Artículo de método

Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones

DOI:

10.3791/64566

⸱

23 de junio de 2023

 ,  ,  , 
1Department of General Pathology, Institute of Biological Sciences, Federal University of Minas Gerais, 2Department of Cell Biology and Molecular Genetics, University of Maryland

En este artículo

Resumen

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El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Resumen

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Los macrófagos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación. Estas células están presentes en todos los tejidos del cuerpo y tienen la importante capacidad de cambiar su perfil de acuerdo con los estímulos presentes en el microambiente. Las citocinas pueden afectar profundamente a la fisiología de los macrófagos, especialmente al IFN-γ y a la interleucina 4, generando tipos M1 y M2 respectivamente. Debido a la versatilidad de estas células, la producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea puede ser un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores en el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de progenitores de médula ósea. Los progenitores de médula ósea de ratones C57BL/6 libres de patógenos se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que, en este protocolo, se obtiene del sobrenadante del linaje de fibroblastos murinos L-929. Después de la incubación, los macrófagos maduros están disponibles para su uso del7º al 10º día. Un solo animal puede ser la fuente de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Por lo tanto, es un protocolo ideal para la obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios utilizando métodos básicos de cultivo celular.

Introducción

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Los monocitos y macrófagos son fagocitos mononucleares que pueden derivarse de progenitores en la médula ósea. Estudios recientes han reportado que los macrófagos también se originan a partir de progenitores eritromieloides derivados del saco vitelino1. Independientemente de su derivación, estos leucocitos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación 2,3. Los monocitos son células de sangre periférica que pueden diferenciarse en macrófagos en el tejido 2,4, mientras que los macrófagos son células heterogéneas que exhiben fenotipos y funciones reguladas por la exposición local a factores de crecimiento y citocinas5. Dado que los macrófagos muestran tal diversidad funcional, se han estudiado en muchos modelos de enfermedades. Así, el cultivo in vitro de macrófagos se ha convertido en una herramienta importante para comprender su fisiología y su papel en diferentes enfermedades. La médula ósea es una fuente importante de células progenitoras, incluidos los progenitores de macrófagos, que pueden aislarse y multiplicarse, aumentando exponencialmente el número de macrófagos obtenidos. Además, los macrófagos derivados de la médula ósea son especialmente importantes para evitar los efectos generados por el microambiente tisular, ya que los macrófagos cambian su fenotipo en respuesta a diferentes estímulos en los tejidos 6,7. Los progenitores de la médula ósea se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)8. Los macrófagos derivados de la médula ósea no se pueden distinguir de los macrófagos derivados de monocitos mediante marcadores bioquímicos en los tejidos. Estas células representan una población muy homogénea de células primarias, que en muchos otros aspectos son comparables a los macrófagos peritoneales 6,9.

Debido a su conjunto heterogéneo de funciones celulares, los macrófagos han sido estudiados minuciosamente por los investigadores. Estas células pueden ser utilizadas en diferentes modelos experimentales, incluyendo enfermedades infecciosas e inflamatorias, ya que están presentes en estos procesos10,11. También pueden ser útiles para investigar la polarización de los macrófagos en respuesta a diversos estímulos microambientales12,13. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo simple y confiable con el fin de obtener un alto número de macrófagos primarios de la médula ósea del ratón.

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Protocolo

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Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA). Se compraron ratones C57BL/6 en Biotério Central de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Se debe utilizar equipo de protección personal (EPP), como batas de laboratorio, guantes y protección ocular, en todos los pasos descritos en este protocolo.

1. Preparación del sobrenadante del linaje de fibroblastos L-929 como fuente de M-CSF

  1. Descongele las células del linaje de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie el proceso de cultivo inmediatamente para preservar la viabilidad.
  2. En una cabina de bioseguridad de flujo laminar, utilizando una pipeta de 1.000 μL, transfiera las células del linaje de fibroblastos L-929 del vial a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
  3. Utilice una pipeta serológica para añadir 50 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), libre de calcio y magnesio.
  4. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
  5. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de Eagle's medium-F12 modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) utilizando una pipeta serológica.
  6. Transfiera las células resuspendidas a un matraz de cultivo celular T75.
  7. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa.
    NOTA: Al manipular el matraz, tenga cuidado de evitar mojar la tapa con solución, ya que esto puede ser una fuente de contaminación. Para obtener una cantidad conveniente de sobrenadante, es necesario replicar las células después de que cubran toda la superficie del matraz de cultivo celular. Las células L-929 se inhiben por contacto. Calentar la solución de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DMEM/F12-10, y PBS estéril a 37 °C para iniciar la expansión del cultivo celular, como se describe en los siguientes pasos.
  8. Una vez alcanzada la confluencia completa, desechar el sobrenadante del matraz de cultivo celular, dentro de la cabina de bioseguridad de flujo laminar.
  9. Lave el matraz de cultivo celular con 20 mL de PBS estéril utilizando una pipeta serológica y deseche la solución.
  10. Añadir 10 mL de tripsina/EDTA (solución al 0,05%) al matraz de cultivo celular que contiene las células adheridas.
  11. Transfiera el matraz de cultivo celular de flujo laminar a una incubadora de CO2 al 5% de 37 °C e incube durante 3 min.
  12. Agite el matraz de cultivo celular para disociar las células de la superficie del matraz de cultivo y utilice un microscopio para asegurarse de que todas las células se han disociado.
  13. Inactivar la tripsina/EDTA (solución al 0,05%) con 10 mL de medio DMEM/F12-10.
  14. Transfiera la solución con una pipeta serológica a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL.
  15. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante.
  16. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio DMEM/F12-10.
  17. Añadir 1 mL de la suspensión celular a un matraz de cultivo celular T175 (cultivo 1:10).
  18. Repita el procedimiento para obtener diez matraces de cultivo celular T175.
  19. Añadir 50 mL de DMEM/F12-10 a cada matraz de cultivo celular.
  20. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa.
    NOTA: Estos pasos garantizan 500 mL de sobrenadante celular L-929. El día 5, después de que las células hayan cubierto la superficie del matraz de cultivo celular T175, el sobrenadante se enriquecerá para M-CSF y debe recogerse14.
  21. Retire el matraz de cultivo celular de la incubadora el día 5 después de la inhibición por contacto.
  22. Transfiera el medio a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml.
  23. Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min.
  24. Recoja el sobrenadante enriquecido con M-CSF y transfiera la solución a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Conservar en el congelador a -20 °C.
    NOTA: La centrifugación es extremadamente importante para eliminar las células y los desechos de los sobrenadantes.
  25. El sobrenadante L-929 es una fuente conveniente y económica de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y generalmente contiene de 5 a 10 ng/mL de M-CSF8. Estos sobrenadantes también contienen trazas de otras citocinas y factores de crecimiento, pero no ejercen una influencia profunda en la fisiología de los macrófagos15. Sin embargo, el M-CSF purificado puede comprarse y utilizarse como alternativa a los sobrenadantes L-929 en concentraciones de 1 a 2 ng/mL8.

2. Extirpación del fémur y la tibia

  1. Proceder a la eutanasia de ratón macho C57BL-6 de 8 semanas de edad por luxación cervical después de asfixia por dióxido de carbono, de acuerdo con la resolución normativa número 18 del Consejo Nacional de Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA).
  2. Remoje el ratón con una solución de etanol al 70% y use tijeras estériles para hacer una incisión de 1 cm a lo largo del abdomen.
  3. Retire la piel hasta que el músculo de las patas traseras esté completamente expuesto.
  4. Retire las patas traseras a la altura de la cadera, teniendo cuidado de no romperse el fémur y la tibia.
  5. Coloque las patas traseras en un tubo centrífugo cónico con una solución de etanol al 70%.
    NOTA: Utilice siempre ratones libres de patógenos. Asegúrate de recoger ambas patas para lograr un mayor número de células. El paso 2 se realiza en un entorno no estéril (mesa de trabajo). Por lo tanto, es importante extirpar el fémur y la tibia con cuidado para que permanezcan intactos y evitar la contaminación bacteriana. Los pasos restantes de este procedimiento se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad de flujo laminar. El tiempo de exposición de las patas a una solución de etanol al 70% debe limitarse a 10 minutos. Si el tiempo es más largo, los progenitores de la médula ósea pueden verse afectados.

3. Obtener progenitores de médula ósea a partir de la luz de la tibia y el fémur

  1. Retire las patas de la solución de etanol al 70% y transfiéralas a PBS estéril.
  2. Usar fórceps y toallitas desinfectantes para eliminar todo el músculo y la fascia. El hueso debe estar limpio después de este paso.
  3. Use una hoja de bisturí quirúrgico estéril para cortar la epífisis ósea en ambos extremos para exponer la médula ósea.
  4. Llene una jeringa de 20 ml con 10 ml de PBS estéril suplementado con una solución de penicilina/estreptomicina al 2% y conecte una aguja de 26 g.
  5. Sostenga el hueso con pinzas de disección anatómica con una mano y use la otra para insertar la aguja en la cavidad ósea. Tenga cuidado de no aplastar el hueso con las pinzas.
  6. Lave el interior del hueso con el PBS y recoja la médula ósea en un tubo centrífugo cónico estéril. Después de este paso, la cavidad ósea debe aparecer blanca.
  7. Centrifugar las células recogidas durante 10 min a 300 x g a 4 °C.
  8. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de DMEM/F12-10.
  9. Homogeneizar y añadir otros 9 mL de medio DMEM/F12-10 para llevar las células hasta un total de 10 mL.

4. Cultivo de macrófagos

  1. Añadir 1 mL de progenitores celulares a cada una de las placas de Petri redondas de plástico de 100 mm x 20 mm (un total de 10 placas), distribuyendo las células a través de las placas con una pipeta para obtener una distribución uniforme. No utilice platos tratados con cultivo de tejidos.
  2. Añadir 9 mL de DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante celular L-929 a cada placa.
  3. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 .
  4. Al3º día, añadir 10 mL de medio DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante de células L-929 a cada placa. De esta manera, las placas de cultivo tienen ahora un total de 20 mL de medio de cultivo, suficiente para el crecimiento de las células hasta el final de su maduración.
    NOTAS: No se deben utilizar placas tratadas con cultivo de tejidos porque los macrófagos, como células adherentes naturales marcadas por fuertes interacciones con las superficies, no se disociarán fácilmente de la placa más tarde. Por lo general, los progenitores celulares de un ratón (dos fémures) se pueden sembrar en 10 placas de cultivo. Los progenitores celulares se transformarán en macrófagos, que se pueden utilizar desde el día 7 hasta el 10 de incubación. La confirmación de la maduración se identifica por cambios en la morfología de los macrófagos. Los macrófagos maduros son adherentes y muestran una morfología heterogénea, explicada por la emisión de seudópodos en diferentes direcciones. Ejemplos de estas células maduras se muestran en los resultados representativos.

5. Recolección de macrófagos

  1. Deseche los sobrenadantes de todos los platos de cultivo.
  2. Lave cada placa de cultivo con 10 mL de PBS estéril tibio (37 °C) sin Mg2+ y Ca2+ .
  3. Deseche la solución de cada plato.
  4. Precalentar la solución de disociación celular no enzimática a 37 °C y añadir 3 mL a cada plato. Incubar durante 10 min en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y 37 °C. Utilice un microscopio invertido para visualizar si los macrófagos se están disociando de las placas de cultivo.
    NOTA: El uso de placas de plástico tratadas sin cultivo de tejidos debería permitir la fácil disociación de las células y evitar la necesidad de raspar las células de la placa.
  5. Lavar los platos con una pipeta serológica con la solución de disociación celular no enzimática una y otra vez, realizando movimientos circulares para confirmar que todos los macrófagos están disociados del plato.
  6. Recoja la solución de todas las placas de cultivo juntas en un tubo centrífugo cónico de 50 mL.
  7. Añada 10 ml de PBS estéril precalentado a las placas de cultivo vacías y proceda como se indica en el paso 5.4. Este procedimiento es una repetición del paso 5.4 y pretende garantizar que se recojan todos los macrófagos.
  8. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min.
  9. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 mL de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta y cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para evitar dañar las células.
  10. Prepare una alícuota de 10 μL de solución de macrófagos diluida con 10 μL de Azul de Tripán para contar las células usando el hemocitómetro.
    NOTA: En el día 7, cada plato producirá aproximadamente 2 x 106 macrófagos. Esto significa que un ratón puede producir aproximadamente 2 x 107 macrófagos primarios cuando se cosecha en diez placas. Dado que el M-CSF solo impulsa la maduración de los macrófagos, el procedimiento garantiza una población de células que son esencialmente solo macrófagos y libres de otros leucocitos contaminantes.

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Resultados

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Los macrófagos son células grandes y adherentes con características fisiológicas especiales. Muestran una diversidad de presentaciones morfológicas en cultivo debido a la capacidad de adherirse al vidrio y al plástico, y su morfología típica de dispersión está relacionada con la emisión de extensiones citoplasmáticas (Figura 1). Una vez que los progenitores de la médula ósea se exponen al M-CSF del sobrenadante celular L-929 y comienzan la transformación en macrófagos maduros, se adhieren a ...

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Discusión

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La producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea es un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular, especialmente cuando es importante lograr una población homogénea de células primarias. Como se mencionó, los progenitores celulares solo pueden transformarse en macrófagos en presencia de M-CSF. Los sobrenadantes celulares L-929 se pueden utilizar como fuente principal de M-CSF. Aparte del costo, no hay problema con el uso de M-CSF recombinante en sí mismo

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Divulgaciones

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Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabajo contó con el apoyo de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), a través de la Red de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) y la Red Minera de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de Brasil.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Jeringa de 20 ccDESCARPACKSI100S4GJeringa estéril
Agujas de 26 GBD497AQDKT7Agujas estériles Tubo
centrífuga cónico de 50 mlSARSTEDT62547254Tubos cónicos de plástico aptos para la centrifugación Solución de
etanol al 70%EMFAL490Solución de etanol para esterilización
Disección anatómica pinza3B SCIENTIFICW1670Mantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70%
C57Bl/6 ratón de tipo salvajeComprado en Bioté rio Central de la Universidad Federal de Minas GeraisNo aplicableLos ratones deben estar libres de patógenos específicos, con una edad comprendida entre las 6 y las 10 semanas. Los ratones deben acomodarse al menos una semana antes para recuperarse del estrés del transporte
Matraz de cultivo celular T175GREINERC7481-50EAMatraz T-175, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa, sin RNasa
Matraz de cultivo celular T75GREINERC7231-120EAMatraz T-75, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa,
Desinfectante o toallitas húmedas para bebés sin RNASA?CLOROXNo aplicableAyuda a limpiar el hueso
Agua destiladaGIBCO15230Agua destilada estéril
DMEM/F12-10No aplicableNo aplicable Añadir10 mL de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1 mL de Penicilina/Estreptomicina (P/S) al DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + sobrenadante de células L-929No aplicableNo aplicableAñadir 20% de sobrenadante de cultivo de células L929 en DMEM/F-12-10
Dulbecco′ s Eagle&prime modificado; s Medio - F12 (DMEM/F12)GIBCO12500096DMEM: F-12 Medium contiene 2,5 mM de L-glutamina, 15 mM de HEPES, 0,5 mM de piruvato de sodio y 1200 mg/L de bicarbonato de sodio. Vuelva a suspender el polvo a 1 litro de agua destilada
y agregue 3,7 g de bicarbonato de sodio. Ajuste el pH a 7,2 y filtre con 0,22 µM. Almacenamiento a 2 - 8 ° C congelador
Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, Estados Unidos (FBS)10082147GIBCODMM-F12
SIGMA-ALDRICHZ359629Se utiliza para contar macrófagos al microscopio
Células L-929SIGMA-ALDRICHATCC # CCL-1L-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizadas como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)
Nikon TI eclipse NIKON No aplicableNikon TI Eclipse es un microscopio de fluorescencia y contraste de fase
Solución de disociación celular no enzimáticaCELLSTRIPER (CORNING)25-056-CISolución de disociación celular no enzimática Elimine los macrófagos de la placa sin dañarlos
Placas de cultivo redondas no tratadas 100 × 20– mmCORNINGCLS430591No utilice placas de Petri tratadas con cultivo de tejidos ni ninguna placa tratada con cultivo de tejidos
P3199 Penicilina G Sal de potasioUSBIOLOGICAL113-98-4Antibióticos
penicilina y estreptomicina (P/S)Utilice 0,26 gramos de penicilina y 0,40 gramos de estreptomicina. Mezclar con 40 mL de PBS estéril. Dentro de una cabina de flujo laminar horizontal, utilice un 0,22 µ M filtrar y almacenar alícuotas de 1,0 mL en tubos de microfuga de 1,5 ml en el congelador (-20° C)
Solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS)MEDIATECH21-040-CM
S7975 Sulfato de estreptomicina estéril, 650-850U/mgUSBIOLOGICAL3810-74-0Antibióticos Pipetas
serológicas de 10 ml o 25 mlSARSTEDT861254001pipetas serológicas se utilizan volúmenes superiores a 1 mL
Bicarbonato de sodioSIGMA-ALDRICH144-55-8 Corrección depH para el software DMEM-F12
Nis Elements ViewerNIKONNo aplicableNIS-Elements Viewer es un programa independiente gratuito para ver archivos de imagen y conjuntos de datos
PBS estéril y solución al 2% de P/SLABORCRIN590338Agregue 1 mL de P/S en 40 mL de PBS estéril
Tijeras de iris rectoKATENANo aplicableMantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70%
Supernadante de células L-929No aplicableNo aplicableL-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizado como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El sobrenadante L-929 se obtuvo del protocolo
Hoja de bisturí quirúrgico No.24 Acero inoxidableSWANN-MORTON311Se utiliza para exponer la epífisis de los huesos Solución de azul de
tripano, 0,4%GIBCO15250061La solución de azul de tripano, 0,4%, se utiliza de forma rutinaria como tinción celular para evaluar la viabilidad celular mediante la prueba de exclusión de colorante
Solución de tripsina/EDTA 0,05%GIBCO25300-062Se utiliza para disociar células de la botella de cultivo
Agua para inyección (WFI) para cultivo celularGIBCOA12873Agua estéril y libre de endotoxinas
de ¿Enriquecimiento de para el hemocitómetro Solución de

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