Artículo de método

Resección de ganglios linfáticos vasculares poplíteos en la extremidad posterior de conejo para la inducción de linfedema secundario

DOI:

10.3791/64576

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30 de noviembre de 2022

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1Department of Microsurgery, Jesús Usón Minimally Invasive Surgery Centre, 2Department of Plastic Surgery, Hospital de la Santa Creu i Sant Pau

En este artículo

Resumen

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Aquí se describe la inducción quirúrgica de linfedema adquirido estable en la extremidad posterior del conejo. Este animal de experimentación se puede utilizar para investigar más a fondo el efecto del tratamiento del linfedema mediante técnicas microquirúrgicas.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El linfedema es una afección común que a menudo se asocia con el cáncer y su tratamiento, que provoca daños en el sistema linfático, y los tratamientos actuales son en su mayoría paliativos en lugar de curativos. Su alta incidencia entre los pacientes oncológicos indica la necesidad de estudiar tanto la función linfática normal como la disfunción patológica. Para reproducir el linfedema crónico, es necesario elegir un animal de experimentación adecuado. Los intentos de establecer modelos animales están limitados por la capacidad regenerativa del sistema linfático. Entre los posibles candidatos, la extremidad trasera del conejo es fácil de manejar y extrapolar al escenario clínico humano, lo que la hace ventajosa. Además, el tamaño de esta especie permite una mejor selección de los vasos linfáticos para la resección de los ganglios linfáticos vascularizados.

En este estudio, presentamos un procedimiento de resección de ganglios linfáticos vasculares en la extremidad posterior de conejo para inducir linfedema secundario. Los animales anestesiados se sometieron a medición circunferencial, infiltración en V azul patente y linfografía con verde indocianina (ICG-L) utilizando fluorescencia infrarroja cercana en tiempo real, una técnica que permite la identificación de ganglios poplíteos individuales y canales linfáticos. El acceso a las estructuras identificadas se logra mediante la extirpación del ganglio poplíteo y la ligadura de los linfáticos aferentes medial y lateral. Se debe tener especial cuidado para asegurar que cualquier vaso linfático que se una al sistema linfático femoral dentro del muslo sin entrar en el ganglio poplíteo pueda ser identificado y ligado.

La evaluación postoperatoria se realizó a los 3, 6 y 12 meses después de la inducción utilizando medidas circunferenciales de la extremidad posterior y el ICG-L. Como se demostró durante el seguimiento, los animales desarrollaron un reflujo dérmico que se mantuvo hasta el12º mes, lo que hace que este animal de experimentación sea útil para nuevas evaluaciones a largo plazo en el tratamiento del linfedema. En conclusión, el enfoque descrito aquí es factible y reproducible. Además, durante la ventana de tiempo presentada, puede ser representativo del linfedema humano, proporcionando así una herramienta de investigación útil.

Introducción

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El linfedema es una enfermedad crónica que merece especial atención, debido a su incidencia en todo el mundo, la falta de tratamiento curativo y estandarizado y el grave impacto en la calidad de vida de los pacientes 1,2.

En los países desarrollados, el linfedema es principalmente adquirido y secundario al cáncer de mama, debido a la alta prevalencia de esta neoplasia maligna; La incidencia acumulada de linfedema relacionado con el cáncer de mama 10 años después de la cirugía puede alcanzar hasta el 41,1%3. Sin embargo, enfermedades como el melanoma, los cánceres ginecológicos, los tumores genitourinarios y las neoplasias de cabeza y cuello también se asocian a una alta incidencia de esta enfermedad4. La resección de ganglios linfáticos regionales, como parte del tratamiento oncológico necesario para aumentar las tasas de supervivencia, conduce a la interrupción del drenaje linfático funcional. En algunos casos, esto da lugar a mecanismos compensatorios que previenen o retrasan la aparición del linfedema5. Sin embargo, cuando se administra quimioterapia y radioterapia, estos mecanismos no son capaces de compensar el cambio, lo que resulta en linfedema. Esto tiene un impacto negativo en la calidad de vida de los pacientes, afectando su bienestar funcional, social y psicológico 6,7.

La necesidad de una cura efectiva para el linfedema requiere la comprensión de la fisiopatología del sistema linfático, así como una comprensión profunda de los complejos mecanismos celulares y sus respuestas en los sistemas linfáticos normales y disfuncionales 8,9,10. Estos conocimientos pueden obtenerse inicialmente a partir de modelos animales experimentales que pueden reproducir enfermedades crónicas humanas11.

Se han hecho muchos intentos para replicar el linfedema en modelos animales experimentales; Sin embargo, la mayoría de ellos se han visto obstaculizados por algunas limitaciones, entre ellas la imposibilidad de reproducir la insuficiencia linfática crónica en un modelo animal estable, los costos del estudio y, lo que es más importante, la gran capacidad regenerativa del sistema linfático, que le permite restablecer la circulación12,13.

En este estudio se presenta el abordaje experimental para la inducción quirúrgica de linfedema adquirido estable utilizando la extremidad posterior de conejo. Con base en la revisión de la literatura, este animal puede considerarse óptimo para el desarrollo de linfedema debido a la anatomía consistente de su sistema linfático de la extremidad posterior, que incluye un solo ganglio poplíteo que drena la extremidad posterior y llega al sistema linfático femoral principal en la pierna14,15.

La anatomía específica de la extremidad posterior del conejo permite la reproducción de los procedimientos quirúrgicos realizados en humanos para inducir linfedema secundario. Por lo tanto, este procedimiento se puede utilizar para la formación microquirúrgica y la investigación preclínica para extrapolar los resultados a la medicina humana.

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Protocolo

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Todos los procedimientos fueron aprobados por el comité ético del Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón y las directrices de bienestar del gobierno regional, que se basan en la legislación europea.

1. Preparación prequirúrgica y quirúrgica

  1. Alberga nueve conejas blancas de Nueva Zelanda hembras de 4-4,5 kg de peso y 4 meses de edad en jaulas separadas mantenidas a una temperatura de 22-25 °C, con libre acceso a comida y agua. Asegúrese de que las jaulas contengan una bandeja de polisulfona con una superficie de 3m2 y una altura de 40 cm, así como una cama con virutas de madera.
    1. Identifique las jaulas con el código del proyecto y el número de identificación del animal.
    2. Aclimatar a los animales durante 1 semana antes de la cirugía para prevenir problemas inducidos por el estrés. Recolectar valores de laboratorio preoperatorios de muestras de sangre para asegurarse de que cada animal esté en buen estado de salud antes de la anestesia.
  2. Asegúrese de que todos los conejos sigan un ayuno de 12 horas antes de cada procedimiento quirúrgico.
    1. Después de la premedicación, preoxigenar a los conejos con una mascarilla (Hall mask) durante 5 min con oxígeno al 100% y un flujo de gas fresco de 3-5 L/min. Realizar la fase de co-inducción con midazolam (0,3 mg/kg) y propofol (10 mg/kg) por vía intravenosa.
  3. Intubar a los conejos con 3,0-3,5 tubos endotraqueales, con neumoponación, conectados a un circuito circular semicerrado conectado a un ventilador con un caudal de gases frescos de 1 L/min durante 5 min/min iniciales, y posteriormente fijado a 0,5 L/min.
    1. Realizar anestesia de mantenimiento por inhalación de sevoflurano a una concentración de 3%-3,5% establecida en el vaporizador.
  4. Administrar una infusión continua de la solución de lactato de Ringer (2-4 mL/kg/h) a través de la vena marginal de la oreja a los conejos anestesiados durante todo el procedimiento quirúrgico.
    1. Use un ungüento protector para los ojos para proteger la superficie ocular.
  5. Monitoreo de anestesia general: use un termómetro rectal para monitorear la temperatura a 38.7-39.7 °C, inspeccione el color de la membrana mucosa y controle la saturación de O2al >95% y la frecuencia cardíaca a 180-240 lpm usando un oxímetro de pulso de conejo.
  6. Colocar un soporte térmico para que el animal mantenga una temperatura constante durante todo el procedimiento.
  7. Administrar ketorolaco (1,5 mg/kg) más tramadol (3 mg/kg) por vía intravenosa para la analgesia intraoperatoria.
  8. Administrar antibióticos (7,5 mg/(kg∙día) de enrofloxacino por vía subcutánea [s.c.]) antes de la cirugía y 5 días después de la cirugía, así como analgesia postoperatoria (10 μg/(kg∙día) de buprenorfina s.c.) durante 5 días.
  9. Coloque a los conejos en posición supina y afeiten las extremidades traseras y las áreas inguinales del animal. Coloque al animal en decúbito dorsal/supino y corte el pelo de la extremidad posterior y las áreas inguinales.
  10. Realizar la antisepsia cutánea aplicando clorhexidina al 0,5% y etanol al 70% sobre la piel previamente afeitada. Una vez desinfectada la zona, cubre al conejo con un paño estéril, a excepción de la extremidad trasera izquierda.

2. Cirugía de resección de ganglios linfáticos vasculares poplíteos (Figura 1)

  1. Infiltrado de 0,2-0,3 mL de verde de indocianina (ICG) por vía intradérmica en el segundo y tercer espacio interdigital de la extremidad posterior izquierda. Masajea, flexiona suavemente y extiende la extremidad posterior durante unos minutos para facilitar la absorción del tinte en los vasos linfáticos. Utilice la extremidad contralateral como control.
  2. Utilice una cámara de fluorescencia de infrarrojo cercano en tiempo real para visualizar y marcar (mediante un marcador quirúrgico) los vasos linfáticos que se cruzan a nivel de la rodilla y el ganglio linfático poplíteo (PLN) de la piel (Figura 2).
  3. Inyectar azul permeable V (0,2 mL) en el área interdigital para la posterior identificación de los vasos linfáticos y los ganglios linfáticos.
  4. Una vez identificado el PLN utilizando una cámara de fluorescencia de infrarrojo cercano en tiempo real (Figura 3), se realiza una incisión de 2 cm en el centro de la fosa poplítea, longitudinal al eje largo de la extremidad posterior a través de la vena isquiática, que es visible a través de la piel.
    1. Para obtener imágenes panorámicas en tiempo real del sistema linfático con la cámara de fluorescencia de infrarrojo cercano en tiempo real, utilice el cabezal óptico equipado con un láser de clase 1 como fuente de luz de excitación y una cámara sensible al infrarrojo cercano, desde el tobillo hasta la rodilla de la extremidad trasera del animal.
    2. Visualizar los vasos linfáticos por encima de la fascia muscular mediante la resección de la grasa subcutánea5. Los vasos linfáticos aparecen azules debido a la tinción en V azul patentada en el paso 2.3.
    3. Use pinzas microquirúrgicas para estirar la incisión y exponer el PLN, incluidos los pedículos linfáticos vasculares y aferentes. Asegurar una visibilidad clara de todas las estructuras linfáticas y vasculares (Figura 4).
    4. Identificar el PLN, con un diámetro de 0,8 mm, debajo de la vena isquiática y entre los músculos bíceps femoral y los isquiotibiales mediales.
  5. Identificar los dos vasos linfáticos principales en la cara medial del PLN. Estos vasos se localizan paralelos a la vena safena distal y se dividen en una red de microvasos a medida que se acercan al PLN (Figura 5).
  6. Diseccionar el pedículo de los ganglios linfáticos evitando dañar los tejidos y vasos circundantes (Figura 6).
  7. Limate la arteria medial (una rama de la arteria poplítea) y la vena safena lateral distal y proximalmente utilizando suturas no absorbibles de nailon 10/0.
  8. Identificar y cauterizar los dos grupos de vasos linfáticos aferentes que se unen directamente al sistema linfático femoral dentro del muslo, pero que no entran en el PLN (Figura 7).
    NOTA: El primer grupo corresponde a los vasos linfáticos aferentes mediales que drenan la linfa de la parte superior de la pierna y la pantorrilla. El segundo grupo está compuesto por los vasos linfáticos de la musculatura de las extremidades inferiores. Estos vasos corren a lo largo del músculo gastrocnemio, junto con la vena safena.
  9. Confirme la interrupción completa del sistema linfático mediante la repetición de imágenes de fluorescencia de infrarrojo cercano en tiempo real.
  10. Elimine por completo el tejido graso circundante para evitar una posible linfangiogénesis.
  11. Suturar la incisión cutánea con suturas trenzadas reabsorbibles de ácido poliglicólico (PGA) 4-0 (con aguja triangular de 16 mm 3/8) mediante un patrón intradérmico continuo para evitar la automutilación postoperatoria.
  12. Aloje a los conejos individualmente en jaulas después de la cirugía; manténgalos bajo vigilancia y a una temperatura ambiente entre 16 y 22 °C.

3. Evaluación postoperatoria

  1. Realizar evaluaciones postoperatorias a los 3, 6 y 12 meses después de la inducción.
  2. Anestesiar a los conejos siguiendo los pasos utilizados anteriormente (pasos 1.2-1.7).
  3. Mida los perímetros de las extremidades traseras de los conejos anestesiados con una cinta métrica. Toma medidas cada 2 cm, siendo el primer punto el tobillo y el último la rodilla. Calcule el volumen total utilizando la fórmula del cono truncado.
  4. Utilice la linfografía con verde de indocianina (ICG-L) para evaluar la función linfática.
    1. Infiltrar 0,2-0,3 mL de ICG por vía intradérmica en el segundo y tercer espacio interdigital y masajear suavemente durante 1 min para facilitar la absorción de ICG en los vasos linfáticos.
  5. Recopile imágenes después de 15 minutos utilizando el sistema de fluorescencia de infrarrojo cercano para evaluar el reflujo dérmico.
  6. Una vez finalizados los seguimientos, se procede a la eutanasia del conejo siguiendo el mismo protocolo anestésico que el utilizado en la intervención. Una vez alcanzado el plano anestésico deseado, se administra cloruro de potasio intravenoso en la vena auricular a una tasa media de 2 meq/kg.

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Resultados

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Nueve conejos se sometieron a la inducción de linfedema en este estudio, sin embargo, tres conejos murieron durante el período postoperatorio inmediato y no pudieron ser evaluados. Los datos del estudio se obtuvieron a los 3, 6 y 12 meses después de la operación por tres investigadores independientes. Las mediciones circunferenciales de las extremidades posteriores y el ICG-L se realizaron bajo anestesia general para evaluar la función del sistema linfático y el reflujo dérmico.

Los datos obte...

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Discusión

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La resección del PLN en un animal de experimentación es un procedimiento relativamente nuevo que puede inducir linfedema secundario en las extremidades para su evaluación y estudio. Después de la resección de los ganglios linfáticos, hay un período de alteración de la funcionalidad del sistema linfático, acumulación de linfa y cambios histológicos de los vasos linfáticos que parecen dilatados. Cuando esta acumulación de linfa alcanza niveles adecuados, se puede observar el reflujo dérmic...

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Divulgaciones

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Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

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Este proyecto de investigación se ha llevado a cabo en el Centro de Cirugía Mínimamente Invasiva Jesús Usón (CCMIJU), que forma parte de la ICTS Nanbiosis. El estudio se realizó con la ayuda de las siguientes unidades de Nanbiosis: U21, quirófano experimental, y U22, alojamiento de animales. Este trabajo ha contado con el apoyo del Hospital de la Santa Creu i Sant Pau. Este trabajo ha sido parcialmente financiado por la Junta de Extremadura, el Fondo Europeo de Desarrollo Regional (Subvención Número GR21201). El financiador desempeñó un papel en el diseño del estudio, la recopilación de datos, el análisis, la decisión de publicar y la preparación del manuscrito. Un agradecimiento especial a María Pérez por la elaboración de las figuras y al Servicio de Microcirugía de JUMISC por su constante aliento.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Bleu Patente V sodique (Guerbet)Guerbet. Villepinte, Francia2,5 g/100 mL
Buprenorfina (Bupaq)Richter Pharma. Wels, Austria0820645AA3 mg/10 mL
FluobeamFluoptics. Grenoble, FranciaImágenes de fluorescencia
Software IBM SPSS IBMversión 21.0
Verde de indocianina (Verdye, Diagnostic Green GmbH)Diagnostic Green GmbH. Aschheim-Dornach, Alemania5 mg/mL
Ketorolaco  (Normon) Normon, S.A. Madrid, EspañaT01H30 mg/mL
Microsoft ExcelMicrosoftversión 16.66.1
Midazolam (Normon) Normon, S.A. Madrid, EspañaT35M15 mg/3 mL
Pentero 800, módulo de fluorescenciaCarl Zeiss Meditec AG. Goeschwitzer Strasse 51-52. Jena, Alemania302581-9245-000
Cloruro de potasio (Braun)B.Braun. Barcelona, España1926201020 mmol/10 mL
de propofol (Propomitor, Orion Pharma) Orion Pharma. Spoo, Finlandia20R039B200 mg/20 mL
RÜ Tubos endotraqueales SCH TeleflexMedical IDA Parque Empresarial y Tecnológico. Athione, Irlanda.12CE 12Tamaño Tubo 4.0 I.D. mm
Sevoflurano (SevoFlo, Zoetis)Zoetis Bélgica. Luvain-la-Neuve, Bélgica60935591000 mg/g (250 mL)
Tramadol (Normon)Normon, S.A. Madrid, EspañaT08U100 mg/2 mL
Microscopio

Referencias

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