Artículo de método

Nuevas perspectivas metodológicas en el estudio de la biología de los mosquitos

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DOI:

10.3791/64602

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11 de agosto de 2022

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1W. Harry Feinstone Department of Molecular Microbiology and Immunology, Johns Hopkins Malaria Research Institute, Bloomberg School of Public Health, Johns Hopkins University, 2Department of Entomology & Nematology, Florida Medical Entomology Laboratory, Institute of Food and Agricultural Sciences, University of Florida

En este artículo

Resumen

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Técnicas de microinyección de embriones para una mutagénesis eficiente específica del sitio en Culex quinquefasciatus. Revista de experimentos visualizados. (159), E61375 (2020).

Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Ensayos de laboratorio de jaulas pequeñas de mosquitos anofelinos genéticamente modificados. Revista de experimentos visualizados. (171), e62588 (2021a).

Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Método de microinyección para embriones de Anopheles gambiae . Revista de experimentos visualizados. (173), e62591 (2021b).

Chen, T. Y. et al. Un protocolo de extracción de ADN de mosquito basado en perlas magnéticas para la secuenciación de próxima generación. Revista de experimentos visualizados. (170), E62354 (2021).

Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagación del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en mosquitos Aedes aegypti . Revista de experimentos visualizados. (162), e61574 (2020).

Jensen, B. M. et al. Bioensayo de aplicación tópica para cuantificar la toxicidad de los insecticidas para mosquitos y moscas de la fruta. Revista de experimentos visualizados. (179), E63391 (2022).

Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Alimentación y cuantificación de sangre de origen animal y comidas artificiales en mosquitos Aedes aegypti . Revista de experimentos visualizados. (164), e61835 (2020).

Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. P. V. Estudio de la actividad de neuropéptidos y otros reguladores del sistema excretor en el mosquito adulto. Revista de experimentos visualizados. (174), e61849 (2021).

Liu, X. et al. Un ensayo de alimentación oral bacteriana con mosquitos tratados con antibióticos. Revista de experimentos visualizados. (163), E61341 (2020).

Meuti, M. E., Harrell, R. Preparación e inyección de embriones de mosquitos Culex para generar mutaciones nulas utilizando CRISPR / Cas9. Revista de experimentos visualizados. (163), e61651 (2020).

Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Cultivo de gametocitos de Plasmodium falciparum e infección por mosquitos mediante alimentación artificial por membrana. Revista de experimentos visualizados. (161), e61426 (2020).

Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Ensayo mejorado de fecundidad y fertilidad para Aedes aegypti utilizando placas de cultivo de tejidos de 24 pocillos (placas EAgaL). Revista de experimentos visualizados. (171), e61232 (2021).

Wang, X. et al. Expresión heteróloga y análisis funcional de los receptores odorantes de Aedes aegypti a los olores humanos en ovocitos de Xenopus . Revista de experimentos visualizados. (172), e61813 (2021).

Editorial

Los patógenos transmitidos por mosquitos son responsables de millones de infecciones humanas cada año. Para combatir las enfermedades causadas por estos patógenos, como la malaria y el dengue 1,2,3, los investigadores están fortaleciendo la comprensión de la biología de los mosquitos y desarrollando nuevas herramientas de control de mosquitos 4,5,6. Esta colección facilita nuevas investigaciones en estas áreas a través de avances metodológicos que involucran la biología de los mosquitos, el control de mosquitos, la infección por patógenos y la transgénesis de mosquitos.

Jensen et al.7 describen un ensayo de actividad insecticida en mosquitos y moscas de la fruta que involucra la aplicación tópica directa de insecticidas y un procedimiento de determinación de dosis basado en la masa del insecto. El artículo cubre la preparación del espacio de trabajo y las soluciones químicas, la aplicación de insecticidas y el ensayo de supervivencia de insectos después de la exposición. La metodología de aplicación tópica facilita la exposición constante a dosis definidas de insecticidas, reduciendo la variabilidad interespecífica e interensayo, lo que será de gran interés para quienes participan en el control de plagas de insectos o en la investigación de la resistencia a los insecticidas en las poblaciones de mosquitos.

Chen et al.8 destacan un protocolo de extracción de ADN simple, manejable y de alto rendimiento de muestras de mosquitos para la secuenciación del genoma completo, utilizando perlas magnéticas de unión al ADN. El protocolo incluye la homogeneización de la muestra y el proceso completo de extracción. Este enfoque promueve un método de extracción de ADN de alto rendimiento, pero altamente reproducible, que es adecuado para laboratorios con recursos limitados. Interesará a quienes trabajan con aplicaciones de genómica de mosquitos, especialmente con preparaciones de ADN de mosquitos de campo.

Varios artículos de la colección cubren avances metodológicos vinculados al estudio de la biología de los mosquitos. Jové et al.9 describen la cuantificación de alto rendimiento basada en fluorescencia de los volúmenes de comida para mosquitos alimentados con dieta artificial. Abarca la preparación de la comida, la adición del colorante fluoresceína, la entrega de la comida en un sistema de alimentación de bajo costo, seguido de la cuantificación del volumen de harina en muestras de mosquitos alimentadas. La metodología descrita permite la evaluación efectiva de la alimentación de mosquitos, con relevancia para ensayos de alimentación que involucran dietas artificiales, sangre, azúcar o néctar. Será valioso para aquellos que estudian el comportamiento de alimentación de los insectos. Tsujimoto y Adelman10 describen una técnica novedosa para analizar la fecundidad y fertilidad de los mosquitos utilizando placas de cultivo celular de 24 pocillos llenas de agarosa. El protocolo detalla la preparación de placas, la alimentación de mosquitos, la oviposición, las imágenes de placas y la adquisición de datos. Reduce el tiempo, el espacio y la mano de obra en comparación con la metodología convencional, e interesará a los investigadores que evalúan la aptitud de los mosquitos o la base molecular de la reproducción de los mosquitos. Lajevardi et al.11 utilizan el ensayo de Ramsay para estudiar el transporte de iones y la secreción de fluidos en los tejidos excretores de mosquitos. El protocolo adapta el ensayo de Ramsay para su uso con una pequeña cantidad de tejido de insectos, y también analiza la preparación y calibración de electrodos, la preparación de tejidos de mosquitos para el ensayo y el registro de lecturas de túbulos de Malpighian y tejidos digestivos. Este protocolo interesará a quienes trabajan con sistemas digestivos o excretores y regulación neuropeptídica/endocrina de tejidos de insectos. Wang et al.12 describen la expresión heteróloga de receptores odorantes de Ae. aegypti en ovocitos de Xenopus para evaluar su respuesta a los olores humanos. Cubre la clonación de genes receptores de olores, la síntesis de ARNc, la disección y el aislamiento de ovocitos de Xenopus , la expresión heteróloga de los genes y luego el registro de un solo sensillum para medir la actividad del receptor. Este protocolo proporciona un sistema único para evaluar la base genética y funcional del olfato de los mosquitos, con aplicaciones potenciales vinculadas a la investigación del comportamiento de los mosquitos.

Cuatro artículos de la colección discuten los mosquitos modificados genéticamente y el proceso de transgénesis. Carballar-Lejarazú et al.13 describen procedimientos detallados para producir mosquitos transgénicos Anopheles gambiae mediante microinyección embrionaria, mientras que Bui et al.14 demuestran la microinyección de embriones de Culex quinquefasciatus para la edición del genoma basada en CRISPR/Cas9. El primero es un vector clave de los parásitos de la malaria humana, mientras que el segundo es un vector clave de los arbovirus, incluido el virus del Nilo Occidental, y está poco estudiado en el contexto de la transgénesis. Estos protocolos cubren la extracción y carga de agujas, la preparación y alineación de óvulos seguida de inyección, y la recuperación de embriones y la detección de fenotipos transgénicos. El protocolo de An. gambiae detalla los procedimientos de oviposición y recolección de óvulos, y representa visualmente las inyecciones exitosas. El Cx. El protocolo Quinquefasciatus describe parámetros específicos para tirar de la aguja y consejos para aumentar las tasas de mutagénesis. El artículo de Meuti y Harrell15 proporciona un enfoque en profundidad sobre la transgénesis en Culex pipiens, particularmente el proceso de inyección. El video muestra todo el proceso de inyección en gran profundidad; Describe el relleno y la fijación de la aguja, la colocación de los huevos y el inyector, así como los detalles sobre cómo inyectar con éxito. Proporciona instrucciones técnicas rigurosas y resolución de problemas sobre el proceso de inyección y ofrece consejos para maximizar la tasa de eclosión de huevos y la aptitud larvaria. Estos tres artículos interesarán a quienes buscan desarrollar nuevas estrategias de control de vectores, así como a quienes estudian la genética de Anopheles y Culex y las interacciones huésped-patógeno. Carballar-Lejarazú et al.16 describen el proceso para realizar ensayos en jaulas pequeñas para evaluar si los sistemas de impulsores genéticos pueden propagar genes específicos en poblaciones de mosquitos vírgenes en diferentes condiciones. El protocolo examina la mecánica de los ensayos de liberación inundativa sin impulso y los ensayos de impulso genético con generaciones de mosquitos superpuestas o no superpuestas. Proporciona detalles precisos sobre las proporciones de adición de transgénicos de tipo salvaje, los procesos de selección y la adaptación de los parámetros experimentales para incluir ensayos de aptitud o para modelar la propagación de alelos de impulsores genéticos. Este protocolo beneficiará a los investigadores en el campo del control de vectores que están desarrollando nuevos sistemas de impulsores genéticos y examinando la eficacia de los impulsores genéticos.

Los últimos tres artículos de la colección discuten el cultivo y la exposición a patógenos. Liu et al.17 demuestran el protocolo para la reintroducción de bacterias en mosquitos adultos después del tratamiento con antibióticos, con el fin de ayudar a comprender las funciones biológicas que desempeña la microbiota. Cubre el cultivo y aislamiento de bacterias, el tratamiento con antibióticos y los ensayos de alimentación bacteriana. El protocolo proporciona una buena síntesis de un procedimiento complejo y multifacético. Será útil para aquellos interesados en el estudio de la microbiota de mosquitos o en el desarrollo de mosquitos gnotobióticos adultos. Grigsby et al.18 destacan el protocolo para la integración del cultivo del parásito microsporidiano Edhazardia aedis en la cría estándar de Aedes aegypti . Detalla el aislamiento, la identificación y la enumeración de las esporas infecciosas, antes de la reinfección de los mosquitos y el mantenimiento de los huevos de mosquitos infectados. Brinda consejos para la resolución de problemas sobre la detección de esporas y la coordinación de la eclosión de mosquitos con la preparación de esporas. Este protocolo interesará a quienes buscan cultivar parásitos microsporidios con fines experimentales y a quienes examinan el impacto de la infección por parásitos en la inmunidad o la capacidad vectorial de los mosquitos. Tripathi et al.19 detallan el protocolo para el cultivo de gametocitos de Plasmodium falciparum , la realización de infecciones de mosquitos Anopheles a través del sistema de alimentación de membrana y vidrio y el recuento de ooquistes y esporozoítos. Es un protocolo esencial para el cultivo de P. falciparum , que puede ser difícil de lograr. El protocolo será muy valioso para quienes investigan la infección y transmisión de Plasmodium en mosquitos, para quienes buscan desarrollar estrategias antipalúdicas, incluidas herramientas de bloqueo de transmisión, y para quienes examinan la competencia vectorial de las poblaciones de An. gambiae , incluidas las líneas transgénicas y las estrategias de impulsores genéticos.

La colección de artículos trata muchos temas de investigación que son importantes para el futuro del control de mosquitos y patógenos transmitidos por mosquitos. Comprender la resistencia de los mosquitos a los pesticidas es fundamental, ya que refleja el éxito de los programas de control actuales; Además, la detección de resistencia puede ser una señal de que se requieren cambios en las estrategias de control. Las tecnologías de ingeniería genética, incluida la transgénesis de mosquitos, la edición del genoma y los impulsores genéticos, probablemente desempeñarán un papel clave en el control de mosquitos durante la próxima década y más allá debido a su alta manejabilidad y adaptabilidad. Un mejor conocimiento de la biología de los mosquitos, específicamente en los temas de genómica de poblaciones, interacciones huésped-patógeno, comportamiento de los mosquitos y la base molecular de los rasgos biológicos clave, proporcionará información valiosa que se puede utilizar para desarrollar nuevas herramientas de control. Por ejemplo, la identificación de genes involucrados en el olfato podría ayudar a los investigadores a desarrollar nuevos repelentes, mientras que la identificación de genes involucrados en las interacciones huésped-patógeno podría eventualmente conducir al desarrollo de mosquitos transgénicos portadores de efectores antipatógenos. Esta colección toca todos estos temas, y en manos de biólogos de vectores de todo el mundo, los métodos descritos aquí ayudarán a facilitar conocimientos nuevos y únicos sobre muchos aspectos de la biología de los mosquitos. Un desafío clave para el futuro será aprovechar el conocimiento generado en estas áreas temáticas para producir nuevas estrategias de control o para complementar u optimizar las estrategias actuales.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Esta publicación fue apoyada por el Instituto Nacional de Alimentos y Agricultura del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos (USDA), proyecto Hatch 1026692 a EPC.

Referencias

  1. Bhatt, S., et al. The global distribution and burden of dengue. Nature. 496 (7446), 504-507 (2013).
  2. Bhutta, Z. A., Sommerfeld, J., Lassi, Z. S., Salam, R. A., Das, J. K. Global burden, distribution, and interventions for infectious diseases of poverty. Infectious Diseases of Poverty. 3, 21(2014).
  3. Caminade, C., McIntyre, K. M., Jones, A. E. Impact of recent and future climate change on vector-borne diseases. Annals of the New York Academy of Sciences. 1436 (1), 157-173 (2019).
  4. Caragata, E. P., et al. Prospects and pitfalls: Next-Generation tools to control mosquito-transmitted disease. Annual Review of Microbiology. 74, 455-475 (2020).
  5. Jones, R. T., Ant, T. H., Cameron, M. M., Logan, J. G. Novel control strategies for mosquito-borne diseases. Philosophical Transactions of the Royal Society of London. Series B, Biological Sciences. 376 (1818), 20190802(2021).
  6. Wilson, A. L., et al. The importance of vector control for the control and elimination of vector-borne diseases. PLoS Neglected Tropical Diseases. 14 (1), 0007831(2020).
  7. Jensen, B. M., et al. Topical application bioassay to quantify insecticide toxicity for mosquitoes and fruit flies. Journal of Visualized Experiments. (179), e63391(2022).
  8. Chen, T. Y., et al. A magnetic-bead-based mosquito DNA extraction protocol for next-generation sequencing. Journal of Visualized Experiments. (170), e62354(2021).
  9. Jové, V., Venkataraman, K., Gabel, T. M., Duvall, L. B. Feeding and quantifying animal-derived blood and artificial meals in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (164), e61835(2020).
  10. Tsujimoto, H., Adelman, Z. N. Improved fecundity and fertility assay for Aedes aegypti using 24 well tissue culture plates (EAgaL plates). Journal of Visualized Experiments. (171), e61232(2021).
  11. Lajevardi, A., Sajadi, F., Donini, A., Paluzzi, J. V. Studying the activity of neuropeptides and other regulators of the excretory system in the adult mosquito. Journal of Visualized Experiments. (174), e61849(2021).
  12. Wang, X., et al. Heterologous expression and functional analysis of Aedes aegypti odorant receptors to human odors in Xenopus oocytes. Journal of Visualized Experiments. (172), e61813(2021).
  13. Carballar-Lejarazú, R., Tushar, T., Pham, T. B., James, A. A. Microinjection method for Anopheles gambiae embryos. Journal of Visualized Experiments. (173), e62591(2021).
  14. Bui, M., Li, M., Raban, R. R., Liu, N., Akbari, O. S. Embryo microinjection techniques for efficient site-specific mutagenesis in Culex quinquefasciatus. Journal of Visualized Experiments. (159), e61375(2020).
  15. Meuti, M. E., Harrell, R. Preparing and injecting embryos of Culex mosquitoes to generate null mutations using CRISPR/Cas9. Journal of Visualized Experiments. (163), e61651(2020).
  16. Carballar-Lejarazú, R., Pham, T. B., Bottino-Rojas, V., Adolfi, A., James, A. A. Small-Cage laboratory trials of genetically-engineered anopheline mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (171), e62588(2021).
  17. Liu, X., et al. A bacterial oral feeding assay with antibiotic-Tteated mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (163), e61341(2020).
  18. Grigsby, A., Kelly, B. J., Sanscrainte, N. D., Becnel, J. J., Short, S. M. Propagation of the microsporidian parasite Edhazardia aedis in Aedes aegypti mosquitoes. Journal of Visualized Experiments. (162), e61574(2020).
  19. Tripathi, A. K., Mlambo, G., Kanatani, S., Sinnis, P., Dimopoulos, G. Plasmodium falciparum gametocyte culture and mosquito infection through artificial membrane feeding. Journal of Visualized Experiments. (161), e61426(2020).

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