Waiting
Procesando inicio de sesión ...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Популяционный и одноклеточный анализ персистенции антибиотиков при Escherichia coli

Published: March 24, 2023 doi: 10.3791/64550
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1
1Bacterial Genetics and Physiology, Département de Biologie Moléculaire, Faculté des Sciences, Université Libre de Bruxelles (ULB)
* These authors contributed equally

Summary

Персистенция антибиотиков описывает способность небольших субпопуляций в чувствительной изогенной популяции временно переносить высокие дозы бактерицидных антибиотиков. Настоящий протокол сочетает в себе подходы к характеристике фенотипа персистенции антибиотиков на молекулярном и клеточном уровнях после воздействия на Escherichia coli смертельных доз офлоксацина.

Abstract

Персистенция антибиотиков относится к способности небольших бактериальных субпопуляций временно переносить высокие дозы бактерицидных антибиотиков. При бактерицидном лечении антибиотиками основная часть бактериальной популяции быстро погибает. За этой первой быстрой фазой уничтожения следует существенное снижение скорости убийства, поскольку персистентные клетки остаются жизнеспособными. Классически персистенция определяется на популяционном уровне анализами времени/убийства, проводимыми с высокими дозами антибиотиков, и для определенного времени воздействия. Хотя этот метод предоставляет информацию об уровне персистентных клеток и кинетике уничтожения, он не отражает внутреннюю гетерогенность от клетки к клетке, лежащую в основе явления персистенции. Описанный здесь протокол сочетает в себе классические анализы времени/уничтожения с анализом отдельных клеток с использованием флуоресцентной микроскопии в реальном времени. Используя соответствующие флуоресцентные репортеры, микроскопическая визуализация живых клеток может предоставить информацию о влиянии антибиотика на клеточные процессы, такие как репликация и сегрегация хромосом, удлинение клеток и деление клеток. Сочетание популяционного и одноклеточного анализа позволяет молекулярной и клеточной характеристике фенотипа персистенции.

Introduction

Этот протокол направлен на анализ фенотипа бактериальной персистенции в ответ на специфическое лечение антибиотиками на одноклеточном и популяционном уровнях. Персистенция описывает способность малых субпопуляций в изогенной популяции переносить высокие дозы бактерицидных антибиотиков (фторхинолонов, аминогликозидов, β-лактамов и т. д.), при этом минимальная ингибирующая концентрация (МИК) так называемых персистентных клеток идентична концентрации основной массы населения. Двухфазная динамика уничтожения при измерении выживаемости бактерий с течением времени в присутствии антибиотика выявляет наличие временно устойчивых к лекарствам клеток с первоначальной быстрой эрадикацией неперсистирующих клеток, за которой следует гораздо более медленная скорость уничтожения персистирующих клеток. При удалении антибиотика эти клетки дают начало генетически идентичной популяции, которая проявляет аналогичную динамику убийства при лечении одним и тем же антибиотиком 1,2. В отличие от персистенции, устойчивость к антибиотикам определяется на популяционном уровне и, как правило, является следствием либо мутаций de novo, либо горизонтального переноса гена плазмиды3, придающей резистентность. В то время как мутации, ответственные за резистентность, в основном расположены в мишени препарата или в промоторных областях насосов оттока лекарства, гены, изменяющие частоту персистенции, идентифицированные с помощью полногеномного и целенаправленного мутантного анализа, оказались многочисленными и разнообразными 2,3,4,5,6,7,8 . Следовательно, вполне вероятно, что бактериальные клетки могут входить в персистирующее состояние через несколько путей 9,10,11, и необходимы подходы к исследованию явления персистенции на уровне отдельных клеток, чтобы охарактеризовать физиологию этих персистентных клеток.

Недавняя разработка микрофлюидных инструментов, используемых в сочетании с флуоресцентной микроскопией, проложила путь к характеристике фенотипа персистенции и подчеркнула роль ключевых клеточных процессов, таких как репликация хромосомы12, репарацияДНК 13 и деление клеток14, в формировании персистентных клеток. В этой статье мы описываем комплексный подход, сочетающий классические микробиологические анализы с визуализацией одноклеточных живых клеток для характеристики персистентных клеток, генерируемых в экспоненциально растущих культурах Escherichia coli, обработанных высокой дозой офлоксацина. Описанный здесь протокол может быть применен для изучения явления персистенции антибиотиков у других видов бактерий, таких как Bacillus subtilis15, или состояний (например, персистенция антибиотиков после лечения β-лактамом 16) и может быть легко модифицирован для исследования многих явлений, связанных с фенотипической гетерогенностью17,18,19 . Кроме того, установка, описанная в этой статье, может быть объединена с другими флуоресцентными репортерами для исследования различных клеточных параметров, представляющих интерес, таких как внутриклеточные уровни pH20 или АТФ21 на уровне одной клетки, что потенциально может привести к новому пониманию феномена персистенции антибиотиков.

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: Используйте стерильную стеклянную посуду для культур, наконечники пипеток и питательную среду. Здесь клетки E. coli выращивали в химически определенной среде с низкой автофлуоресценцией (см. Таблицу материалов). Инокуляции проводились в присутствии горелки Бунзена, чтобы свести к минимуму риск загрязнения.

1. Клеточная культура и кривая роста

  1. Нанесите интересующий штамм из замороженного глицерина на агаровую пластину Лурия-Бертайни (LB) (при необходимости с добавлением селективного антибиотика) и инкубируйте при 37 ° C в течение ночи (от 15 до 19 часов) для получения единичных колоний.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В представленном здесь эксперименте используются два штамма: E. coli K-12 MG1655, соответствующий штамму wt, и изогенный штамм MG1655 hupA-mCherry 22. Последний штамм экспрессирует меченную флуоресценцией α-субъединицу нуклеоид-ассоциированного белка HU. Репортер hupA-mCherry интегрирован в родной локус hupA. HU-mCherry служит прокси для отслеживания динамики нуклеоидов в живых клетках, поскольку он связывается с ДНК неспецифическим образом.
  2. Инокулируют 5 мл среды (в данном случае 3-[N-морфолино] среды на основе пропансульфоновой кислоты [MOPS]; Таблица 1, Таблица 2 и Таблица 3) дополняют глюкозой 0,4% и селективным антибиотиком (при необходимости) с изолированной колонией в стеклянной пробирке (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор с температурой 37 ° C и 180 оборотами в минуту (об/мин) на ночь (от 15 до 19 часов). В качестве альтернативы вместо стеклянных трубок можно использовать пластиковые трубки, стекло или пластиковые колбы (≥ 25 мл).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Среда MOPS с добавлением глицерина в конечной концентрации 0,4% использовалась во всех экспериментах, описанных в этой статье, за исключением ночных культур, которые проводились в MOPS глюкозы 0,4%. Время генерации кишечной палочки в MOPS с добавлением глюкозы короче, чем в глицерине MOPS. Использование MOPS глюкозы 0,4% вместо MOPS глицерина 0,4% на этом этапе гарантирует, что клетки достигнут стационарной фазы в течение 19 часов. Также можно использовать другие питательные среды, такие как M9 или богатая определенная среда (RDM), дополненная различными источниками углерода. Следует, однако, отметить, что скорость роста и частота стойкости различны в зависимости от используемой среды и/или углерода23.
  3. На следующее утро центрифугу 1 мл культуры в 2,300 x g в течение 3 мин, выбросьте надосадочную жидкость и осторожно ресуспендируйте гранулу в том же объеме фосфатно-буферного физиологического раствора (PBS). Измерьте оптическую плотность при 600 нм (OD 600 нм) и рассчитайте объем, необходимый для начального OD600 нм 0,01 в конечном объеме 2 мл.
  4. Поместите 2 мл 0,4% среды глицерина MOPS в лунку с чистым дном 24-луночной пластины и инокулируйте рассчитанным объемом культуры за ночь. Поместите 24-луночную пластину в автоматический считыватель микропланшетов (см. Таблицу материалов) для контроля наружного диаметра600 нм в течение 24 часов. Установите считыватель микропланшетов на измерение OD600 нм каждые 15 минут при температуре 37 °C и при высоком вращении орбиты (140 об/мин).
    ПРИМЕЧАНИЕ: Если штамм, используемый в эксперименте, кодирует флуоресцентный репортер, убедитесь, что его скорость роста сопоставима с частотой роста , чтобы избежать каких-либо артефактов в последующих экспериментах, поскольку скорость роста влияет на частоту персистенции антибиотиков23. Из-за ограничений обнаружения при очень низких плотностях клеток и потенциального штаммоспецифического влияния на соотношение OD600 нм/колониеобразующих единиц (КОЕ) рекомендуется оценивать кинетику роста путем мониторинга КОЕ·мл-1 при работе с неохарактеризованными штаммами.

2. Определение минимальной ингибирующей концентрации антибиотиков

ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальная ингибирующая концентрация (MIC) определяется как самая низкая доза антибиотика, при которой не наблюдается роста бактерий. Определение МПК необходимо проводить для каждого антибиотика и штамма. В описанных здесь экспериментах использовался фторхинолоновый антибиотик офлоксацин (OFX). Определение МПК позволяет подтвердить, что раствор антибиотика приготовлен правильно, антибиотик активен, а штаммы одинаково чувствительны к антибиотику. Здесь был выполнен опубликованный метод разбавления агара для определения MIC к OFX различных используемых штаммов24. МПК данного антибиотика к данному бактериальному штамму также может быть определен с помощью метода24 разведения бульона.

  1. Подготовка пластин для определения МПК
    1. Приготовьте основной раствор для антибиотика, используемого в экспериментах, растворив 5 мг OFX в 1 мл сверхчистой воды. Добавьте 20 мкл 37% HCl для увеличения растворимости OFX.
    2. Растопите 100 мл стерильного агара LB и храните его при температуре 55 °C, чтобы избежать затвердевания. Подготовьте шесть маленьких стеклянных колб (25 мл) и запипейте 5 мл жидкой агаровой среды LB в каждую колбу с помощью стерильной пипетки.
    3. Разведите 10 мкл основного раствора OFX объемом 5 мг·мл-1 в 90 мкл сверхчистой воды (разведение основного сырья 1:10). Добавьте 0 мкл, 2 мкл, 4 мкл, 6 мкл, 8 мкл или 10 мкл раствора OFX 500 мкг·мл-1 в каждую из шести стеклянных колб, содержащих 5 мл агаровой среды LB, чтобы получить среду LB-агара с конечными концентрациями 0 мкг·мл-1, 0,02 мкг·мл-1, 0,04 мкг·мл-1, 0,04 мкг·мл-1, 0,06 мкг·мл-1, 0,08 мкг·мл−1 и 0,1 мкг·мл-1 OFX соответственно. Перемешайте раствор, повернув колбы несколько раз.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если МПК интересующего антибиотика известен, диапазон концентраций должен достигать от нижнего до верхнего фактического МИК. Если МПК неизвестен, рекомендуется большой диапазон концентраций с серией разведения log2 . Перед добавлением антибиотика убедитесь, что агаровая среда LB остыла, так как высокие температуры могут ее инактивировать. Тем не менее, важно не допускать затвердевания агаровой среды LB перед добавлением антибиотика, так как это может привести к неоднородному распределению антибиотика в агаровой среде LB.
    4. Вылейте по 5 мл каждой из шести агаровых сред LB, приготовленных на этапе 2.1.3, с увеличением дозы в 6-луночную культуральную пластину с помощью стерильной пипетки. Дайте агару остыть до застывания и высушите тарелку перед использованием.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Приготовьте раствор антибиотика и культуральную пластину в день проведения анализа.
  2. Анализ определения МПК
    1. Инокулируют 5 мл среды LB изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают стеклянную пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов).
    2. На следующее утро измерьте OD600 нм и разбавьте культуру в пробирке до конечной плотности клеток 1 x 107 КОЕ · мл -1 в PBS. Для штаммов, протестированных здесь, 1 x 107 КОЕ·мл-1 соответствует OD600 нм 0,0125.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если корреляция между КОЕ·мл-1 и OD 600 нм неизвестна, следует установить кривую роста, определенную измерениями КОЕ и OD 600 нм, для расчета коэффициента корреляции между КОЕ·мл-1 и OD 600 нм.
    3. Нанесите 2 мкл предварительно разбавленной культуры на каждую лунку высушенной 6-луночной пластины. Дайте пятнам высохнуть, прежде чем помещать тарелку в инкубатор при температуре 37 ° C на ночь (от 15 до 19 часов).
    4. На следующий день посчитайте колонии, образовавшиеся в каждой лунке. МПК соответствует лунке с минимальной концентрацией антибиотика, в которой не обнаружен рост бактерий.

3. Точечный анализ

ПРИМЕЧАНИЕ: Метод точечного анализа является качественным подходом, который позволяет оценить количество жизнеспособных клеток (клеток, способных генерировать колонии после антибиотикового стресса). Точечный анализ проводится перед анализом с временным уничтожением, чтобы дать представление о жизнеспособности штамма, используемого в тестируемых условиях, и сообщить о разведениях, необходимых во время анализа с замедленным уничтожением (см. Раздел 4).

  1. Чтобы подготовить агаровые пластины LB для точечных анализов, налейте 50 мл агара LB в квадратную чашку Петри (144 см2 ). Подготовьте одну квадратную чашку Петри за каждый момент времени. Дайте агару LB затвердеть и высушите пластины перед использованием.
  2. Инокулируют 5 мл среды (MOPS глюкозы 0,4%) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов).
  3. На следующий день измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной пробирке (≥25 мл) до конечного OD600 нм ~ 0,001. Дайте культуре вырасти в течение ночи в инкубаторе при 37 ° C при 180 об/мин (от 15 до 19 часов).
  4. На следующий день измерьте OD 600 нм и инкубируйте культуру до конечного OD600 нм 0,3.
  5. Во время инкубации готовят 96-луночные планшеты, помещая 90 мкл 0,01 М раствора MgSO4 в каждую лунку, кроме лунок первого ряда (ряд А). 96-луночные пластины будут использоваться для 10-кратного последовательного разбавления на этапе 3.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте два штамма (wt и штамм hupA-mCherry ) были протестированы в трех экземплярах в семи разных временных точках. Поскольку одна пластина состоит из 12 колонн, одна пластина может быть использована в течение двух временных точек, и, таким образом, всего было подготовлено четыре пластины.
  6. При OD600 нм 0,3 извлеките 200 мкл каждой бактериальной культуры. Эти образцы соответствуют t0 (необработанному) моменту времени до лечения антибиотиками и позволяют определить КОЕ·мл-1 до лечения антибиотиками.
  7. Центрифугируют образцы при 2 300 x g в течение 3 мин. Во время центрифугирования добавьте желаемую концентрацию OFX в жидкую культуру и продолжайте инкубацию при 37 ° C при встряхивании.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь OFX использовался в концентрации 5 мкг·мл-1 (что соответствует МПК, умноженному в 83 раза). В предыдущем исследовании эта концентрация использовалась для характеристики явления персистенции при воздействии OFX25. Концентрация антибиотика, используемая для анализов времени/уничтожения, может варьироваться в зависимости от антибиотика, питательной среды и состояния роста бактерий.
  8. После центрифугирования ресуспендируют гранулу ячейки в 200 мкл раствора 0,01 М MgSO4 . Поместите 100 мкл в пустую лунку 96-луночной пластины, подготовленной на шаге 3.5. Проведите разбавление, перелив 10 мкл из скважины в ряду А в скважину в ряду В, содержащую 90 мкл 0,01 М MgSO4. Продолжайте последовательные разведения, перенося 10 мкл из скважины в ряду B в скважину в ряду C. Повторяйте до тех пор, пока не достигнете разбавления 10-7 (при этом каждая пересадка представляет собой 10-кратное разбавление).
    ПРИМЕЧАНИЕ: В этом эксперименте шесть культур (три для штамма wt и три для штамма hupA-mCherry ) были протестированы для каждого момента времени. Согласно протоколу, многоканальная пипетка используется для выполнения последовательных разведений для шести штаммов одновременно. Чтобы свести к минимуму техническую ошибку, наконечники дозатора меняются между каждой передачей.
  9. Нанесите 10 мкл каждого разбавления на пластины с агаром LB, приготовленные на этапе 3.1.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Многоканальная пипетка используется для одновременного определения одного и того же разведения (например, разведения 10−4 ) для шести культур. Во время кровянистого выделения следует использовать первую стопу многоканальной пипетки, не нажимая на вторую стопу, так как это может привести к выдаче микрокапель на пластину.
  10. В соответствующие моменты времени после добавления антибиотика извлеките 200 мкл культуры и выполните последовательные разведения, как описано на шаге 3.8. Выделите 10 мкл каждого разведения, как описано на этапе 3.9.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, было собрано семь временных точек (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Для штаммов, проявляющих повышенную чувствительность к антибиотикам по сравнению с массой, можно проводить многократные промывки в MgSO4 0,01 М для удаления остаточных антибиотиков.
  11. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи (от 15 до 19 часов). На следующий день подсчитайте количество колоний в двух самых высоких разведениях, для которых могут быть обнаружены колонии. В идеале пятна на агаровых пластинах для этих разведений содержат от 3 до 30 колоний, что позволяет точно определить КОЕ·мл-1 для каждого образца.
  12. Рассчитайте коэффициент выживаемости, разделив рассчитанный КОЕ · мл -1 каждого момента времени на КОЕ · мл -1 исходной популяции при t0.

4. Анализы замедленного действия

ПРИМЕЧАНИЕ: В то время как точечные анализы являются простым в использовании методом оценки выживаемости данного штамма для данного антибиотика, анализы с временным уничтожением дают выживаемость с более высоким разрешением и выполняются для точной количественной оценки жизнеспособности бактерий. Профиль кривой убийства может быть использован для определения того, является ли данный бактериальный штамм чувствительным, толерантным или устойчивым к антибиотику в данном состоянии. Кроме того, анализы с временным уничтожением позволяют определить время воздействия антибиотиков, необходимое для выявления явления персистенции (начало второго наклона двухфазной кривой уничтожения), а также частоту персистенции.

  1. Подготовьте агаровые пластины LB для анализа с замедленным покрытием. Налейте 25 мл агара LB в чашку Петри (±57 см2 ). Приготовьте не менее двух чашек Петри за каждый момент времени (два разведения на определенный момент времени на штамм).
  2. Дайте агару LB затвердеть и высушите пластины, прежде чем добавлять пять-восемь стерильных стеклянных шариков в каждую тарелку. Переверните и пометьте пластины в соответствии с деформацией/состоянием/моментом времени.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Стеклянные шарики позволяют распространять бактерии на агаровых пластинах на этапах 4.7 и 4.9. В качестве альтернативы, клетки могут быть диспергированы на агаровой пластине с помощью разбрасывателя.
  3. Для каждого образца готовят стеклянные пробирки с последовательным разбавлением в 10 раз, содержащие 900 мкл 0,01 М раствора MgSO4 . Количество стеклянных пробирок для разбавления на образец, который необходимо подготовить, соответствует разведениям, необходимым для обнаружения колоний в точечном анализе.
  4. Инокулируют 5 мл среды (MOPS глюкозы 0,4%) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и помещают пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов).
  5. После 16 ч роста измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной трубке до конечного OD600 нм ~0,001 . Дайте культуре вырасти в течение ночи в инкубаторе при 37 ° C при 180 об/мин (от 15 до 19 часов).
  6. На следующий день измерьте OD 600 нм и инкубируйте культуру до конечного OD600 нм 0,3.
  7. При OD 600 нм 0,3 извлеките 100 мкл культуры, разбавьте в соответствии с данными, полученными в точечном анализе (при OD600 нм 0,3 и без антибиотика разведение 10−5 обычно дает 200-300 колоний), и планшет100 мкл на агаровых планшетах LB, приготовленных на этапах 4.1-4.2. Осторожно встряхните тарелки, чтобы шарики не соприкасались с краями блюда, так как это может привести к неоднородному распространению бактериальных клеток на агаровой среде LB. Этот первый образец перед лечением антибиотиками соответствует моменту времени t0 (КОЕ · мл -1 до лечения антибиотиками).
  8. Добавьте желаемую концентрацию OFX и продолжайте инкубацию при 37 ° C, встряхивая.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Здесь OFX использовался в концентрации 5 мкг·мл-1 (что соответствует МПК, умноженному в 83 раза).
  9. В соответствующие моменты времени после добавления антибиотика извлеките 100 мкл культуры, разведите в соответствии с данными, полученными в точечном анализе, и планшет 100 мкл на планшетах с агаром LB, приготовленных на этапах 4.1-4.2. Распределите ячейки, как описано в шаге 4.7.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Для эксперимента, описанного здесь, было собрано семь временных точек (t0, t1h, t2h, t3h, t4h, t5h, t6h). Для штаммов, проявляющих повышенную чувствительность к антибиотикам по сравнению с массой, можно проводить многократные промывки в MgSO4 0,01 М для удаления остаточных антибиотиков.
  10. Инкубируйте пластины при температуре 37 °C в течение ночи (от 15 до 19 часов). На следующий день подсчитайте количество колоний в двух самых высоких разведениях, для которых могут быть обнаружены колонии. В идеале планшеты должны содержать 30-300 колоний, чтобы обеспечить точное определение КОЕ·мл-1 в каждом образце.
  11. Рассчитайте коэффициент выживаемости, нормализуя КОЕ · мл -1 в каждый момент времени на КОЕ · мл -1 при t0. Постройте логарифмическое10 нормализованное КОЕ·мл-1 в зависимости от времени.

5. Микрофлюидная покадровая микроскопия

ПРИМЕЧАНИЕ: В следующем разделе описывается подготовка микрофлюидной пластины, а также процедура получения и анализа изображений с интервальной съемкой. Целью данного эксперимента является наблюдение и анализ фенотипа персистенции при лечении антибиотиками на одноклеточном уровне. Данные, собранные в ходе этого эксперимента, могут быть использованы для получения широкого спектра результатов в зависимости от рассматриваемого вопроса и/или флуоресцентных репортеров, используемых во время эксперимента. В описанном здесь эксперименте был проведен количественный анализ длины клетки и флуоресценцииHU-mCherry 22, отражающий нуклеоидную организацию в персистентных и неперсистентных клетках.

  1. Культура бактериальных клеток для микрофлюидной покадровой микроскопии
    1. Инокулируйте 5 мл среды (глицерин MOPS 0,4%, при необходимости добавляя селективный антибиотик) изолированной колонией в стеклянную пробирку (≥25 мл) и поместите пробирку в встряхивающий инкубатор при температуре 37 ° C и 180 об/мин на ночь (от 15 до 19 часов).
    2. На следующий день измерьте OD 600 нм и разбавьте культуру в свежей среде с регулируемой температурой (37 °C, глицерин MOPS 0,4%) в стеклянной пробирке до конечного OD600 нм ~ 0,001. Дайте культуре вырасти в течение ночи (от 15 до 19 часов) в встряхивающем инкубаторе при 37 ° C и 180 об/мин, чтобы получить раннюю экспоненциальную фазу культуры на следующий день.
  2. Подготовка микрофлюидной пластины и покадровая микроскопия
    ПРИМЕЧАНИЕ: Микрофлюидные эксперименты могут быть выполнены в коммерчески доступных микрофлюидных устройствах (как описано здесь) или в микрофлюидных системах собственного производства.
    1. Удалите консервирующий раствор (если он присутствует) из каждого отверстия микрофлюидной пластины и замените его свежей питательной средой.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Если микрофлюидная пластина содержит выпускной колодец для отходов, консервационный раствор выпускного отверстия должен быть удален, но не заменен средой.
    2. Запечатайте микрофлюидную пластину с помощью системы коллектора, нажав кнопку «Уплотнение» или с помощью микрофлюидного программного обеспечения (сначала выберите «Инструмент», а затем «Уплотнительная пластина»).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Чтобы герметизировать пластину, необходимо равномерно надавить на пластину и коллектор, вручную прижав пластину к коллектору. Если все выполнено правильно, на интерфейсе ONIX2 должна появиться пометка «запечатано». Важно не давить на предметное стекло, чтобы избежать потенциального риска поломки коллектора.
    3. После герметизации выполните первую последовательность заливки (нажмите « Запустить последовательность заливки жидкости » в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Последовательность прогонной заливки жидкости соответствует 5 минутам перфузии при давлении 6,9 кПа для скважин 1-5, затем 5 минутам перфузии при 6,9 кПа для скважины 8 и заключительному раунду перфузии для скважины 6 в течение 5 минут при 6,9 кПа. Последовательность жидкостного грунтования позволяет удалить консервационный раствор, который все еще может присутствовать в каналах, соединяющих различные скважины.
    4. Инкубируйте пластину в термостатическом шкафу микроскопа при желаемой температуре (в данном случае 37 °C) в течение как минимум 2 ч до начала микроскопии.
    5. Перед началом эксперимента запустите вторую последовательность жидкостной заливки .
    6. Запечатайте микрофлюидную пластину, нажав «Запечатать» в интерфейсе микрофлюидного программного обеспечения. Замените среду в лунке 1 и лунке 2 200 мкл свежей среды, в лунке 3 - 200 мкл свежей среды, содержащей антибиотик (в данном случае OFX при 5 мкг·мл-1), в лунке 4 и лунке 5 - 200 мкл свежей среды, в лунке 6 - 200 мкл свежей среды и в лунке 8 - 200 мкл образца культуры (из этапа 5.1.2), разбавленного до OD600 нм 0,01 в пресной среде.
    7. Запечатайте микрофлюидную пластину, как описано на шаге 5.2.2, и поместите пластину на объектив микроскопа внутри корпуса микроскопа.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно нанесите каплю иммерсионного масла на объектив микроскопа перед установкой микрофлюидной пластины.
    8. В микрофлюидном программном обеспечении нажмите « Загрузка ячейки », чтобы разрешить загрузку ячейки в микрофлюидную пластину.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Этап загрузки ячейки включает 15 с перфузии при 13,8 кПа для скважины 8, затем 15 с перфузии при 27,6 кПа для скважин 6 и 8 и заключительный перфузионный раунд для скважины 6 в течение 30 с при 6,9 кПа. Плотность клеток в микрофлюидной пластине имеет решающее значение для эксперимента. Первая часть этого микрофлюидного протокола состоит из выращивания бактерий в течение 6 часов в свежей среде перед лечением антибиотиками. Через 6 ч после роста плотность клеток должна быть достаточной для обнаружения редких персистентных клеток (в условиях, используемых в этом исследовании, персистентные клетки генерируются с частотой 10−4). Если плотность клеток слишком высока, трудно различить отдельные клетки, что препятствует точному анализу отдельных клеток. Поскольку скорость роста напрямую зависит от среды, перед началом эксперимента следует оценить плотность клеток в полях микроскопии.
    9. Установите оптимальный фокус с помощью режима проходящего света и выберите несколько областей интереса (ROI), где наблюдается соответствующее количество ячеек (до 300 ячеек на поле).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Выберите не менее 40 ROI, чтобы убедиться, что редкие персистентные клетки изображены.
    10. В микрофлюидном программном обеспечении нажмите « Создать протокол». Запрограммируйте инъекцию свежей среды при 6,9 кПа в течение 6 ч (лунка 1-2), затем инъекцию среды, содержащей антибиотик, при 6,9 кПа в течение 6 ч (лунка 3), и, наконец, инъекцию свежей среды при 6,9 кПа в течение 20 ч (лунки 4-5).
      ПРИМЕЧАНИЕ: Бактериальная культура, разбавленная до OD600 нм 0,01, позволяет бактериям расти в микрофлюидной камере в течение 6 часов, гарантируя, что клетки находятся в экспоненциальной фазе роста. В зависимости от количества клеток, введенных в микрофлюидное устройство на этапе загрузки (см. этап 5.2.8), продолжительность фазы роста может быть адаптирована для получения до 300 клеток на ROI. Поскольку персистенция является редким явлением, увеличение количества клеток на ROI улучшает возможность наблюдения персистентных клеток. Однако количество ячеек не должно превышать 300 ячеек на ROI, так как это делает анализ одной ячейки утомительным.
    11. Выполняйте микроскопическую визуализацию в режиме покадровой съемки с одним кадром каждые 15 минут, используя проходящий свет и источник возбуждающего света для флуоресцентного репортера. Здесь использовался источник возбуждающего света с длиной волны 560 нм для сигнала mCherry (светодиод 580 нм при мощности 10% с фильтром 00 [530-585 ex, 615LP em, Zeiss] и экспозиция 100 мс для mCherry). Для визуализации клеток использовалось программное обеспечение Zeiss-совместимое программное обеспечение Zen3.2.
  3. Анализ изображений
    ПРИМЕЧАНИЕ: Открытие и визуализация микроскопических изображений выполняются с помощью программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом (https://fiji.sc/)26. Количественный анализ изображений выполняется с использованием программного обеспечения ImageJ/Fiji с открытым исходным кодом и бесплатного плагина MicrobeJ (https://microbej.com)27. В этом протоколе использовалась версия MicrobeJ 5.13I(14).
    1. Откройте программное обеспечение ImageJ/Fiji на компьютере и перетащите изображения покадровой микроскопии Hyperstack на панель загрузки Fiji. Используйте Image > Color > Make Composite для слияния различных каналов гиперстека. Если каналы покадрового эксперимента не соответствуют желаемому цвету (например, фазовый контраст показан красным, а не серым), используйте «Изображение > цвет » > «Упорядочить каналы », чтобы применить соответствующий цвет к каналам.
    2. Откройте плагин MicrobeJ и обнаружите бактериальные клетки с помощью интерфейса ручного редактирования. Удалите автоматически обнаруженные ячейки и вручную обведите интересующие ячейки-сохранятели кадр за кадром.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Для автоматического обнаружения отдельных ячеек можно использовать различные настройки. Здесь использовалось ручное обнаружение, поскольку анализируемые персистентные клетки образуют длинные филаменты, которые редко обнаруживаются правильно с помощью автоматического обнаружения.
    3. После обнаружения используйте значок «Результат » в интерфейсе ручного редактирования MicrobeJ, чтобы создать таблицу ResultJ. Сохраните файл ResultJ и используйте таблицу ResultJ, чтобы получить представление о различных параметрах, представляющих интерес для анализа одной ячейки. В случае этого протокола экспортировались средняя флуоресценция интенсивности HU-mCherry, длина клетки и площадь клеток отдельных клеток.

Representative Results

Как описано выше, штаммы, используемые для одноклеточного фенотипического анализа персистентных клеток, были охарактеризованы в среде 0,4% глицерина MOPS. Мониторинг OD600 нм с течением времени не показал различий между штаммами wt и hupA-mCherry (рис. 1). Это указывает на то, что экспрессия белка слияния HU-mCherry не влияла на рост в этих условиях. Бактериальные клетки обоих штаммов, первоначально инокулированные при OD600 нм 0,01, достигли экспоненциальной фазы через ±8 ч после инокуляции.

МПК OFX определяли стандартизированными методами (в данном случае серийное разведение агара)24. MIC определяется как минимальная концентрация, при которой видимый рост не обнаруживается. Было определено, что MIC OFX для обоих штаммов составляет 0,06 мкг·мл-1, что указывает на то, что слияние hupA-mCherry не влияло на чувствительность к OFX по сравнению с изогенным штаммом wt (рис. 2).

Мы также определили влияние летального лечения OFX (83-кратный MIC) на жизнеспособность обоих штаммов, используемых в этом исследовании. Поскольку количество жизнеспособных клеток уменьшается с течением времени при воздействии OFX, разведения бактериальных культур должны быть соответствующим образом скорректированы, чтобы достичь от 30 до 300 колоний на планшет. Для определения соответствующих разведений с течением времени проводили точечный анализ, где 10 мкл от 0 до 10−7 серийных 10-кратных разведений помещали на квадратные чашки Петри с помощью многоканальной пипетки. Подходящими разведениями были те, в которых были видны изолированные клоны (например, при t0 = 10−5, t1h = 10−4/10−3, t4h = 10−2/10−1) (рис. 3).

Хотя точечный анализ является простым методом получения информации о кинетике убийства, опосредованного OFX, он не может точно определить динамику убийства. Когда жизнеспособность экспоненциально растущих клеток, обработанных OFX, контролировалась с помощью анализа замедления, наблюдалась типичная двухфазная кривая (рис. 4). Первый наклон кривой отражает быстрое истребление популяции, не сохраняющей персистенцию (красная пунктирная линия). В условиях, протестированных здесь, до 99,9% клеток не смогли образовать колонии через 3 ч в присутствии OFX. За этой первой фазой убийства следует вторая фаза, показывающая более медленную скорость убийства (синяя пунктирная линия), которая показывает наличие устойчивых к лекарствам персистентных клеток. В тестируемых условиях персистентная фаза начиналась примерно через 3 часа после добавления OFX, что подчеркивало необходимость подвергать клетки воздействию OFX дольше 3 часов для исследования персистентных фенотипов. Важно отметить, что кривая уничтожения времени показывает, что слитый белок hupA-mCherry не влиял на кинетику уничтожения времени. Таким образом, штамм, кодирующий трансляционное флуоресцентное слияние, может быть использован для мониторинга персистентных клеток с помощью флуоресцентной микроскопии.

Далее мы продолжили исследовать явление персистенции на уровне отдельных клеток. Для этого штамм hupA-mCherry вводили в микрофлюидную пластину, что позволяло изменять условия среды (в данном случае рост, лечение и восстановление) при выполнении покадровой микроскопии при заданной рентабельности инвестиций. На первом этапе микрофлюидного эксперимента клетки, введенные в микрофлюидное устройство, перфузировали питательной средой (глицерин MOPS 0,4%) и делили со временем генерации ~ 2 ч (рис. 5 и рис. 6). Эта первая фаза роста указывает на то, что клетки были жизнеспособными и активно делились до лечения OFX.

После этой первой фазы роста клетки перфузировали питательной средой с добавлением 5 мкг·мл-1 OFX в течение 6 часов. Как только антибиотик достигал клеток, деление клеток блокировалось (рис. 5 и рис. 6). После 6 ч лечения OFX клетки перфузировали свежей средой. В то время как подавляющее большинство клеток не смогли возобновить рост (рис. 5 и рис. 6), небольшая субпопуляция бактерий была способна удлиняться и генерировать нитевидные клетки25. Эти клетки, которые смогли делиться и генерировать жизнеспособные дочерние клетки после лечения OFX, могут быть определены как персистентные клетки.

Поскольку эта установка позволяет визуализировать персистирующие клетки до, во время и после лечения, она не только предоставляет информацию о персистентном фенотипе во время фазы восстановления, но и о физиологическом состоянии персистентных клеток до лечения (рис. 6). В тестируемых условиях персистентные клетки делились аналогично неперсистентным клеткам до лечения OFX, что указывает на то, что наблюдаемые персистентные клетки не происходили из спящей субпопуляции (рис. 6)25.

Анализ длины клеток персистентных клеток во время фазы восстановления показал, что каждая нить имеет определенную скорость удлинения. Длина клетки, достигнутая каждым персистентом до первого деления, различалась от одного персистента к другому. Точно так же время проведения первого дивизиона было весьма неоднородным (рис. 6). Делящаяся персистентная нить генерировала несколько дочерних клеток, которые начали расти и делиться, по большей части, аналогично необработанным клеткам (рис. 7). Последовательное деление нити затем приводило к прогрессирующему уменьшению длины клеток, что в конечном итоге приводило к образованию дочерних клеток с длиной клеток, аналогичной длине до обработки OFX (рис. 6 и рис. 7B). Подавляющее большинство клеток не смогли индуцировать филаментацию после удаления OFX. Эта большая клеточная популяция соответствует мертвым клеткам (рис. 5 и рис. 6).

Флуоресцентное слияние нуклеоид-ассоциированного белка HU позволяет визуализировать динамику нуклеоида22. Анализ общей интенсивности флуоресценции HU-mCherry в клетке может быть использован в качестве прокси для содержания ДНК22,25. Во время фазы роста (до обработки OFX) общая интенсивность флуоресценции mCherry варьировалась, отражая динамику репликации и сегрегации хромосом в течение клеточного цикла (рис. 8). После добавления OFX флуоресценция mCherry увеличилась в средней клетке, что свидетельствует о нуклеоидном уплотнении, которое, как было показано, индуцируется образованием двухцепочечных разрывов ДНК28 (рис. 5). Двухцепочечные разрывы ДНК являются следствием механизма действия OFX, который разрушает топоизомеразы II типа ДНК-гиразу и топоизомеразу IV29,30. У E. coli ДНК-гираза является основной мишенью OFX29,30. Связывая свою мишень на критическом этапе механизма двухцепочечного пассажа, OFX ингибирует вытеснение расщепленных цепей ДНК, что в конечном итоге приводит к высвобождению двухцепочечных разрывовДНК 30. Как описано выше, персистентные клетки, подлежащие обработке OFX, начали филаментировать во время восстановления25 (рис. 6). Увеличение длины клетки коррелировало с увеличением общей интенсивности флуоресценции mCherry, что отражает перезапуск репликации и увеличение содержания нуклеоидов в филаменте25 (рис. 7a и рис. 8). Для мертвых клеток общая интенсивность флуоресценции mCherry оставалась стабильной во время лечения и во время фазы восстановления, что указывает на то, что эти клетки не смогли реплицировать свои хромосомы после удаления OFX (рис. 8). Также показано микрофлюидное видео (Видео 1) клеток E. coli HU-mCherry до, во время и после лечения офлоксацином.

Figure 1
Рисунок 1: Мониторинг роста штаммов кишечной палочки wt и hupA-mCherry E. coli. Контроль оптической плотности (OD600 нм) wt (черный) и hupA-mCherry (красный). Штрихи и пунктирные линии обозначают стандартные отклонения биологических триплицатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 2
Рисунок 2: Определение МПК OFX для штаммов wt и hupA-mCherry E. coli. WT () и hupA-mCherry (●) были выращены в среде LB, и 2 мкл были обнаружены при серийных разведениях OFX-содержащего агара LB (♦ концентрация, указанная на каждой панели в мкг·мл-1). Ингибирование роста видно как минимум при 0,06 мкг·мл-1. Рисунок представляет собой репрезентативный эксперимент биологических триплицатов. Масштабная линейка = 1 см. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 3
Рисунок 3: Точечный анализ штаммов кишечной палочки wt и hupA-mCherry при воздействии OFX. Штаммы (A) wt и (B) hupA-mCherry выращивали в глицерине MOPS 0,4%, как описано в протоколе (раздел 3), а экспоненциально растущие клетки (OD600 нм = 0,3) обрабатывали 5 мкг·мл-1 OFX. T0 соответствует моменту времени до добавления OFX. Т1, Т2, Т3, Т4, Т5 и Т6 соответствуют 1-6 ч после добавления OFX. Рисунок представляет собой репрезентативный эксперимент биологических триплицатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 4
Рисунок 4: Анализ замедления штаммов кишечной палочки wt и hupA-mCherry при воздействии OFX. Штаммы wt () и hupA-mCherry (●) выращивали в глицерине MOPS 0,4%, как описано в протоколе (раздел 4), а экспоненциально растущие клетки (♦ OD600 нм = 0,3) обрабатывали 5 мкг·мл −1 OFX. Пунктирными линиями обозначена первая «быстрая» (красная) фаза убийства и вторая «медленная» (синяя) фаза убийства, соответствующие чувствительным и стойким субпопуляциям (полученным путем линейной регрессии между Т0 и Т2, а также между Т3 и Т6 соответственно). Полосы погрешностей показывают стандартные отклонения биологических триплицатов. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 5
Рисунок 5: Репрезентативные изображения персистирующих и мертвых клеток OFX с использованием микрофлюидных инструментов. Репрезентативные микроскопические изображения, показывающие соответствующие временные моменты микрофлюидного эксперимента, проведенного со штаммом hupA-mCherry (фазовый контраст серого цвета, сигнал HU-mCherry красного цвета). Клетки, экспрессирующие меченую hupA-mCherry , выращивали в микрофлюидной пластине (здесь 4 часа) с последующим испытанием OFX (5 мкг·мл-1). Через 6 ч в присутствии ОФХ клетки перфузировали свежей средой, что позволило персистирующим клеткам восстановиться. Персистирующая клетка и ее потомство во время лечения OFX и после удаления OFX выделены зеленым и синим цветом соответственно. Соответствующие временные точки указаны на каждой панели. Масштабная линейка = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 6
Рисунок 6: Покадровый анализ длины персистирующих и мертвых клеток с помощью микроскопии. Анализ длины клеток мертвых клеток (красный, n = 109) и персистентных клеток (серый, n = 13). Начало лечения OFX (5 мкг·мл-1) обозначено красной пунктирной линией (5 ч), а удаление OFX обозначено синей пунктирной линией. Врезка соответствует фазе роста до добавления OFX. Эксперименты проводились в трех экземплярах. Штрихи и пунктирные линии обозначают стандартные отклонения для популяции мертвых клеток (n = 109). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 7
Рисунок 7: Микроскопический покадровый анализ репрезентативного персистента для OFX. (A) Кимограф репрезентативного персистента OFX и его дочерних клеток, генерируемых делением филаментов в течение 8,5 ч после удаления OFX (18,5 ч после начала микрофлюидного эксперимента, включающий 4 ч роста, 6 ч 5 мкг·мл -1 обработки OFX и 8,5 ч восстановления после удаления OFX). Один кадр соответствует 15 мин. Масштабная линейка = 5 мкм. (B) Маска, сгенерированная из персистентного кимографа в A. Контролируемая персистентная клетка обозначена синим контуром, а дочерние ячейки выделены четкими цветами. (C) Схематическое изображение персистентной клеточной линии, полученной из B. Цветовая кодировка идентична B. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Figure 8
Рисунок 8: Анализ длины клеток и флуоресценции mCherry репрезентативных персистентных и мертвых клеток. Анализ длины клетки (левая ось) и общей интенсивности флуоресценции HU-mCherry (правая ось, показанная в произвольных единицах) репрезентативного персистента (сплошные черные и красные линии) и репрезентативной мертвой клетки (пунктирная черная и красная линия) во время микрофлюидного покадрового эксперимента. Начало лечения OFX (5 мкг·мл-1) обозначается красной пунктирной линией, а удаление OFX - синей пунктирной линией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.

Видео 1: Микрофлюидное видео клеток E. coli HU-mCherry до, во время и после лечения офлоксацином. Микрофлюидная покадровая визуализация, показывающая клетки HU-mCherry. Клетки выращивали в течение 4 ч в глицерине MOPS 0,4%. После 6 часов лечения OFX (5 мкг·мл-1) среду, не содержащую антибиотиков, перфузировали в микрофлюидную пластинку, чтобы позволить персистирующим клеткам восстановиться. Масштабная линейка = 5 мкм. Указывается время (в минах). Фазы роста и восстановления обозначаются «MOPS-Gly. 0,4%» и лечение OFX «OFX 5 мкг/мл». Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.

10 ШВАБР
Стоковое решение Объем исходного раствора на 1 л 10x MOPS Конечная концентрация в 10-кратном основании MOPS
МОПС кислота 1 М (отрегулировано до pH 7,4 с помощью KOH) 400 мл 0,4 м
Трисин 1 М (отрегулировано до pH 7,4 с помощью KOH) 40 мл 0.04 м
FeSO4.7H2O 0.01 м 10 мл 0.0001 м
NH4Cl 1.9 М 50 мл 0.095 м
К2СО4  0.276 м 10 мл 0.00276 м
CaCl 2,2H2 O 0.0005 м 10 мл 0.000005 м
MgCl 2,6H2O 0.528 м 10 мл 0.00528 м
NaCl Добавить сразу 29,2 г 0,5 м
Дистиллированная вода 460 мл
Микронутриенты 1000x (см. Таблицу 2) 10 мл

Таблица 1: Состав 10x MOPS.

Микронутриенты 1000x
Концентрация в микронутриентах 1000x бульонный раствор Конечная концентрация в 10-кратном основании MOPS
(NH4)6Mo7O24.4H2O 0.000003 м 0.00000003 м
H 3BO3 0.0004 м 0.000004 м
CoCl 2,6H2 O 0.00003 м 0.0000003 м
CuSO4,5H 2O 0.00001 м 0.0000001 м
MnCl 2,4H2 O 0.00008 м 0.0000008 м
ZnSO.7H2O 0.00001 м 0,0000001М

Таблица 2: Состав 1 000х микронутриентов.

MOPS глюкоза 0,4% или MOPS глицерин 0,4%
Стоковое решение Объем для 1 л MOPS глюкозы 0,4 % или MOPS глицерина 0,4 % Конечная концентрация глюкозы MOPS 0,4% или глицерина MOPS 0,4%
10 ШВАБР см. таблицу 1 100 мл
К2ГПО4 0.132 м 10 мл 0.00132 м
Глюкоза (для MOPS глюкоза 0,4%) 20% (20 г в 100 мл дистиллированной воды) 20 мл 0.40%
Глицерин (для MOPS глицерин 0,4%) ≤99% 4 мл 0.40%
Дистиллированная вода 870 мл для глюкозы 0,4% или 886 мл для глицерина 0,4%

Таблица 3: Состав MOPS глюкозы 0,4% и MOPS глицерина 0,4%.

Discussion

Протокол, представленный в этой статье, позволяет проанализировать фенотип персистенции, наблюдаемый в ответ на лечение антибиотиками на популяционном и одноклеточном уровнях. Эксперименты проводились со штаммом E. coli MG1655, который выращивали в химически определенной среде (MOPS глицерин 0,4%). Анализы времени и микроскопические эксперименты проводились на экспоненциально-фазовых культурах. Мы использовали OFX, фторхинолон, в концентрации 5 мкг·мл-1 для выявления персистирующих клеток. Описанные здесь подходы могут быть применены к другим бактерицидным антибиотикам, таким как β-лактамы, аминогликозиды или противомикробные соединения31. Соответственно, можно использовать другие бактериальные штаммы, среды или условия роста. Мониторинг различных флуоресцентных слияний в аналогичной установке может быть полезен для отслеживания клеточных процессов, таких как репликация ДНК32, репарацияДНК 25,33 и делениеклеток 34 до, во время и после лечения антибиотиками. Точно так же флуоресцентные репортеры могут быть использованы для исследования различных аспектов физиологии клеток, таких как внутриклеточные уровни pH35, АТФ 36 или ROS37. В качестве альтернативы флуоресцентным слияниям также могут применяться химические красители. Например, слияние hupA-mCherry может быть заменено 4',6-диамидино-2-фенилиндолом (DAPI), флуоресцентным красителем, который окрашивает ДНК38. Однако следует избегать выполнения покадровой микроскопии в сочетании с такими флуоресцентными красителями, поскольку эти методы окрашивания могут нарушить динамику клеточного цикла во время покадровых экспериментов. В качестве альтернативы такие эксперименты могут быть заменены анализом временных ходов моментальных снимков в соответствующие моменты времени.

Хотя такие флуоресцентные репортеры полезны, не следует пренебрегать объемом информации, которая может быть извлечена с помощью анализа фазово-контрастных изображений. Здесь мы отслеживали эволюцию длины клеток на этапах роста, лечения OFX и восстановления. Другие параметры, основанные на фазово-контрастных изображениях, такие как ширина клеток, интенсивность фазового контраста и кривизны бактериальных клеток, также могут быть легко извлечены с помощью соответствующего программного обеспечения, такого как MicrobeJ27.

Таким образом, описанная здесь процедура может быть применена к другим условиям и видам бактерий для мониторинга клеточных реакций на изменяющиеся среды или стрессоры18,19. Используя другие флуоресцентные репортеры (транскрипционные и трансляционные репортеры, химические красители) в сочетании с популяционным анализом, таким как проточная цитометрия / FACS, интересные вопросы могут быть решены в многомасштабной структуре.

Disclosures

Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих интересов.

Acknowledgments

Работа в лаборатории Ван Мельдерена поддерживается акциями ARC 2018-2023, Национальным фондом научных исследований (FNRS CDR J.0182.21F). Т.О. поддерживается стипендией ULB. Т.С. поддерживается стипендией FRIA (FNRS). J.C. поддерживается постдокторской стипендией «Поверенный в исследованиях» (FNRS).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Axio Observer Zeiss Inverted fluorescence microscope
CaCl2.2H2O  Merck 1.02382.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CellASIC ONIX Microfluidic System  Merck CAX2-S0000  Microfluidic system
CellASIC ONIX2 FG Merck ONIX2 1.0.1  Microfluidic software
CellASIC ONIX2 Manifold Basic  Merck CAX2-MBC20 Manifold system
CoCl2.6H2O Merck 1.02539.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
CuSO4.5H2O Merck 1.02790.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
D-(+)-glucose Sigma Aldrich G7021-1KG Carbon source for MOPS glucose 0.4% growth medium
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) BE10 wt reference strain, lab strain
E. coli K-12 MG1655 CF1648 (fnr+) hupA-mCherry::FRT-kan-FRT BE16 HU-mCherry fusion integrated via P1 transduction at the native locus, lab strain
FeSO4.7H2O  VWR Chemicals 24244.232 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Fiji ImageJ https://fiji.sc/  Image software; Schindelin et al. if used in publication
Glycerol Merck 56815 Carbon source for MOPS glycerol 0.4% growth medium
Greiner CELLSTAR® multiwell culture plate Merck M8812-100EA 24-well clear flat bottom 2ml volume culture plate for automated plate reader
H3BO3  Sigma-Aldrich B6768-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Hamamatsu ORCA Flash 4.0 digital camera Hamamatsu C13440-20CU Digital Image Acqusition
K2HPO4 Merck 1.05099.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
KOH Merck 1.05029.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
K2SO4  Merck 1.05153.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Luria-Broth agar medium Invitrogen 22700041 Growth medium for plating assay
Luria-Broth medium Invitrogen 12780029 Growth medium for MIC determination
MgCl2.6H2O  Merck 1.05832.1000 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MgSO4 Merck 7487-88-9 Dilution solution for bacterial survival assay used at 10mM
MicrobeJ  Imagej/Fiji plugin https://www.microbej.com/ Microscopy image analysis plugin. Ducret et al.for in publication; Detection settings: For bacteria : Area (μm2): 0,1-max; Length (μm): 0,5-max; Width (μm): 0,6-max; Range (μm): 0,5-max; Angularity (rad): 0-0,3; 0-max for all other parameters. 
Microfluidic Plates CellASIC ONIX Merck B04A-03-5PK  Plate for microfluidic system
MnCl2.4H2O Merck 1.05927.0100 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
MOPS, Free Acid ULTROL® Grade Merck 475898-500GM For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NaCl SIgma-Aldrich S5886-1KG For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
(NH4)6Mo7O24.4H2O Merck 1.01180.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
NH4Cl  Merck 1.01145.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Ofloxacin Merck 82419-36-1 Fluoroquinolone antibiotic used to treat the bacterial cells
Phosphate Buffered Saline (PBS) pH 7.4, 1x Merck P3813 Dilution buffer
GENESYS 10S UV-Visible Spectrophotometer Thermofisher Scientific  840-208200 UV-Visible Spectrophotometer, Single/Six Cell Holder with PrinterMeasurement of optical density OD600nm
SoftMax Pro Molecular Devices Microplate reader software
SpectraMax i3x Molecular Devices Microplate reader
N-[Tris(hydroxyméthyl)-méthyl]-glycine Merck 1.08602.0250 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium
Zeiss® immersion Oil 518F Zeiss Immersion oil to increase resolution of microscope
Zen3.2 Pro Zeiss Microscopic image acquisition and processing software
ZnSO4.7H2O  Merck 1.08883.0500 For MOPS glucose 0.4% and MOPS glycerol 0.4% growth medium

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Balaban, N. Q., et al. Definitions and guidelines for research on antibiotic persistence. Nature Reviews Microbiology. 17 (7), 441-448 (2019).
  2. Brauner, A., Fridman, O., Gefen, O., Balaban, N. Q. Distinguishing between resistance, tolerance and persistence to antibiotic treatment. Nature Reviews Microbiology. 14 (5), 320-330 (2016).
  3. Pribis, J. P., Zhai, Y., Hastings, P. J., Rosenberg, S. M. Stress-induced mutagenesis, gambler cells, and stealth targeting antibiotic-induced evolution. mBio. 13 (3), 01074 (2022).
  4. Molina-Quiroz, R. C., Lazinski, D. W., Camilli, A., Levy, S. B. Transposon-sequencing analysis unveils novel genes involved in the generation of persister cells in uropathogenic Escherichia coli. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 60 (11), 6907-6910 (2016).
  5. Cameron, D. R., Shan, Y., Zalis, E. A., Isabella, V., Lewis, K. A genetic determinant of persister cell formation in bacterial pathogens. Journal of Bacteriology. 200 (17), 00303-00318 (2018).
  6. Cui, P., et al. Identification of genes involved in bacteriostatic antibiotic-induced persister formation. Frontiers in Microbiology. 9, 413 (2018).
  7. Li, T., et al. Identification of novel genes involved in Escherichia coli persistence to tosufloxacin. Frontiers in Cellular and Infection Microbiology. 10, 581986 (2020).
  8. Verstraeten, N., et al. Obg and membrane depolarization are part of a microbial bet-hedging strategy that leads to antibiotic tolerance. Molecular Cell. 59 (1), 9-21 (2015).
  9. Hofsteenge, N., van Nimwegen, E., Silander, O. K. Quantitative analysis of persister fractions suggests different mechanisms of formation among environmental isolates of E. coli. BMC Microbiology. 13 (1), 25 (2013).
  10. Huemer, M., Mairpady Shambat, S., Brugger, S. D., Zinkernagel, A. S. Antibiotic resistance and persistence-Implications for human health and treatment perspectives. EMBO Reports. 21 (12), 51034 (2020).
  11. Wilmaerts, D., Windels, E. M., Verstraeten, N., Michiels, J. General mechanisms leading to persister formation and awakening. Trends in Genetics. 35 (6), 401-411 (2019).
  12. Murawski, A. M., Brynildsen, M. P. Ploidy is an important determinant of fluoroquinolone persister survival. Current Biology. 31 (10), 2039-2050 (2021).
  13. Lemma, A. S., Soto-Echevarria, N., Brynildsen, M. P. Fluoroquinolone persistence in Escherichia coli requires DNA repair despite differing between starving populations. Microorganisms. 10 (2), 286 (2022).
  14. Balaban, N. Q., Merrin, J., Chait, R., Kowalik, L., Leibler, S. Bacterial persistence as a phenotypic switch. Science. 305 (5690), 1622-1625 (2004).
  15. Morawska, L. P., Kuipers, O. P. Antibiotic tolerance in environmentally stressed Bacillus subtilis: Physical barriers and induction of a viable but nonculturable state. microLife. 3, (2022).
  16. Windels, E. M., et al. Enrichment of persisters enabled by a ß-lactam-induced filamentation method reveals their stochastic single-cell awakening. Communications Biology. 2 (1), 426 (2019).
  17. Leygeber, M., et al. Analyzing microbial population heterogeneity-Expanding the toolbox of microfluidic single-cell cultivations. Journal of Molecular Biology. 431 (23), 4569-4588 (2019).
  18. Rojas, E., Theriot, J. A., Huang, K. C. Response of Escherichia coli growth rate to osmotic shock. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (21), 7807-7812 (2014).
  19. Shi, H., et al. Starvation induces shrinkage of the bacterial cytoplasm. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (24), 2104686118 (2021).
  20. Goode, O., et al. Persister Escherichia coli cells have a lower intracellular pH than susceptible cells but maintain their pH in response to antibiotic treatment. mBio. 12 (4), 00909-00921 (2021).
  21. Manuse, S., et al. Bacterial persisters are a stochastically formed subpopulation of low-energy cells. PLoS Biology. 19 (4), 3001194 (2021).
  22. Fisher, J. K., et al. Four-dimensional imaging of E. coli nucleoid organization and dynamics in living cells. Cell. 153 (4), 882-895 (2013).
  23. Cabral, D., Wurster, J., Belenky, P. Antibiotic persistence as a metabolic adaptation: Stress, metabolism, the host, and new directions. Pharmaceuticals. 11 (1), 14 (2018).
  24. Wiegand, I., Hilpert, K., Hancock, R. E. W. Agar and broth dilution methods to determine the minimal inhibitory concentration (MIC) of antimicrobial substances. Nature Protocols. 3 (2), 163-175 (2008).
  25. Goormaghtigh, F., Van Melderen, L. Single-cell imaging and characterization of Escherichia coli persister cells to ofloxacin in exponential cultures. Science Advances. 5 (6), (2019).
  26. Schindelin, J., et al. Fiji: An open-source platform for biological-image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  27. Ducret, A., Quardokus, E. M., Brun, Y. V. MicrobeJ, a tool for high throughput bacterial cell detection and quantitative analysis. Nature Microbiology. 1 (7), 16077 (2016).
  28. Odsbu, I., Skarstad, K. DNA compaction in the early part of the SOS response is dependent on RecN and RecA. Microbiology. 160 (5), 872-882 (2014).
  29. Pham, T. D. M., Ziora, Z. M., Blaskovich, M. A. T. Quinolone antibiotics. MedChemComm. 10 (10), 1719-1739 (2019).
  30. Drlica, K., et al. Quinolones: Action and resistance updated. Current Topics in Medicinal Chemistry. 9 (11), 981-998 (2009).
  31. Kohanski, M. A., Dwyer, D. J., Collins, J. J. How antibiotics kill bacteria: From targets to networks. Nature Reviews Microbiology. 8 (6), 423-435 (2010).
  32. Reyes-Lamothe, R., Sherratt, D. J., Leake, M. C. Stoichiometry and architecture of active DNA replication machinery in Escherichia coli. Science. 328 (5977), 498-501 (2010).
  33. Lesterlin, C., Ball, G., Schermelleh, L., Sherratt, D. J. RecA bundles mediate homology pairing between distant sisters during DNA break repair. Nature. 506 (7487), 249-253 (2014).
  34. Alexeeva, S., Gadella, T. W. J., Verheul, J., Verhoeven, G. S., Den Blaauwen, T. Direct interactions of early and late assembling division proteins in Escherichia coli cells resolved by FRET: Bacterial division studied by spectral FRET. Molecular Microbiology. 77 (2), 384-398 (2010).
  35. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  36. Yaginuma, H., et al. Diversity in ATP concentrations in a single bacterial cell population revealed by quantitative single-cell imaging. Scientific Reports. 4, 6522 (2014).
  37. Ermakova, Y. G., et al. Red fluorescent genetically encoded indicator for intracellular hydrogen peroxide. Nature Communications. 5, 5222 (2014).
  38. Kapuscinski, J. DAPI: A DNA-specific fluorescent probe. Biotechnic & Histochemistry. 70 (5), 220-233 (1995).

Tags

Биология выпуск 193 Персистенция антибиотиков популяционный анализ одноклеточный анализ кишечная палочка офлоксацин флуоресцентная микроскопия микрофлюидика
Популяционный и одноклеточный анализ персистенции антибиотиков при <em>Escherichia coli</em>
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron,… More

Oms, T., Schlechtweg, T., Cayron, J., Van Melderen, L. Population and Single-Cell Analysis of Antibiotic Persistence in Escherichia coli. J. Vis. Exp. (193), e64550, doi:10.3791/64550 (2023).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter