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Summary

El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.

Abstract

Los macrófagos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación. Estas células están presentes en todos los tejidos del cuerpo y tienen la importante capacidad de cambiar su perfil de acuerdo con los estímulos presentes en el microambiente. Las citocinas pueden afectar profundamente a la fisiología de los macrófagos, especialmente al IFN-γ y a la interleucina 4, generando tipos M1 y M2 respectivamente. Debido a la versatilidad de estas células, la producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea puede ser un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores en el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de progenitores de médula ósea. Los progenitores de médula ósea de ratones C57BL/6 libres de patógenos se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que, en este protocolo, se obtiene del sobrenadante del linaje de fibroblastos murinos L-929. Después de la incubación, los macrófagos maduros están disponibles para su uso del^{7º al 10º} día. Un solo animal puede ser la fuente de aproximadamente 2 x 10⁷ macrófagos. Por lo tanto, es un protocolo ideal para la obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios utilizando métodos básicos de cultivo celular.

Introduction

Los monocitos y macrófagos son fagocitos mononucleares que pueden derivarse de progenitores en la médula ósea. Estudios recientes han reportado que los macrófagos también se originan a partir de progenitores eritromieloides derivados del saco vitelino¹. Independientemente de su derivación, estos leucocitos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación ^2,3. Los monocitos son células de sangre periférica que pueden diferenciarse en macrófagos en el tejido ^2,4, mientras que los macrófagos son células heterogéneas que exhiben fenotipos y funciones reguladas por la exposición local a factores de crecimiento y citocinas⁵. Dado que los macrófagos muestran tal diversidad funcional, se han estudiado en muchos modelos de enfermedades. Así, el cultivo in vitro de macrófagos se ha convertido en una herramienta importante para comprender su fisiología y su papel en diferentes enfermedades. La médula ósea es una fuente importante de células progenitoras, incluidos los progenitores de macrófagos, que pueden aislarse y multiplicarse, aumentando exponencialmente el número de macrófagos obtenidos. Además, los macrófagos derivados de la médula ósea son especialmente importantes para evitar los efectos generados por el microambiente tisular, ya que los macrófagos cambian su fenotipo en respuesta a diferentes estímulos en los tejidos ^6,7. Los progenitores de la médula ósea se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF)⁸. Los macrófagos derivados de la médula ósea no se pueden distinguir de los macrófagos derivados de monocitos mediante marcadores bioquímicos en los tejidos. Estas células representan una población muy homogénea de células primarias, que en muchos otros aspectos son comparables a los macrófagos peritoneales ^6,9.

Debido a su conjunto heterogéneo de funciones celulares, los macrófagos han sido estudiados minuciosamente por los investigadores. Estas células pueden ser utilizadas en diferentes modelos experimentales, incluyendo enfermedades infecciosas e inflamatorias, ya que están presentes en estos procesos^10,11. También pueden ser útiles para investigar la polarización de los macrófagos en respuesta a diversos estímulos microambientales^12,13. Por lo tanto, aquí se proporciona un protocolo simple y confiable con el fin de obtener un alto número de macrófagos primarios de la médula ósea del ratón.

Protocol

Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA). Se compraron ratones C57BL/6 en Biotério Central de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Se debe utilizar equipo de protección personal (EPP), como batas de laboratorio, guantes y protección ocular, en todos los pasos descritos en este protocolo. 1. Preparación del sobrenadante del linaje de fibroblastos L-929 como fuente de M-CSF Descongele las células del linaje de fibroblastos L-929 (American Type Culture Collection Certified Cell Line-ATCC CCL1) e inicie el proceso de cultivo inmediatamente para preservar la viabilidad. En una cabina de bioseguridad de flujo laminar, utilizando una pipeta de 1.000 μL, transfiera las células del linaje de fibroblastos L-929 del vial a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Utilice una pipeta serológica para añadir 50 ml de solución salina estéril tamponada con fosfato (PBS), libre de calcio y magnesio. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 20 mL de Eagle’s medium-F12 modificado de Dulbecco suplementado con un 10% de suero fetal bovino (FBS) y 1 mL de penicilina/estreptomicina (P/S) (DMEM/F12-10) utilizando una pipeta serológica. Transfiera las células resuspendidas a un matraz de cultivo celular T75. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa.NOTA: Al manipular el matraz, tenga cuidado de evitar mojar la tapa con solución, ya que esto puede ser una fuente de contaminación. Para obtener una cantidad conveniente de sobrenadante, es necesario replicar las células después de que cubran toda la superficie del matraz de cultivo celular. Las células L-929 se inhiben por contacto. Calentar la solución de tripsina/ácido etilendiaminotetraacético (EDTA), DMEM/F12-10, y PBS estéril a 37 °C para iniciar la expansión del cultivo celular, como se describe en los siguientes pasos. Una vez alcanzada la confluencia completa, desechar el sobrenadante del matraz de cultivo celular, dentro de la cabina de bioseguridad de flujo laminar. Lave el matraz de cultivo celular con 20 mL de PBS estéril utilizando una pipeta serológica y deseche la solución. Añadir 10 mL de tripsina/EDTA (solución al 0,05%) al matraz de cultivo celular que contiene las células adheridas. Transfiera el matraz de cultivo celular de flujo laminar a una incubadora de CO2 al 5% de 37 °C e incube durante 3 min. Agite el matraz de cultivo celular para disociar las células de la superficie del matraz de cultivo y utilice un microscopio para asegurarse de que todas las células se han disociado. Inactivar la tripsina/EDTA (solución al 0,05%) con 10 mL de medio DMEM/F12-10. Transfiera la solución con una pipeta serológica a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Centrifugar a 300 x g a 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante. Vuelva a suspender el pellet en 10 mL de medio DMEM/F12-10. Añadir 1 mL de la suspensión celular a un matraz de cultivo celular T175 (cultivo 1:10). Repita el procedimiento para obtener diez matraces de cultivo celular T175. Añadir 50 mL de DMEM/F12-10 a cada matraz de cultivo celular. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 hasta la confluencia completa.NOTA: Estos pasos garantizan 500 mL de sobrenadante celular L-929. El día 5, después de que las células hayan cubierto la superficie del matraz de cultivo celular T175, el sobrenadante se enriquecerá para M-CSF y debe recogerse14. Retire el matraz de cultivo celular de la incubadora el día 5 después de la inhibición por contacto. Transfiera el medio a un tubo de centrífuga estéril de 50 ml. Centrifugar a 3.200 x g, a 4 °C durante 10 min. Recoja el sobrenadante enriquecido con M-CSF y transfiera la solución a un tubo de centrífuga estéril de 50 mL. Conservar en el congelador a -20 °C.NOTA: La centrifugación es extremadamente importante para eliminar las células y los desechos de los sobrenadantes. El sobrenadante L-929 es una fuente conveniente y económica de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) y generalmente contiene de 5 a 10 ng/mL de M-CSF8. Estos sobrenadantes también contienen trazas de otras citocinas y factores de crecimiento, pero no ejercen una influencia profunda en la fisiología de los macrófagos15. Sin embargo, el M-CSF purificado puede comprarse y utilizarse como alternativa a los sobrenadantes L-929 en concentraciones de 1 a 2 ng/mL8. 2. Extirpación del fémur y la tibia Proceder a la eutanasia de ratón macho C57BL-6 de 8 semanas de edad por luxación cervical después de asfixia por dióxido de carbono, de acuerdo con la resolución normativa número 18 del Consejo Nacional de Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA). Remoje el ratón con una solución de etanol al 70% y use tijeras estériles para hacer una incisión de 1 cm a lo largo del abdomen. Retire la piel hasta que el músculo de las patas traseras esté completamente expuesto. Retire las patas traseras a la altura de la cadera, teniendo cuidado de no romperse el fémur y la tibia. Coloque las patas traseras en un tubo centrífugo cónico con una solución de etanol al 70%.NOTA: Utilice siempre ratones libres de patógenos. Asegúrate de recoger ambas patas para lograr un mayor número de células. El paso 2 se realiza en un entorno no estéril (mesa de trabajo). Por lo tanto, es importante extirpar el fémur y la tibia con cuidado para que permanezcan intactos y evitar la contaminación bacteriana. Los pasos restantes de este procedimiento se llevan a cabo en una cabina de bioseguridad de flujo laminar. El tiempo de exposición de las patas a una solución de etanol al 70% debe limitarse a 10 minutos. Si el tiempo es más largo, los progenitores de la médula ósea pueden verse afectados. 3. Obtener progenitores de médula ósea a partir de la luz de la tibia y el fémur Retire las patas de la solución de etanol al 70% y transfiéralas a PBS estéril. Usar fórceps y toallitas desinfectantes para eliminar todo el músculo y la fascia. El hueso debe estar limpio después de este paso. Use una hoja de bisturí quirúrgico estéril para cortar la epífisis ósea en ambos extremos para exponer la médula ósea. Llene una jeringa de 20 ml con 10 ml de PBS estéril suplementado con una solución de penicilina/estreptomicina al 2% y conecte una aguja de 26 g. Sostenga el hueso con pinzas de disección anatómica con una mano y use la otra para insertar la aguja en la cavidad ósea. Tenga cuidado de no aplastar el hueso con las pinzas. Lave el interior del hueso con el PBS y recoja la médula ósea en un tubo centrífugo cónico estéril. Después de este paso, la cavidad ósea debe aparecer blanca. Centrifugar las células recogidas durante 10 min a 300 x g a 4 °C. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 1 mL de DMEM/F12-10. Homogeneizar y añadir otros 9 mL de medio DMEM/F12-10 para llevar las células hasta un total de 10 mL. 4. Cultivo de macrófagos Añadir 1 mL de progenitores celulares a cada una de las placas de Petri redondas de plástico de 100 mm x 20 mm (un total de 10 placas), distribuyendo las células a través de las placas con una pipeta para obtener una distribución uniforme. No utilice platos tratados con cultivo de tejidos. Añadir 9 mL de DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante celular L-929 a cada placa. Incubar en una incubadora a 37 °C, 5% de CO2 . Al3º día, añadir 10 mL de medio DMEM/F12-10 suplementado con un 20% del sobrenadante de células L-929 a cada placa. De esta manera, las placas de cultivo tienen ahora un total de 20 mL de medio de cultivo, suficiente para el crecimiento de las células hasta el final de su maduración.NOTAS: No se deben utilizar placas tratadas con cultivo de tejidos porque los macrófagos, como células adherentes naturales marcadas por fuertes interacciones con las superficies, no se disociarán fácilmente de la placa más tarde. Por lo general, los progenitores celulares de un ratón (dos fémures) se pueden sembrar en 10 placas de cultivo. Los progenitores celulares se transformarán en macrófagos, que se pueden utilizar desde el día 7 hasta el 10 de incubación. La confirmación de la maduración se identifica por cambios en la morfología de los macrófagos. Los macrófagos maduros son adherentes y muestran una morfología heterogénea, explicada por la emisión de seudópodos en diferentes direcciones. Ejemplos de estas células maduras se muestran en los resultados representativos. 5. Recolección de macrófagos Deseche los sobrenadantes de todos los platos de cultivo. Lave cada placa de cultivo con 10 mL de PBS estéril tibio (37 °C) sin Mg2+ y Ca2+ . Deseche la solución de cada plato. Precalentar la solución de disociación celular no enzimática a 37 °C y añadir 3 mL a cada plato. Incubar durante 10 min en una incubadora a 37 °C con 5% deCO2 y 37 °C. Utilice un microscopio invertido para visualizar si los macrófagos se están disociando de las placas de cultivo.NOTA: El uso de placas de plástico tratadas sin cultivo de tejidos debería permitir la fácil disociación de las células y evitar la necesidad de raspar las células de la placa. Lavar los platos con una pipeta serológica con la solución de disociación celular no enzimática una y otra vez, realizando movimientos circulares para confirmar que todos los macrófagos están disociados del plato. Recoja la solución de todas las placas de cultivo juntas en un tubo centrífugo cónico de 50 mL. Añada 10 ml de PBS estéril precalentado a las placas de cultivo vacías y proceda como se indica en el paso 5.4. Este procedimiento es una repetición del paso 5.4 y pretende garantizar que se recojan todos los macrófagos. Centrifugar a 300 x g, 4 °C durante 10 min. Deseche el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet con 1 mL de DMEM/F12-10. Homogeneizar lenta y cuidadosamente hacia arriba y hacia abajo con la pipeta para evitar dañar las células. Prepare una alícuota de 10 μL de solución de macrófagos diluida con 10 μL de Azul de Tripán para contar las células usando el hemocitómetro.NOTA: En el día 7, cada plato producirá aproximadamente 2 x 106 macrófagos. Esto significa que un ratón puede producir aproximadamente 2 x 107 macrófagos primarios cuando se cosecha en diez placas. Dado que el M-CSF solo impulsa la maduración de los macrófagos, el procedimiento garantiza una población de células que son esencialmente solo macrófagos y libres de otros leucocitos contaminantes.

Representative Results

Los macrófagos son células grandes y adherentes con características fisiológicas especiales. Muestran una diversidad de presentaciones morfológicas en cultivo debido a la capacidad de adherirse al vidrio y al plástico, y su morfología típica de dispersión está relacionada con la emisión de extensiones citoplasmáticas (Figura 1). Una vez que los progenitores de la médula ósea se exponen al M-CSF del sobrenadante celular L-929 y comienzan la transformación en macrófagos maduros…

Discussion

La producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea es un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular, especialmente cuando es importante lograr una población homogénea de células primarias. Como se mencionó, los progenitores celulares solo pueden transformarse en macrófagos en presencia de M-CSF. Los sobrenadantes celulares L-929 se pueden utilizar como fuente principal de M-CSF. Aparte del costo, no hay problema con el uso de M-CSF recombinante en sí mismo<sup clas…

Materials

20-cc syringe	DESCARPACK	SI100S4G	Sterile syringe
26-G needles	BD	497AQDKT7	Sterile needles
50-ml conical centrifuge tube	SARSTEDT	62547254	Plastic conical tubes suitable for centrifugation
70% ethanol solution	EMFAL	490	Ethanol solution for esterilization
Anatomical dissection forceps	3B SCIENTIFIC	W1670	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
C57Bl/6 wild type mouse	Purchased from Biotério Central at Federal University of Minas Gerais	Not applicable	Mice must be specific-pathogen-free, age between 6 and 10 weeks. Mice need be accommodated at least one week earlier for recovering from the stress of transportation
Cell culture flask T175	GREINER	C7481-50EA	T-175 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Cell culture flask T75	GREINER	C7231-120EA	T-75 flask, canted neck, surface area 75 cm2, with filter cap, DNase free, RNase free
Disinfecting or baby Wipes₁	CLOROX	Not applicable	It helps cleaning the bone
Distilled Water	GIBCO	15230	Sterile distilled water
DMEM/F12-10	Not applicable	Not applicable	Add 10 mL of Fetal Bovine Serum (FBS) and 1 mL of Penicillin/ Streptomycin (P/S) to DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL)
DMEM/F12-10 + supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	Add 20% of supernatant of L929 cells culture on DMEM/F-12-10
Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium – F12 (DMEM/F12)	GIBCO	12500096	DMEM: F-12 Medium contains 2.5 mM L-glutamine, 15 mM HEPES, 0.5 mM sodium pyruvate, and 1200 mg/L sodium bicarbonate.Resuspend powder to 1 liter of distilled water and add 3,7 g of sodium bicarbonate. Adjust pH to 7,2 and filter with 0,22 µM. Storage at 2 – 8 °C freezer
Fetal Bovine Serum, certified, heat inactivated, United States (FBS)	GIBCO	10082147	Enrichment for DMEM-F12
Hemocytometer	SIGMA-ALDRICH	Z359629	Used to count macrophages at microscopy
L-929 cells	SIGMA-ALDRICH	ATCC # CCL-1	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF)
Nikon TI eclipse	NIKON	Not applicable	Nikon TI Eclipse is a fluorescence and phase contrast microscope
Non-enzymatic cell dissociation solution	CELLSTRIPER (CORNING)	25-056-CI	Non-enzimatic cell dissociation solution remove macrophages from the plate without damaging them
Non-treated round culture dishes 100 × 20–mm	CORNING	CLS430591	Do not use tissue culture treated petri dishes or any tissue culture treated plate
P3199 Penicillin G Potassium Salt	USBIOLOGICAL	113-98-4	Antibiotics
Penicillin and streptomycin (P/S) solution			Use 0,26 grams of penicillin and 0,40 grams of streptomycin. Mix with 40 mL of sterile PBS. Inside a horizontal laminar flow cabinet, use a 0,22 µM filter and store aliquots of 1.0 mL in 1.5 ml microfuge tubes in the freezer (-20°C)
Phosphate Buffered Saline free from Calcium and Magnesium (PBS)	MEDIATECH	21-040-CM	Sterile
S7975 Streptomycin Sulfate, 650-850U/mg	USBIOLOGICAL	3810-74-0	Antibiotics
Serological pipettes of 10mL or 25 mL	SARSTEDT	861254001	Serological pipettes is used volumes higher than 1 mL
Sodium Bicarbonate	SIGMA-ALDRICH	144-55-8	pH correction for DMEM-F12
Software Nis Elements Viewer	NIKON	Not applicable	NIS-Elements Viewer is a free standalone program to view image files and datasets
Sterile PBS and 2% of P/S solution	LABORCRIN	590338	Add 1 mL of P/S in 40 mL of sterile PBS
Straight iris scissors	KATENA	Not applicable	Maintain in sterile beaker containing 70% ethanol solution
Supernatant of L-929 cells	Not applicable	Not applicable	L-929 is a lineage of mouse fibroblast cells used as a source of macrophage colony stimulating factor (M-CSF). L-929 supernatant was obtain from the protocol
Surgical Scalpel Blade No.24 Stainless Steel	SWANN-MORTON	311	Used for exposing epiphysis from bones
Trypan Blue Solution, 0.4%	GIBCO	15250061	Trypan Blue Solution, 0.4%, is routinely used as a cell stain to assess cell viability using the dye exclusion test
Trypsin/EDTA solution 0,05%	GIBCO	25300-062	Used to dissociate cells from culture bottle
Water for Injection (WFI) for Cell Culture	GIBCO	A12873	Sterile and endotoxin-free water