功能低下宿主中的同源免疫功能模型和患者来源的异种移植物（PDX）。虽然免疫功能低下的模型允许人类肿瘤的生长，但它们缺乏适当的肿瘤微环境，并且研究免疫反应的能力有限24。FGFR4 激活突变是预后不良的有希望的标志物，也是成人和儿童 RMS1，25 的潜在治疗靶点。在Gladdy实验室开发的同源RMS模型中，肿瘤能够在免疫功能正常的宿主中生长，该宿主对肿瘤产生先天性和适应性免疫反应26。由于HT影响免疫应答，观察小鼠免疫应答的变化是该肿瘤模型的宝贵优势。为了测试肿瘤对TLD的反应与FD相比，以及肿瘤对化疗和激素疗法的免疫反应的变化，开发并采用一种方案使用MRgHIFU和TLD治疗 体内 同系鼠RMS肿瘤，这是本研究的重点。
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Protocol
研究是在表型基因组学中心（TCP）和大学健康网络（UHN）动物资源中心（ARC）动物研究设施的监督兽医的监督兽医的监督下按照动物护理委员会批准的动物使用方案进行的。所有涉及动物的程序，不包括MRgHIFU，都是在生物安全柜（BSC）中进行的，以尽量减少动物暴露于外部空气或易感染。
1.小鼠育种
注意：共有65只小鼠（菌株B6.129S2-Trp53tm1Tyj / J）被纳入试点研究（雄性：n = 23;雌性：n = 42）。雄性和雌性小鼠均在7-9周龄时使用。他们的幼崽断奶并进行基因分型，p53杂合子小鼠用于实验。
- 每只雄性小鼠饲养两只雌性小鼠以创建繁殖笼。计算幼崽从出生开始的年龄（出生=第0天）。
- 在第 10 天，用耳朵缺口识别幼崽。在细胞系注射之前收集尾剪进行基因分型。
2. 小鼠基因分型
- 按照制造商的说明，使用商业 DNA 提取试剂盒（参见 材料表）从收集的 2 mm 尾部剪片中提取 DNA。
- 通过在分光光度计上测量260-280nm处的吸光度来确定DNA浓度和纯度（参见 材料表）。
- 进行聚合酶链反应（PCR）。
- 对于所需数量的样品，以 12.5：0.25：10.75 （μL） 的比例创建含有商业 PCR 混合物（含有 Taq 聚合酶、dNTPS 和 MgCl 2;参见材料表）、引物和 dH2 O 的预混液。向每个 PCR 管中加入 1 μL DNA 样品，并包括 dH2O、一个空样品（p53 突变的纯合子）、一个杂合子样品（p53 突变的杂合子）和一个野生型（正常 p53 的纯合子）样品作为 PCR 对照。
- 向每个含有 DNA 的 PCR 管中加入 24 μL 预混液。上下移取每个PCR管中的溶液，以在整个预混液中分布DNA。
- 将反应管置于热循环仪中并按照以下规格循环：95°C2分钟，40个循环，95°C15秒，60°C15秒，72°C1分钟，然后保持在4°C直到准备好在凝胶上分析。
- 使用琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。
- 通过在TAE中加热琼脂糖并混合直至溶解，制备2%凝胶（50 mL 1x TAE和1g琼脂糖）。冷却后仍为液体时，向琼脂糖中加入 2.5 μL DNA 凝胶染色剂并混合。将凝胶投射在带梳子的凝胶盒中。将凝胶放入电泳设备（参见 材料表）中并用1x TAE覆盖。
- 在凝胶上加载 10 μL 1 kB DNA 分子量标准。每个样品上样 12.5 μL。在135 V下运行凝胶25分钟。
- 根据制造商的说明，使用凝胶成像仪上使用所用DNA凝胶染色剂的适当设置对凝胶进行成像（参见 材料表）。
3.肿瘤模型制备（图1）
- 在注射日期前1周在完全生长培养基（Dulbecco的改良鹰培养基[DMEM]，添加添加剂：10%FBS，1%青霉素/链霉素和2mM L-丙氨酰-L-谷氨酰胺二肽）中，在37°C和5%CO2下，在注射日期前1周在完全生长培养基（Dulbecco的改良鹰培养基[DMEM]）中培养M25FV24C细胞系（传代12-15）。一旦细胞~80%汇合，吸出培养基并用5mL的Dulbecco磷酸盐缓冲盐水（DPBS）洗涤细胞1x。
注意：M25FV24C 是一种鼠细胞系，经过工程改造，用于过表达突变型 FGFR4V550E，在儿童和成人 RMS1，26 中观察到。 - 通过在板侧面加入0.5mL的0.25%胰蛋白酶溶液并在室温下孵育容器2-3分钟来提起细胞。一旦细胞出现分离，在室温下加入 2.5 mL 完全生长培养基以灭活胰蛋白酶。使用 10 μL 样品等分试样，使用血细胞计数器和台盼蓝排除法测定活细胞的细胞浓度。
- 准备正确体积的DPBS悬浮细胞进行注射，并放入1.5mL微量离心管中：离心体积=（小鼠数量×每只小鼠的细胞数）/（细胞浓度），其中小鼠数量=要注射的小鼠+10只额外的错误小鼠，每只小鼠的细胞数= 104。
- 以153 x g 离心5分钟。将细胞沉淀重悬于适当体积（每只小鼠10μL×小鼠数量）的肌注射缓冲液（F10培养基+ 0.5%FBS）中，并在制备该悬浮液后1小时内注射小鼠。
4.肌内细胞注射
注意：将M25FV24C细胞注射到4至6周龄小鼠的右后肢。在 4 周时注射会产生一只带有肿瘤的小小鼠，由于用于 HT 分散的周围组织较少，因此可能更难治疗;等到6周产生更大的小鼠，使其更容易治疗肿瘤。
- 在抽吸之前将细胞悬液倒置数次，以帮助细胞在溶液中均匀分布。使用微升注射器吸出10μL（104 个细胞）（参见 材料表）。擦拭鼠标;一旦被束缚，可以通过伸展后腿来获得大腿尾部肌肉的通道。用剪刀剃腿，用70%乙醇擦拭。
- 使用带有26s G针头的气密微升注射器将M25FV24C细胞悬液（10μL，10 4个细胞）注射到4-6 周龄小鼠的右后肢大腿肌肉组织中。
注意：针头应平行于股骨朝膝盖插入，注意不要撞到坐骨神经。由于后肢的肌肉质量小，仅插入针尖（约2毫米）。 - 以稳定的动作管理溶液。取下针头并确保不会出血。将鼠标放回第二个笼子。
- 每天评估动物，并通过触诊监测它们的后肢肿瘤生长。如果遇到以下任何早期终点，则使用二氧化碳对小鼠实施安乐死：肿瘤直径超过1.5厘米，肿瘤溃疡或全身性疾病体征（毛发竖立，驼背姿势，不活动或食物或水摄入量减少）。
5. 筛查磁共振扫描
- 麻醉小鼠，在以下参数下用异氟醚挤压到没有爪子挤压运动的水平：在1.5LPM下以4%的腔室诱导，然后转移到MRI扫描仪雪橇上的鼻锥，并在0.75LPM下继续在鼻锥上以1.5%-2%维持异氟醚。安装呼吸监测器。在眼睛上使用兽医软膏以防止麻醉时干燥。
- 使用MRI扫描仪对麻醉的小鼠进行成像（参见 材料表）。在T2加权图像（Ax_Screen采集， 表1）上，记下面内尺寸和肿瘤出现的轴向切片数。注意肿瘤相对于股骨和大腿侧表面的位置，超声波将进入那里。
注意：肿瘤表现为肌肉内的高信号肿块，从另一侧不对称。对于急性或生存研究，多次治疗的良好起始肿瘤大小为 2 mm x 2 mm x 2 mm。如果它大得多，它只对急性研究有好处，因为肿瘤将在完成每周三次治疗之前达到大小终点。HIFU治疗的排除标准包括：缠绕在股骨周围，太靠近股骨，在小鼠上太靠后，在股骨内侧，太靠近直肠。 - 从扫描仪中取出鼠标并获得基线重量。在麻醉下用电动剃须刀将鼠标从中间身体剃到脚。
注意：理想情况下，剃须在治疗前 1 天完成，因为它允许小鼠进行梳理，从而使脱毛膏更有效地工作。 - 使用笼子一端下方的加热垫恢复平衡计分卡中的鼠标。当鼠标恢复胸骨卧位时，将鼠标放回笼子。
6.实验：HIFU治疗日动物制剂
- 要准备小口径HIFU（见 材料表）系统，请打开发生器并用足够的去离子水填充换能器，直到膜在换能器下方膨胀，但不要太硬以至于会压缩鼠标。将换能器电路中的水脱气30分钟以除去介质中的溶解氧。
- 准备关联的计算机系统。
- 打开控制计算机，确保它 通过 以太网连接到HIFU发生器， 并通过 USB连接到热探头显示器。启动软件，在插入鼠标之前单击“主页”到“ 主页 ”传感器。
- 校准光纤热探头：获取基线室温并注意MRI室的温度变化。注意每个探头由于磁场强度引起的温度漂移大小。将漂移管温度探头插入钆填充玻璃管中，以便在扫描过程中进行温度校准，并用胶带固定漂移管。
注意：基线室温（漂移管）作为测温参数手动添加到软件的GUI中。在MR图像的漂移管内设置一个感兴趣区域（ROI），以检测任何温度漂移，并将自动校正测温图像。 - 将要注射的药物拉入1mL注射器中，并将其放入自动输送泵中（见 材料表）。通过按下自动输送泵上的手动输送按钮，启动将连接到小鼠尾静脉导管的管路，直到药物完全充满管路。
- 在转移到麻醉室之前，使用加热灯加热笼中的小鼠~20分钟。
注意：预热促进血管舒张，一旦小鼠麻醉并有助于导管放置，就会遇到血管舒张。
- 用异氟醚麻醉小鼠（诱导：1.5LPM时4%;维持：0.75LPM时1.5%-2%）并转移到鼻锥。在眼睛上涂抹角膜润滑剂，以防止由于麻醉下缺乏眨眼反射而造成的损害。
- 在剃须区域（包括整个右后肢）涂抹脱毛膏，并按照制造商的说明进行脱毛。
注意：在BSC中时将鼠标放在加热灯下，以帮助在麻醉下脱毛期间进行体温调节。 - 用温水洗掉脱毛膏后，在数字秤上称量小鼠并记录药物剂量。
- 将鼠标移动到 MRI 托架上兼容 MRI 的鼻锥上。在准备 MRI 时将加热灯放在鼠标上以保持温暖。将小鼠置于侧卧位置，非肿瘤轴承面朝下，肿瘤上部位于雪橇上的3D打印小鼠支架内（补充图1 和 图2）。确保肿瘤的正确定位（即，水平和垂直在线圈的中心，高度刚好在鼠标支架边缘上方，以考虑超声换能器的压缩）。
注意：如果需要，切下压缩的超声凝胶垫段放在鼠标下方，衬在支架的底部，厚度使肿瘤水平到支架的顶部。 - 将未受累的腿从肿瘤腿上塞开，要么在小鼠下方，要么在肿瘤腿弯曲的情况下伸展。确保脚不在肿瘤和超声束路径的近场或远场。将加热灯放置在距离尾部 15 厘米处以加热，以便将导管插入尾静脉。
- 插入食管温度探头。
- 将食管探头穿过鼻锥并擦拭小鼠的颈部。将鼠标鼻子向上倾斜，通过伸展头部从嘴巴直接到胃部形成一条线。将舌头上方的热探头滑入小鼠食道约0.5厘米，并更换小鼠鼻子周围的鼻锥。将食管探头和鼻锥固定在雪橇顶部。
注意：插入后立即监测呼吸窘迫的迹象，因为它可能不正确地插入气管。
- 将食管探头穿过鼻锥并擦拭小鼠的颈部。将鼠标鼻子向上倾斜，通过伸展头部从嘴巴直接到胃部形成一条线。将舌头上方的热探头滑入小鼠食道约0.5厘米，并更换小鼠鼻子周围的鼻锥。将食管探头和鼻锥固定在雪橇顶部。
- 插入直肠温度探头。
注意：直肠和食管温度探头之间的距离应在3°C以内。 - 将带有连接电缆的呼吸监测器朝向鼠标头部，以免干扰超声换能器的放置。用胶带固定。
- 将 27 G 蝶针尾静脉导管插入连接到微管的侧尾静脉中，具有 20 μL 死区并牢固地贴上胶带。贴上胶带后，确保导管冲洗良好。
- 用两人将准备好的小鼠、鼠标雪橇、麻醉线、呼吸线、尾静脉导管和热探头线带入MRI扫描仪，并放入MRI雪橇支架中。
- 让HIFU软件（见 材料表）操作员通过目视检查将换能器的弯月面直接移动到肿瘤上以进行初始对齐27。将眼睛润滑剂或脱气超声凝胶涂抹在肿瘤上方的无毛皮肤上，并将HIFU换能器耦合到肿瘤区域。
- 将药物输送管线从自动泵连接到尾静脉导管。计算尾静脉线和连接线中的死区量。将MRI导轨上的鼠标HIFU滑板滑入MRI的中心。
- 根据药物类型和浓度以及动物的重量，设置泵上的药物输注量，并添加死区量。将泵设置为200μL/min的输注速率。
注意：在本研究中，FD和TLD的使用浓度为2mg / mL，剂量为5mg / kg体重。 - 记录基线热探头温度。
- 将空气对流加热装置（见 材料表）置于最温暖的设置上。将管子吹向MRI孔中心的鼠标，并用胶带固定。加热装置稍后将转到其最低设置（32°C），以防止在超声处理过程中鼠标过热。
- 获取调查MR图像（Ax_Loc，Sag_Loc; 表 1）确定超声靶向的肿瘤位置，包括深度。使用HIFU软件相应地调整换能器位置，方法是在图像上插入测量的所需移动距离，然后单击箭头方向进行移动（图3A）。还要注意漂移管的位置。根据需要重复此操作。
- 在Test_Shot测温采集过程中，通过执行简短的5 s x 50 mV振幅连续“试射”超声处理，确定探头在冠状平面中焦点的位置（表1）。
- 将 MR 测量图像与 HIFU 软件中焦点的日冕视图对齐。查看相对于骨结构和直肠的肿瘤位置的图像，并根据需要修改换能器位置。
- 在九次重复Therm成像期间重复测试射击超声处理（表1），以确认肿瘤体积中是否存在均匀和准确的加热，并且脱靶加热最小。调整切片位置、传感器位置和转向深度，并在必要时通过重复“测试镜头”来确认加热性能。
- 使用HIFU处理监测软件，通过测量移动距离，然后在程序中改变网格坐标，定义最终加热曲线内温度监测的ROI。在漂移管周围设置ROI以进行漂移校正。根据直肠探头温度输入基线温度以进行测温。HIFU系统用于启动HIFU处理超声处理和温度监测。
- 在软件中打开20分钟的热疗治疗规格，并在收集参考MR图像并开始测温后开始超声处理。
- 使用内置的比例积分微分（PID）控制器软件在Therm成像（表1）期间进行20分钟的处理（图3B）。在ROI中的温度升温至所需温度（40°C）后，在1.5分钟注射所选药物。
- 在整个治疗过程中监测核心温度。如果在治疗期间直肠温度迅速升高，可能需要重新调整小鼠体位以避免在 10 或 20 分钟的治疗时间内直肠升温。如果直肠温度升高到>40°C，请停止治疗。
7. 实验：用于急性研究的小鼠模型成像和超声程序
- 治疗完成后，将鼠标从MRI孔中取出，确保尾静脉导管插入部位止血。将小鼠转移到BSC上并放在鼻锥上继续麻醉。
- 将鼠标仰卧在蓝色吸收垫上，四肢被束缚，心脏暴露在外。
- 通过心脏穿刺 放 血，然后切除心脏，对小鼠实施安乐死。立即取血，以10，621× g 离心血浆分离10分钟。
- 进行尸检并根据需要储存器官以进行分析。将器官冷冻在液氮中，并在-80°C下储存数月或在液氮罐中长期储存。
- 通过添加九倍过量（w / w）的去离子水并使用珠子跳动均质器分解组织来机械均质肿瘤组织。依次加入 75 μL 300 mg/mL 硝酸银、75 μL 10 mM 硫酸和 2.5 mL 1：1 异丙醇：氯仿，从 600 μL 匀浆组织中提取阿霉素。涡旋20分钟并在-20°C下储存过夜。
- 为了制备用于高效液相色谱（HPLC）的样品，将步骤7.5中的溶液以4，500× g离心，除去有机溶剂层，并在氮气流下干燥异丙醇：氯仿。重悬于 100 μL 的 2：1 MeOH：H2O 中，使用 HPLC-MS/MS28 测量阿霉素浓度。
8. 实验：用于生存研究的小鼠模型成像和超声程序
注意：对于生存研究，请遵循HIFU治疗日动物准备程序（步骤6.1至6.25）。
- 完成治疗后，将鼠标放在加热灯下以使其恢复，并监测其呼吸和运动，直到它恢复胸骨卧位。然后，将动物放回笼子里。
注意：确保笼子的一半与加热灯对齐，因为动物的热调节受到麻醉和激素疗法的影响。 - 每天监测小鼠的行为、喂养模式和呼吸频率是否有任何痛苦迹象。
- 按照步骤6.1至6.25每周进行一次治疗，连续3周。
- 每周两次，对小鼠进行MRI成像以进行肿瘤测量。在治疗期间的几周内，每周进行一次 MRI 扫描和一次超声波检查。治疗完成后，每两周进行一次超声成像。
- 在完成一系列治疗后60天或达到人道终点（肿瘤大小>1.5cm3 或肿瘤发病率）时对小鼠实施安乐死，然后进行尸检并切除肿瘤和器官进行分析。
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Representative Results
使用MRgHIFU生成的热疗方案，后肢肿瘤能够在治疗期间持续加热到所需的设定温度（图4 显示了代表性治疗，10或20分钟，n = 65）。为了认为治疗成功，整个治疗过程中的ROI必须保持在39°C以上，在整个治疗过程中变化<6°C，并且不加热脱靶组织。此外，根据直肠探头或起始直肠温度加上食管探头温度的变化，核心温度必须保持在39°C以下（补充图2）。一旦MRgHIFU的超声处理停止，肿瘤迅速恢复到基线温度。
将肿瘤靶向至40.5°C以达到快速药物释放的温度，同时避免超过43°C的累积温度效应。 所有治疗肿瘤中ROI的平均温度为40.6°C（n = 65），第10百分位数和第90个百分位数体素之间的平均差异为4.3°C。 在10和20分钟处理期间，平均温度的标准偏差为1.3°C（图5）。在研究期间，满足纳入标准的治疗成功率从11%显着提高到100%（图6）。
优化治疗方案后，与正常变温（NT）小鼠相比，评估热疗持续时间的药物释放效果。为了确定进一步研究的最佳热疗时间，测试了两种治疗持续时间：10分钟和20分钟。选择这些持续时间是为了持续维持核心正常体温和肿瘤高热的可行性。使用高效液相色谱和质谱（HPLC-MS）评估肿瘤中阿霉素的量，并量化测试持续时间之间阿霉素积累的差异。与TLD 20分钟NT小鼠相比，20分钟HT + TLD治疗小鼠肿瘤中阿霉素初始剂量（%ID）的百分比显着更高（图7，q = 0.000108）。10 分钟和 20 分钟 HT + TLD 组之间没有显著差异;然而，与20分钟组相比，10分钟治疗组的标准偏差更大（肿瘤为3.698 vs 2.065 %ID/g）。值得注意的是，在 10 分钟 HT + TLD 处理组中有四个接近零的值，它们都用单批 TLD 处理。TLD在用于 体内 实验之前进行了表征，如Dunne等人之前所描述的28。简而言之，TLD在大小，zeta电位，熔解相变温度和药物浓度方面进行了表征，并且在4 °C下储存72 h内使用脂质体。 尽管所有批次的TLD在使用前都经过了测试，但脂质体可能在实验设置期间释放了阿霉素，在使用之前。此外，扫描过程中的运动会导致软件中温度计算错误地升高，从而使肿瘤过热并导致药物释放降低。或者，如果从未注射药物，例如，如果尾静脉导管被移除或放置不当，也可能导致错误的低值。如上所示，MRI滑板的设置包括温度探头插入（直肠和食管），尾静脉导管插入和呼吸监测器放置，然后将雪橇，小鼠，尾静脉导管，三个光纤温度探头，呼吸监测器和麻醉线移动到MRI孔中。在此过程中，尾静脉导管可以移位的多个时间点。这是通过检查血液回流到管线，导管插入部位出血以及治疗后药物在胶带下积聚来控制的，但错误仍然存在。
图1：HT持续时间研究的动物治疗和相关治疗组的实验方案。 小鼠在其右后肢注射M25FV24C细胞，并在2-3周后使用MRI筛选肿瘤形成。然后将它们分为常温（非HT）或热疗（HT）组，TLD或FD持续时间为10或20分钟。 缩写：Dox = 多柔比星。 请点击此处查看此图的大图。
图2：HIFU治疗期间的小鼠设置 。 （A）一个3D打印支架（白色），带有内部橡胶衬里（红色）和一个切口，允许超声波束通过鼠标定位。（B）在3D打印的鼠标支架内设置鼠标，带有直肠温度保持（绿色电缆），尾静脉导管（白色）和呼吸监测器（蓝色）。（C）在手术过程中将鼠标定位在MRI HIFU床上。 请点击此处查看此图的大图。
图3：MRIgHIFU治疗期间MRI中的小鼠。 （A）肿瘤（橙色圈出）和用于测量环境温度的漂移管（浅蓝色圈出）可见。（B）在治疗过程中，测温温度测量值叠加在MRI图像上。 请点击此处查看此图的大图。
图4：治疗期间监测的温度（°C）。ROI 中所有体素的平均（绿色）、前 10 个百分位数（红色）和前 90个百分位数（青色）温度。请点击此处查看此图的大图。
图5：在优化阶段测试的每只小鼠在ROI内的治疗期间的平均温度，在治疗期间的标准偏差。 还显示了治疗期间的总体平均温度和标准偏差（橙色）。 请点击此处查看此图的大图。
图6：热疗治疗的成功率随着时间的推移而提高。 治疗成功与否取决于纳入标准（全身温度、肿瘤温度和随ROI的变化，以及无远端加热）。蓝线=治疗成功的小鼠百分比。橙色条=用HT治疗的小鼠数量。每个处理（处理1-6）是指进行实验的单独日期。 请点击此处查看此图的大图。
图7：药物治疗后肿瘤中阿霉素的量。 （A）多次曼-惠特尼试验与FDR校正，用于HPLC-MS结果的多次比较，表明20分钟TLD + HT组肿瘤中阿霉素的量与NT对照相比具有显着性（q < 0.05）。（B）FD组的肿瘤没有差异。%ID = 初始剂量的百分比。= q < 0.0001。缩写：HT = 热疗，NT = 正常体温。 请点击此处查看此图的大图。
| 序列名称 | Ax_Screen | Ax_Loc | Sag_Loc | Cor_TestShot | 热 |
| 序列类型 | T2w 稀有度 | T2w 稀有度 | T2w 稀有度 | 闪光 | 闪光 |
| 取向 | 轴的 | 轴的 | 矢 状 | 冠 状 | 轴向/矢状面 |
| 回波时间（毫秒） | 40 | 72 | 72 | 6 | 6 |
| 重复时间（毫秒） | 3200 | 4500 | 4500 | 39.06 | 39.06 |
| 翻转角度（度） | 90/180 | 90/180 | 90/180 | 10 | 10 |
| 视场角（毫米） | 约28.8 x 28.8 | 约36 x 36 | 约35 x 35 | 约35 x 35 | |
| 矩阵大小 | 约128 x 128 | 约128 x 128 | 约128 x 128 | 约128 x 128 | 约128 x 128 |
| 分辨率（毫米） | 约0.225 x 0.225 | 约0.281 x 0.281 | 约0.281 x 0.281 | 0.273 x 0.273 | 0.273 x 0.273 |
| 切片数 | 20 | 20 | 20 | 3 | 2 |
| 切片厚度（毫米） | 1 | 1 | 1 | 1.5 | 1.25 |
| # 平均值 | 3 | 1 | 1 | 1 | 1 |
| # 重复 | 1 | 1 | 1 | 9 | 9 或 300 |
| 扫描时间 | 4 分 0 秒 | 1 分 12 秒 | 1 分 12 秒 | 45 秒 | 25 分 |
表 1：具有相关序列名称的 MRI 捕获参数。
补充图1：带有内部橡胶衬里（红色）的3D模型鼠标支架（白色）。 尺寸：长度 = 43 毫米，外半径 = 15 毫米，内宽 = 20.7 毫米。 请 点击这里下载此文件。
补充图2：治疗期间监测的温度（°C）。 通过直肠（蓝色）和食管（橙色）探头测量核心温度。 请点击此处下载此文件。
补充编码文件1： 鼠标支架的3D打印文件。 请点击此处下载此文件。
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Discussion
本文开发的方案用于使用MRgHIFU靶向后肢肿瘤进行轻度激素疗法治疗，并从体内脂质体中释放包封的药物 。 在试点研究期间，该协议中遇到了几个关键步骤，优化这些关键步骤可以提高试点研究的治疗成功率。首先是完全去除要超声处理的区域上的毛发。皮毛内的任何气体捕获都会阻止超声波束通过并阻止超声波进入目标组织1.其次，小鼠定位对于成功治疗至关重要;肿瘤应放置在小鼠支架的上部，以便与超声换能器更紧密地接触。此外，骨结构应定位在超声束路径之外，而不会伤害小鼠。骨骼已被证明可以有效地吸收超声波，随后充当 原位 加热源。它会影响加热曲线，同时阻止超声转导到感兴趣的区域4。对侧肢体也应放置在超声路径之外，方法是将腿部塞到身体其他部位下方，或者将其伸展并用超声凝胶或凝胶垫填充两腿之间的空气。直肠也必须远离超声波的路径，以避免温度探头的脱靶加热和反射。仔细定位肿瘤是完成成功治疗的最重要步骤。
正确定位后，必须小心放置食管温度探头，以避免气管阻塞。将鼠标插入MRI孔时，尾部导管和注射泵导管之间的金属连接枢纽应用胶带固定在成像区域的远端，以避免产生伪影。超声换能器的位置应使其与腿部的无毛区域接触，并且不会移位呼吸监测器。小鼠生存需要仔细监测治疗期间小鼠的核心体温并随后调整对流加热系统。由于某些小鼠的直肠和肿瘤靠近，添加食管探针对于确定核心温度变化很重要，因为直肠温度只能反映局部加热，而不是核心体加热。
在设计和实施该协议时，多学科团队成功执行了广泛的故障排除。对于小鼠定位，设计并3D打印了小鼠支架以在大鼠MRI雪橇上使用，以允许小鼠周围的温暖空气流动以进行程序内体温调节。该支架的材料是根据它们在允许超声转导的同时牢固地握住鼠标的能力来选择的。印刷支架内的橡胶插件允许单独调整鼠标，而底部的切口可防止超声波反射和意外加热。
该模型存在局限性，例如肿瘤与附近的结构（股骨）和直肠的接近程度，这些结构可以分别吸收或反射超声波。股骨的意外加热会导致骨髓破坏和疼痛，而直肠空气中的超声波反射会导致局部发热和组织损伤。此外，在存活小鼠中，由于治疗后的皮肤再生，存在捕获超声波的情况，导致皮肤局部发热。怀疑这是由于空气滞留在毛囊周围，而毛囊没有被换能器和皮肤之间的超声凝胶移位。在每种情况下，皮肤看起来比周围的无毛皮肤更黑。在这些小鼠肢体的免疫组织化学切片上，在表皮内看到了毛发，但没有发现肿瘤纤维化或其他解释为什么超声波无法穿过皮肤和皮下组织。
随着该协议的发展，计划进一步研究扩展模型系统以测试其他儿科实体瘤，例如骨肉瘤和粘液纤维肉瘤，以用HT和TLD治疗。这是有希望的，因为这些患者在这种临床背景下可能会面临治疗选择有限的衰弱疼痛。该协议可以扩展到位于四肢的其他实体瘤类型，这些实体瘤类型可通过MRgHIFU29，30靶向。总之，数据支持热敏脂质体的组合可以外推以封装其他形式的化疗或药物，其中靶向药物递送将是有益的，并且具有无创加热形式，如MRgHIFU，将是理想的。
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Disclosures
作者没有经济利益或利益冲突需要披露。
Acknowledgments
我们要感谢该项目的资金来源和参与人员，包括：C17研究补助金，加拿大研究生奖学金，安大略省学生机会信托基金和詹姆斯J.哈蒙德基金。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5mL Eppendorf tubes | Eppendorf | 22363204 | |
| 1kb plus DNA Ladder | Froggabio | DM015-R500 | |
| 2x HS-Red Taq (PCR mix) | Wisent | 801-200-MM | |
| 7 Tesla MRI BioSpec | Bruker | T184931 | 70/30 BioSpec, Bruker, Ettlingen, Germany |
| C1000 Thermal cycler | Biorad | 1851148 | |
| Clippers | Whal Peanut | 8655 | |
| Compressed ultrasound gel | Aquaflex | HF54-004 | |
| Convection heating device | 3M Bair Hugger | 70200791401 | |
| Depiliatory cream | Nair | 61700222611 | Shopper's Drug Mart |
| DMEM | Wisent | 219-065-LK | |
| DNeasy extraction kit | Qiagen | 69504 | |
| DPBS | Wisent | 311-420-CL | |
| Drug injection system | Harvard Apparatus | PY2 70-2131 | PHD 22/2200 MRI compatible Syringe Pump |
| Eye lubricant | Optixcare | 50-218-8442 | |
| F10 Media | Wisent | 318-050-CL | |
| FBS | Wisent | 081-105 | |
| Froggarose | FroggaBio | A87 | |
| Gel Molecular Imager | BioRad | GelDocXR | |
| Glutamax | Wisent | 609-065-EL | |
| Heat Lamp | Morganville Scientific | HL0100 | Similar to this product |
| Intravascular Polyethylene tubing (0.015" ID x 0.043" OD, 20G) | SAI infusion | PE-20-100 | |
| Isoflurane | Sigma | 792632 | |
| M25FV24C Cell line | Gladdy Lab | N/A | |
| Microliter Syringe | Hamilton | 01-01-7648 | |
| Molecular Imager Gel Doc XR | Biorad | 170-8170 | |
| Mouse holder | The 3D printing material used was ABS-M30i, and it was printed on FDM Fortus 380mc machine | N/A | Dimensions: length = 43 mm, outer radius = 15 mm, inner width (where the mouse would sit) = 20.7 mm. |
| MyRun Machine | Cosmo Bio Co Ltd | CBJ-IMR-001-EX | |
| Nanodrop 8000 Spectrophotometer | Thermo Scientific | ND-8000-GL | |
| p53 primers | Eurofins | N/A | Custom Primers |
| PCR tubes | Diamed | SSI3131-06 | |
| Penicillin/Streptomycin | Wisent | 450-200-EL | |
| Proteus software | Pichardo lab | N/A | |
| Respiratory monitoring system | SAII | Model 1030 | MR-compatible monitoring and gating system for small animals |
| Small Bore HIFU device, LabFUS | Image Guided Therapy | N/A | LabFUS, Image Guided Therapy, Pessac, France Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm Motor: axes 2 Generator: Number of channels 8 Maximum electrical power/channel Wel 4 Maximum electrical power Wel 32 Bandwidth 0.5 - 5 MHz Control per channel: Freq., Phase and. amplitude Measurements per channel: Vrms, Irms, cos(theta) Duty Cycle at 100% power % 100% for 1 min. Transducer: Number of elements 8 frequency 2.5 MHz diameter 25 mm radius of curvature 20 mm Focal spot size 0.6 mm x 0.6 mm x 2.0 mm |
| SYBR Safe | ThermoFisher Scientific | S33102 | |
| TAE | Wisent | 811-540-FL | |
| Tail vein catheter (27G 0.5" ) | Terumo Medical Corp | 15253 | |
| Thermal probes | Rugged Monitoring | L201-08 | |
| Trypan blue | ThermoFisher Scientific | 15250061 | |
| Trypsin | Wisent | 325-052-EL | |
| Ultrasound Gel | Aquasonic | PLI 01-08 |
References
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Tags
癌症研究，第191期，Erratum
Formal Correction: Erratum: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model
Posted by JoVE Editors on 02/08/2023.
Citeable Link.
An erratum was issued for: Magnetic Resonance-Guided High Intensity Focused Ultrasound Generated Hyperthermia: A Feasible Treatment Method in a Murine Rhabdomyosarcoma Model . The Authors section was updated from:
Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 2Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto
to:
Claire Wunker1,2
Karolina Piorkowska3
Ben Keunen3
Yael Babichev2
Suzanne M. Wong3,4
Maximilian Regenold5
Michael Dunne5
Julia Nomikos1,2
Maryam Siddiqui6
Samuel Pichardo6
Warren Foltz7
Adam C. Waspe3,8
Justin T. Gerstle3,9
James M. Drake1,3,4,10
Rebecca A. Gladdy1,2,10
1 Institute of Medical Science, University of Toronto
2 Lunenfeld-Tanenbaum Research Institute, Mount Sinai Hospital
3 The Wilfred and Joyce Posluns Centre for Image-Guided Innovation and Therapeutic Intervention, The Hospital for Sick Children
4 Institute of Biomedical Engineering, University of Toronto
5 Leslie Dan Faculty of Pharmacy, University of Toronto
6 Departments of Radiology and Clinical Neurosciences, University of Calgary
7 Department of Radiation Oncology, University of Toronto
8 Department of Medical Imaging, University of Toronto
9 Department of Pediatric Surgery, University of Toronto
10 Department of Surgery, University of Toronto
