Este artículo detalla los métodos de diagnóstico de cardiopatía congénita (CHD) murina mediante ecocardiografía fetal, necropsia y captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) mediante microscopía confocal episcópica (ECM) seguida de reconstrucción tridimensional (3D).
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Artículo de método
Una tubería para caracterizar defectos cardíacos estructurales en el ratón fetal
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En este artículo
Resumen
Resumen
Las enfermedades cardíacas congénitas (CHD, por sus siglas en inglés) son las principales causas de muerte infantil en los Estados Unidos. En la década de 1980 y antes, la mayoría de los pacientes con cardiopatía coronaria moderada o grave murieron antes de la edad adulta, con la mortalidad máxima durante la primera semana de vida. Los avances notables en las técnicas quirúrgicas, los enfoques de diagnóstico y el tratamiento médico han llevado a mejoras notables en los resultados. Para abordar las necesidades críticas de investigación para comprender los defectos cardíacos congénitos, los modelos murinos han proporcionado una plataforma de investigación ideal, ya que tienen una anatomía cardíaca muy similar a la de los humanos y tasas de gestación cortas. La combinación de ingeniería genética con herramientas de fenotipado de alto rendimiento ha permitido la replicación y el diagnóstico de defectos cardíacos estructurales para dilucidar aún más las vías moleculares detrás de las CHD. El uso de ecocardiografía fetal no invasiva para detectar los fenotipos cardíacos en modelos de ratón, junto con la alta fidelidad de la captura de imágenes de fluorescencia episcópica (EFIC) utilizando histopatología de microscopía confocal episcópica (ECM) con reconstrucciones tridimensionales (3D) permite una visión detallada de la anatomía de varios defectos cardíacos congénitos. Este protocolo describe un flujo de trabajo completo de estos métodos para obtener un diagnóstico preciso de defectos cardíacos congénitos murinos. La aplicación de este protocolo de fenotipado a organismos modelo permitirá un diagnóstico preciso de CHD, lo que proporcionará información sobre los mecanismos de CHD. La identificación de los mecanismos subyacentes de la cardiopatía coronaria brinda oportunidades para posibles terapias e intervenciones.
Introducción
Las cardiopatías congénitas (CHD) son el defecto congénito neonatal más común 1,2, afectando alrededor del 0,8%-1,7% de los neonatos y resultando en mortalidad y morbilidad neonatal significativa3. Una etiología genética está fuertemente indicada con CHD 4,5. Los modelos de ratón modificados genéticamente se han utilizado ampliamente para comprender la complejidad de las CHD y los mecanismos que las causan debido a que los ratones tienen corazones de cuatro cámaras y secuencias de ADN de desarrollo cardíaco comparables en fetos ....
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Protocolo
El uso de ratones para estos estudios es necesario ya que los ratones tienen corazones de cuatro cámaras que pueden imitar las CHD humanas. Los ratones recibieron atención veterinaria y se alojaron en el centro de cuidado de animales acreditado por la Asociación para la Evaluación y Acreditación del Cuidado de Animales de Laboratorio (AAALAC) de la institución. Se siguieron protocolos estrictos para minimizar la incomodidad, el estrés, el dolor y las lesiones de los ratones. Los ratones fueron sacrificados usando gasCO2 , que es aceptable para roedores pequeños de acuerdo con las Pautas de la Asociación Americana de Medicina Veterinaria sobre Eutanasia. Los....
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Resultados
Se observó que los embriones de ratón con defectos hemodinámicos significativos eran letales embrionarios. Se puede identificar una amplia variedad de CHD a través del ecocardiograma fetal no invasivo de alto rendimiento utilizando diferentes vistas (Figura 1).
Defectos septales: Los CHD más comunes son defectos septales como un defecto septal ventricular (VSD), un defecto septal auriculoventricular (AVSD) y un defecto septal auricular (ASD)
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Discusión
Se han utilizado ratones modificados genéticamente para comprender los mecanismos patológicos de los defectos cardíacos congénitos. Los protocolos que proporcionamos en este estudio intentan simplificar y estandarizar el proceso de evaluación de los defectos cardíacos fetales murinos. Sin embargo, hay pasos críticos a tener en cuenta durante el protocolo. Los embriones de ratón crecen significativamente durante cada día de gestación, y el momento correcto para cosechar un ratón se puede determinar realizando un ecocardio.......
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Divulgaciones
Los autores declaran no tener conflictos de intereses en este manuscrito.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 1x solución salina tamponada con fosfato (PBS), PH7.4 | Sigma Aldrich | P3813 | |
| 1.5 mL tubos Eppendorf (o vial preferido para almacenamiento de tejidos) | SealRite | 1615-5599 | |
| Solución de fosfato de formalina tamponada al 10% | Fisher Chemical | SF100-4 | |
| 100% Etanol | Decon Laboratories | 2701 | |
| 16% paraformaldehído (PFA) fijador | ThermoScientific | 28908 | 4% de concentración de trabajo recién preparado en 1x PBS a 4 & grados; C |
| 50 mL tubos Falcon | 352070 | ||
| 6– Placa de 12 pocillos o vial de 20 mL para el almacenamiento de embriones | Falcon | 353046 | |
| Microscopio de disección | Pasadores | MDG36 | |
| (grado A1 o A2) | F.S.T | 26002-15 | |
| Placa de disección | F.S.T | FB0875713 | Placa de Petri con base de parafina |
| Moldes de inclusión | Sakura | 4133 | |
| Tijeras extraestrechas (10,5 cm) | F.S.T | 14088-10 | 1– 2 pares |
| Aplicación de Fiji/Imagen J | NIH | Fiji.sc | |
| Punta fina (0,05 mm x 0,01 mm) Pinzas de disección (11 cm) | F.S.T | 11252-00 | 2 pares |
| Pinzas calientes | F.S.T | 11252-00 | Para la orientación de embriones |
| Marcador industrial para bloques de cera | Sharpie | 2003898 | Formateado para uso en laboratorio |
| Jenoptik ProgRes C14plus Cámara de microscopio | Jenoptik | 017953-650-26 | |
| Jenoptik ProgRess CapturePro software de adquisición | Jenoptik | jenoptik.com | |
| Vaso de precipitados de vidrio grande | Fisher Scientific | S111053 | Para fundir parafina |
| Microscopio binocular Leica M165 FC (óptica con zoom 16.5:1) | Leica | M165 FC | |
| OsiriX MD Version 12.0 | OsiriX | osirix-viewer.com | |
| Paraplast incrustación de cera de parafina | Millipore Sigma 1003230215 | ||
| Vaso de precipitados de vidrio pequeño | Fisher Scientific | S111045 | |
| Cuchara pequeña perforada (14,5 cm) | F.S.T | 10370-17 | |
| Tijeras Vannas rectas (4– 8 mm) | F.S.T | 15018-10 | Un par |
| Vevo2100 ultramicroscopio de ultrasonido de ultra alta frecuencia | FUJIFILM VisualSonics Inc. | Vevo2100 | |
| Xileno | Fisher Químico | UN1307 |
Referencias
- Wu, W., He, J., Shao, X. Incidence and mortality trend of congenital heart disease at the global, regional, and national level, 1990-2017. Medicine. 99 (23), Baltimore. e20593(2020).
- vander Linde, D., et al.
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Reimpresiones y permisos
