El presente protocolo describe el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea de ratones.
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Artículo de método
Aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de la médula ósea a partir de ratones
En este artículo
Resumen
Resumen
Los macrófagos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación. Estas células están presentes en todos los tejidos del cuerpo y tienen la importante capacidad de cambiar su perfil de acuerdo con los estímulos presentes en el microambiente. Las citocinas pueden afectar profundamente a la fisiología de los macrófagos, especialmente al IFN-γ y a la interleucina 4, generando tipos M1 y M2 respectivamente. Debido a la versatilidad de estas células, la producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea puede ser un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular. El objetivo de este protocolo es ayudar a los investigadores en el aislamiento y cultivo de macrófagos derivados de progenitores de médula ósea. Los progenitores de médula ósea de ratones C57BL/6 libres de patógenos se transforman en macrófagos tras la exposición al factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) que, en este protocolo, se obtiene del sobrenadante del linaje de fibroblastos murinos L-929. Después de la incubación, los macrófagos maduros están disponibles para su uso del7º al 10º día. Un solo animal puede ser la fuente de aproximadamente 2 x 107 macrófagos. Por lo tanto, es un protocolo ideal para la obtención de grandes cantidades de macrófagos primarios utilizando métodos básicos de cultivo celular.
Introducción
Los monocitos y macrófagos son fagocitos mononucleares que pueden derivarse de progenitores en la médula ósea. Estudios recientes han reportado que los macrófagos también se originan a partir de progenitores eritromieloides derivados del saco vitelino1. Independientemente de su derivación, estos leucocitos tienen importantes funciones efectoras en la homeostasis y la inflamación 2,3. Los monocitos son células de sangre periférica que pueden diferenciarse en macrófagos en el tejido 2,4, mientras que los macrófagos son células het....
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Protocolo
Este protocolo se llevó a cabo de acuerdo con el Consejo Nacional para el Control de la Experimentación Animal (Concea) y con la aprobación del Comité de Ética y Uso de Animales (CEUA). Se compraron ratones C57BL/6 en Biotério Central de la Universidad Federal de Minas Gerais (UFMG), Belo Horizonte, Brasil. Se debe utilizar equipo de protección personal (EPP), como batas de laboratorio, guantes y protección ocular, en todos los pasos descritos en este protocolo.
1. Preparación del sobrenadante del linaje de fibroblastos L-929 como fuente de M-CSF
- Descongele las células del linaje de fibroblastos L-929 (American Ty....
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Resultados
Los macrófagos son células grandes y adherentes con características fisiológicas especiales. Muestran una diversidad de presentaciones morfológicas en cultivo debido a la capacidad de adherirse al vidrio y al plástico, y su morfología típica de dispersión está relacionada con la emisión de extensiones citoplasmáticas (Figura 1). Una vez que los progenitores de la médula ósea se exponen al M-CSF del sobrenadante celular L-929 y comienzan la transformación en macrófagos maduros, se adhieren a .......
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Discusión
La producción de una población de macrófagos derivados de la médula ósea es un paso básico en muchos modelos experimentales de biología celular, especialmente cuando es importante lograr una población homogénea de células primarias. Como se mencionó, los progenitores celulares solo pueden transformarse en macrófagos en presencia de M-CSF. Los sobrenadantes celulares L-929 se pueden utilizar como fuente principal de M-CSF. Aparte del costo, no hay problema con el uso de M-CSF recombinante en sí mismo
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Divulgaciones
Los autores declaran que no tienen conflictos de intereses.
Agradecimientos
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de Minas Gerais (FAPEMIG), a través de la Red de Pesquisa em Doenças Infecciosas Humanas e Animais do Estado de Minas Gerais (RED-00313-16) y la Red Minera de Engenharia de Tecidos e Terapia Celular - REMETTEC (RED-00570-16), y el Consejo Nacional de Desarrollo Científico y Tecnológico (CNPq) de Brasil.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| Jeringa de 20 cc | DESCARPACK | SI100S4G | Jeringa estéril |
| Agujas de 26 G | BD | 497AQDKT7 | Agujas estériles Tubo |
| centrífuga cónico de 50 ml | SARSTEDT | 62547254 | Tubos cónicos de plástico aptos para la centrifugación Solución de |
| etanol al 70% | EMFAL | 490 | Solución de etanol para esterilización |
| Disección anatómica pinza | 3B SCIENTIFIC | W1670 | Mantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70% |
| C57Bl/6 ratón de tipo salvaje | Comprado en Bioté rio Central de la Universidad Federal de Minas Gerais | No aplicable | Los ratones deben estar libres de patógenos específicos, con una edad comprendida entre las 6 y las 10 semanas. Los ratones deben acomodarse al menos una semana antes para recuperarse del estrés del transporte |
| Matraz de cultivo celular T175 | GREINER | C7481-50EA | Matraz T-175, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa, sin RNasa |
| Matraz de cultivo celular T75 | GREINER | C7231-120EA | Matraz T-75, cuello inclinado, superficie 75 cm2, con tapón filtrante, sin DNasa, |
| Desinfectante o toallitas húmedas para bebés sin RNASA? | CLOROX | No aplicable | Ayuda a limpiar el hueso |
| Agua destilada | GIBCO | 15230 | Agua destilada estéril |
| DMEM/F12-10 | No aplicable | No aplicable Añadir | 10 mL de Suero Fetal Bovino (FBS) y 1 mL de Penicilina/Estreptomicina (P/S) al DMEM/F12 (q.s.p. 100 mL) |
| DMEM/F12-10 + sobrenadante de células L-929 | No aplicable | No aplicable | Añadir 20% de sobrenadante de cultivo de células L929 en DMEM/F-12-10 |
| Dulbecco′ s Eagle&prime modificado; s Medio - F12 (DMEM/F12) | GIBCO | 12500096 | DMEM: F-12 Medium contiene 2,5 mM de L-glutamina, 15 mM de HEPES, 0,5 mM de piruvato de sodio y 1200 mg/L de bicarbonato de sodio. Vuelva a suspender el polvo a 1 litro de agua destilada y agregue 3,7 g de bicarbonato de sodio. Ajuste el pH a 7,2 y filtre con 0,22 µM. Almacenamiento a 2 - 8 ° C congelador |
| Suero fetal bovino, certificado, inactivado por calor, Estados Unidos (FBS) | 10082147 | GIBCO | DMM-F12 |
| SIGMA-ALDRICH | Z359629 | Se utiliza para contar macrófagos al microscopio | |
| Células L-929 | SIGMA-ALDRICH | ATCC # CCL-1 | L-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizadas como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF) |
| Nikon TI eclipse | NIKON | No aplicable | Nikon TI Eclipse es un microscopio de fluorescencia y contraste de fase |
| Solución de disociación celular no enzimática | CELLSTRIPER (CORNING) | 25-056-CI | Solución de disociación celular no enzimática Elimine los macrófagos de la placa sin dañarlos |
| Placas de cultivo redondas no tratadas 100 × 20– mm | CORNING | CLS430591 | No utilice placas de Petri tratadas con cultivo de tejidos ni ninguna placa tratada con cultivo de tejidos |
| P3199 Penicilina G Sal de potasio | USBIOLOGICAL | 113-98-4 | Antibióticos |
| penicilina y estreptomicina (P/S) | Utilice 0,26 gramos de penicilina y 0,40 gramos de estreptomicina. Mezclar con 40 mL de PBS estéril. Dentro de una cabina de flujo laminar horizontal, utilice un 0,22 µ M filtrar y almacenar alícuotas de 1,0 mL en tubos de microfuga de 1,5 ml en el congelador (-20° C) | ||
| Solución salina tamponada con fosfato libre de calcio y magnesio (PBS) | MEDIATECH | 21-040-CM | |
| S7975 Sulfato de estreptomicina estéril, 650-850U/mg | USBIOLOGICAL | 3810-74-0 | Antibióticos Pipetas |
| serológicas de 10 ml o 25 ml | SARSTEDT | 861254001 | pipetas serológicas se utilizan volúmenes superiores a 1 mL |
| Bicarbonato de sodio | SIGMA-ALDRICH | 144-55-8 Corrección de | pH para el software DMEM-F12 |
| Nis Elements Viewer | NIKON | No aplicable | NIS-Elements Viewer es un programa independiente gratuito para ver archivos de imagen y conjuntos de datos |
| PBS estéril y solución al 2% de P/S | LABORCRIN | 590338 | Agregue 1 mL de P/S en 40 mL de PBS estéril |
| Tijeras de iris recto | KATENA | No aplicable | Mantener en vaso de precipitados estéril que contiene una solución de etanol al 70% |
| Supernadante de células L-929 | No aplicable | No aplicable | L-929 es un linaje de células de fibroblastos de ratón utilizado como fuente de factor estimulante de colonias de macrófagos (M-CSF). El sobrenadante L-929 se obtuvo del protocolo |
| Hoja de bisturí quirúrgico No.24 Acero inoxidable | SWANN-MORTON | 311 | Se utiliza para exponer la epífisis de los huesos Solución de azul de |
| tripano, 0,4% | GIBCO | 15250061 | La solución de azul de tripano, 0,4%, se utiliza de forma rutinaria como tinción celular para evaluar la viabilidad celular mediante la prueba de exclusión de colorante |
| Solución de tripsina/EDTA 0,05% | GIBCO | 25300-062 | Se utiliza para disociar células de la botella de cultivo |
| Agua para inyección (WFI) para cultivo celular | GIBCO | A12873 | Agua estéril y libre de endotoxinas |
Referencias
- Gomez Perdiguero, E., et al. Tissue-resident macrophages originate from yolk-sac-derived erythro-myeloid progenitors. Nature. 518 (7540), 547-551 (2015).
- van Furth, R., Cohn, Z. A. The origin and kinetics of mononuclear phagocytes. The Journal of....
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Reimpresiones y permisos
