Artículo de método

Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos

DOI:

10.3791/64604

⸱

3 de febrero de 2023

 ,  ,  , 
1Department of Nutrition, Diabetes and Metabolism, Pontificia Universidad Católica de Chile

En este artículo

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.

Resumen

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El tejido adiposo marrón (BAT) solo está presente en los mamíferos y tiene una función termogénica. Los adipocitos marrones se caracterizan por un citoplasma multilocular con múltiples gotas de lípidos, un núcleo central, un alto contenido mitocondrial y la expresión de la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). El BAT se ha propuesto como una posible diana terapéutica para la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados debido a su capacidad para disipar la energía metabólica en forma de calor. Para investigar la función y regulación de las MTD, es indispensable el cultivo de adipocitos marrones. El presente protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos marrones de ratones recién nacidos. Además, se muestran los procedimientos para la obtención de imágenes de adipocitos diferenciados con inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de transmisión. En los adipocitos marrones diferenciados con las técnicas descritas en este trabajo, se conservan las principales características definitorias de la MTD clásica, incluidos los niveles altos de UCP1, el aumento de la masa mitocondrial y el contacto físico muy estrecho entre las gotas de lípidos y las mitocondrias, lo que convierte a este método en una herramienta valiosa para los estudios de BAT.

Introducción

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El tejido adiposo blanco y marrón difiere en su ubicación anatómica, origen celular, función, morfología y masa total. El tejido adiposo blanco (WAT) es el principal reservorio de energía fisiológica del cuerpo y almacena grandes cantidades de triacilglicerol (TAG) en células altamente especializadas que tienen una sola gota de lípidos gigante que ocupa la mayor parte desu volumen celular. La lipólisis de TAG libera ácidos grasos libres, que entran en la circulación sistémica para satisfacer las demandas energéticas durante el ayuno u otros estados de balance energético negativo. Además, el WAT segrega proteínas y productos lipídicos, llamados adipocinas e lipoquinas, respectivamente, que tienen funciones reguladoras metabólicas, inmunológicas y reproductivas, lo que convierte al WAT en el tejido endocrino más grandedel cuerpo.

El tejido adiposo marrón (BAT) es un órgano mucho más pequeño cuya principal función fisiológica es la termogénesis sin escalofríos para prevenir la hipotermia. En ratones y humanos recién nacidos, BAT es un órgano bien definido ubicado en el espacio interescapular. Los seres humanos adultos carecen de BAT interescapular (iBAT); sin embargo, desarrollan grupos de células pardas similares a los adipocitos integradas en depósitos que, de otro modo, comprenden principalmente WAT. Estos adipocitos "marrones en blanco" (brite) comparten características morfológicas y moleculares con los adipocitos iBAT clásicos, pero tienen un origen celular diferente 3,4.

A diferencia de los adipocitos blancos, los adipocitos marrones tienen múltiples gotas lipídicas pequeñas y abundantes mitocondrias5. La proteína de desacoplamiento 1 (UCP1, también conocida como termogenina) se expresa de manera única por los adipocitos marrones y britos y media la fuga de protones en la membrana mitocondrial interna (IMM), desacoplando así el transporte de electrones de la síntesis de ATP y generando calor. La termogénesis sin escalofríos en BAT es activada por la norepinefrina (NE), que se libera de los terminales simpáticos en el BAT en respuesta a la estimulación del frío6. La NE se une a los receptores beta-adrenérgicos (principalmente beta 3) en la superficie de los adipocitos marrones y desencadena una cascada de señalización intracelular mediada por AMPc. Esto da lugar a la lipólisis de TAG, la beta-oxidación de los ácidos grasos mitocondriales y la generación de calor tras la activación de UCP13. La estrecha relación funcional entre las gotas de lípidos y las mitocondrias en los adipocitos marrones tiene paralelismos estructurales, como la interacción entre estos orgánulos en áreas que son grandes y tienen un contacto físico muy estrecho 7,8.

El iBAT tiene abundantes vasos sanguíneos y terminales simpáticos9. Estas estructuras, junto con los preadipocitos, las células inmunitarias, los fibroblastos y las moléculas de la matriz extracelular, componen la fracción vascular del estroma adiposo (FSV)10. Se ha reportado que muchos protocolos generan adipocitos maduros a partir de preadipocitos 11,12,13,14,15 (Tabla Suplementaria 1); Sin embargo, muestran variaciones extremas en el procesamiento de los tejidos y en la composición de los medios de cultivo de diferenciación. El protocolo descrito en este documento permite la diferenciación eficiente y reproducible de adipocitos marrones que (1) expresan los factores de transcripción adipogénicos clave receptor gamma activado por proliferador de peroxisomas (PPARγ) y CCAAT/proteína de unión al potenciador alfa (C/EBPα), (2) expresan los marcadores de adipocitos maduros perilipina1 (PLIN1) y el determinante del clúster 36 (CD36), (3) acumulan abundantes gotas de lípidos, (4) tienen una alta masa mitocondrial y una alta abundancia de complejos OXPHOS, (5) tienen potencial termogénico, determinado por altos niveles de UCP1, y (6) tienen cambios morfológicos mitocondriales asociados con el fenotipo de los adipocitos marrones maduros. Esta metodología se utiliza para el estudio de los mecanismos moleculares que subyacen a la lipodistrofia generalizada 15,16,17.

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Protocolo

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Los procedimientos con animales fueron aprobados por la Comisión Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Para este estudio se utilizaron ratones recién nacidos P0,5 de ambos sexos, derivados de un fondo mixto de cepas C57BL/6J y 129J.

1. Extracción de tejidos

  1. Limpie y desinfecte el banco de trabajo con una solución de etanol al 70% y utilice material quirúrgico estéril.
  2. Eutanasiar a los cachorros recién nacidos P0.5 por decapitación con tijeras quirúrgicas siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente.
  3. Coloque al ratón en posición prona (boca abajo) y haga una incisión de 1 cm de largo en la piel a la altura media de la espalda del animal con unas tijeras afiladas. Retire la piel con cuidado.
    NOTA: Este paso es crítico porque si la piel no se elimina bien, podría desgarrarse y dañar el iBAT e impedir la preparación óptima de la SVF.
  4. Separe quirúrgicamente el iBAT de la carcasa con unas tijeras pequeñas.
    NOTA: El iBAT se visualiza como dos lóbulos grasos que se pueden extirpar de forma independiente.
  5. Coseche ambos lóbulos de iBAT utilizando alicates de punta curva para eliminar los lóbulos de forma independiente.
  6. Coloque los dos lóbulos en un tubo de plástico con 1,5 mL de PBS estéril a temperatura ambiente. Mantenga los tejidos en sus tubos individuales hasta que se complete la extracción de tejido para todas las crías necesarias.

2. Digestión de tejidos

  1. Alícuota 300 μL de tampón de digestión colagenasa tipo II (colagenasa tipo II al 0,2% en tampón [25 mM KHCO3, 1,2 mM MgSO4, 120 mM NaCl, 5 mM glucosa, 12 mM KH2PO4, 4,8 mM KCl, 1,2 mM CaCl2, 2,5% BSA y 1% penicilina/estreptomicina, a pH 7,4]) (Tabla 1) en tubos de 1,5 mL en una cabina de bioseguridad.
    NOTA: Prepare suficientes tubos para el número de tejidos individuales que se van a extraer. En el presente estudio se utilizaron siete tubos, correspondientes a una camada de siete crías.
  2. Muévase al banco y coloque los lóbulos de iBAT en el tampón de digestión de colagenasa tipo II para degradar la matriz extracelular.
  3. Incubar los tejidos iBAT durante 45 min a 37 °C con una agitación suave y continua a 800 rpm (Figura 1).

3. Procesamiento de tejidos

NOTA: Después de la digestión, realice todos los pasos siguientes en una campana de cultivo de tejidos de flujo laminar de clase II.

  1. Prepare y etiquete dos juegos de tubos de plástico de 1,5 ml para cada muestra individual.
  2. Interrumpa mecánicamente la suspensión tisular en el tampón de digestión de colagenasa tipo II pipeteando hacia arriba y hacia abajo con una micropipeta P1.000 y puntas filtradas. Utilice una nueva punta para cada muestra.
    NOTA: Este es un paso crítico. Asegúrese de desagregar mecánicamente el tejido con la punta y pipetear hacia arriba y hacia abajo hasta que se complete la homogeneización macroscópica.
  3. Pase los tejidos disgregados a través de filtros de células individuales de 100 μm (consulte la Tabla de materiales) a nuevos tubos de 1,5 mL.
  4. Añada 500 μL de tampón ACK (consulte la Tabla de materiales) a las muestras de tejido filtradas, invierta los tubos 4-5 veces e incube a temperatura ambiente durante 4 minutos.
    NOTA: No exceda el tiempo de incubación, ya que esto puede dañar las celdas de interés.
  5. Centrifugar las muestras de tejido a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
  6. Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2) (ver Tabla de Materiales).
  7. Pase las suspensiones a través de un filtro de células de 40 μm a nuevos tubos de 1,5 ml utilizando una micropipeta P1.000 y puntas filtradas.
  8. Centrifugar las muestras a 300 x g durante 5 min a temperatura ambiente.
    NOTA: El pellet corresponde a la SVF que contiene preadipocitos.
  9. Deseche el sobrenadante invirtiendo el tubo y vuelva a suspender el pellet en 1 mL de medio de cultivo mediante pipeteo.
  10. Prepare un tubo de 15 mL para cada muestra añadiendo 5 mL de medio de cultivo.
  11. Agregue cada pellet resuspendido a su tubo correspondiente de 15 mL que contenga 5 mL de medio de cultivo. Invierta el tubo 4-5 veces para mezclar el contenido de la celda.
  12. Siembre cada muestra en seis pocillos de una placa de cultivo de 24 pocillos agregando 1 mL de la suspensión a cada pocillo (Figura 1).

4. Cultivo de fracción vascular estromal (FSV)

  1. Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen el 100% de confluencia.
    NOTA: Durante este período, se eliminan las células adherentes no plásticas, lo que da como resultado un cultivo primario enriquecido con una SVF que contiene preadipocitos.
  2. Cuando las células sean 100% confluentes, retire el medio de cultivo y lave las células con 800 μL de PBS estéril.
  3. Añadir 150 μL de tripsina-EDTA al 0,25% (ver la Tabla de Materiales) a cada pocillo, y colocar la placa de cultivo durante 3 min en la incubadora para el desprendimiento de las células.
    NOTA: Verifique que las células estén separadas utilizando un microscopio óptico de contraste de fase.
  4. Inactivar la tripsina añadiendo 850 μL de medio de cultivo a cada pocillo.
  5. Recoja las células de los seis pocillos sembrados en el paso 3.12 y transfiéralas a un tubo de 15 ml.
  6. Haga que el volumen total sea de hasta 12 mL agregando 6 mL de medio de cultivo. Invierta el tubo 4-5 veces para mezclar el contenido.
  7. Siembre 1 mL de la muestra en cada pocillo de una placa de 12 pocillos. Cambie el medio de cultivo cada dos días hasta que las células alcancen la confluencia.
  8. Cuando las células sean 100% confluentes, separarlas con 150 μL de tripsina-EDTA al 0,25% siguiendo las mismas condiciones de incubación que en el paso 4.3, y sembrarlas de acuerdo con la superficie del pocillo requerida para el experimento.
  9. Realice imágenes de alta resolución después de fijar las celdas siguiendo el paso 8.
    NOTA: Se recomienda una densidad de 35.000 células/cm² para experimentos posteriores (extracción de proteínas y ARN total, 330.000 células [un pocillo de una placa de 6 pocillos]; inmunofluorescencia [IF], 10.500 células [un pocillo de una placa de 96 pocillos]).

5. Diferenciación adipogénica

  1. Incubar las células con medio de inducción (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2, suplementado con 500 nM de dexametasona, 125 nM de indometacina, 0,5 mM de 3-isobutil-1-metilxantina [IBMX], 5 μM de rosiglitazona, 1 nM de T3 y 20 nM de insulina) (Tabla 1) durante 72 h (día 0 a día 2) (Figura 2).
    NOTA: El medio de cultivo debe cambiarse cada dos días; Por lo tanto, el primer cambio de medio debe ocurrir el día 2 después de la inducción inicial.
  2. Cambio a medio de mantenimiento (DMEM-F12 con 10% de FBS, 1% antibiótico antimicótico, pH 7,2, suplementado con 5 μM de rosiglitazona, 1 nM T3 y 20 nM de insulina) (Tabla 1) al día 3, y mantener este medio de mantenimiento hasta el día 7 (Figura 2).
    NOTA: El medio de mantenimiento debe cambiarse el día 5 y el día 7. Pequeñas gotas de lípidos se pueden visualizar mediante microscopía de contraste de fase a partir del día 3 de diferenciación. Las gotas lipídicas grandes son evidentes en el día 7 de diferenciación. Los procedimientos de diferenciación de más de 7 días dan lugar a la pérdida de células por desprendimiento, probablemente debido a la alta flotabilidad de las células cargadas de lípidos.

6. Preparación de homogeneizado celular

  1. Retirar el medio de cultivo en el día 0 y el día 7 de diferenciación, y lavar las células 3 veces con PBS estéril.
  2. Después de la última limpieza, agregue 1,3 mL de PBS estéril a cada pocillo.
    NOTA: Mantenga las celdas en hielo hasta la limpieza de la última placa.
  3. Coseche las células mecánicamente de un pocillo de una placa de 6 pocillos (~330.000 células) con un raspador de células y coloque la suspensión celular en un tubo de 1,5 ml.
  4. Centrifugar las muestras a 2.800 x g durante 5 min a 4 °C.
  5. Retire el PBS con una micropipeta y mantenga los tubos en hielo.
  6. Resuspender el pellet celular en tampón RIPA con inhibidores de la proteasa y la fosfatasa (ver la Tabla de Materiales), e incubar durante 30 min en hielo.
    NOTA: Para lisar el pellet celular, 70-80 μL son suficientes.
  7. Centrifugar las muestras a 21.000 x g durante 15 min a 4 °C.
  8. Retire con cuidado el sobrenadante a un tubo de 1,5 ml y deseche el pellet.
    NOTA: El sobrenadante representa el homogeneizado celular.
  9. Determinar la concentración proteica del homogeneizado celular utilizando ácido bicinconínico (BCA) para la detección colorimétrica y cuantificación de la proteína total18,19.

7. Western blot

  1. Prepare 30 μg del homogeneizado celular (a partir del paso 6.8) y añada el tampón de carga de muestras SDS-PAGE disponible en el mercado (consulte la Tabla de materiales).
  2. Resolución en electroforesis en gel de poliacrilamida-SDS20 (PAGE-SDS) según el peso molecular de cada proteína.
    NOTA: Utilice un 10 % de PAGE-SDS para PPARγ, C/EBPα, PLIN1, CD36 y UCP1, un 12 % de PAGE-SDS para OXPHOS y un 15 % de PAGE-SDS para TOM20 (consulte la Tabla de materiales).
  3. Electrotransferir las proteínas a la membrana de PVDF (ver la Tabla de Materiales) a 350 mA durante 2 h.
    NOTA: El recipiente de hielo debe cambiarse después de 1 h. Durante todo el proceso, mantenga la cámara en hielo.
  4. Bloquear las membranas con BSA al 5% o leche descremada en solución salina tamponada Tris (TBS) 0,1% Tween 20 (TBS-T) durante 2 h siguiendo las recomendaciones de las fichas técnicas de los anticuerpos.
  5. Incubar con los anticuerpos primarios (los anticuerpos utilizados en este estudio se detallan en la Tabla de Materiales) durante la noche a 4 °C.
    NOTA: Todos los anticuerpos utilizados en este estudio se diluyeron a 1:1.000 en solución bloqueante.
  6. Lavar las membranas 3 veces con TBS-T al 0,1% e incubarlas con el anticuerpo secundario conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (ver la Tabla de Materiales) durante 2 h a temperatura ambiente.
  7. Lavar las membranas 3 veces con 0,1%. TBS-T. Realice un último lavado con 1x TBS. Guarde las membranas en 1x TBS hasta la visualización. Se recomienda almacenar durante un máximo de 1 h.
  8. Visualice las membranas por quimioluminiscencia20 o cualquier otro método preferido.

8. Imágenes de alta resolución

  1. Realice el ensayo de inmunofluorescencia siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. Siembre y diferencie los cultivos primarios de preadipocitos marrones de ratones recién nacidos P0.5 (siguiendo el paso 4.8) en placas de 96 pocillos con fondo óptico (consulte la Tabla de materiales).
    2. Fijar las células en el día 0 y el día 7 de diferenciación con PFA al 4% durante 20 min, y lavar 3 veces con PBS estéril.
    3. Permeabilizar las células con Triton X-100 al 0,1% durante 15 min, y bloquearlas con gelatina de pescado al 3% (ver la Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente.
    4. Lavar 3 veces con PBS estéril e incubar con el anticuerpo PLIN1 (1:400, ver la Tabla de Materiales) en BSA/PBS al 1% durante la noche a 4 °C en una cámara húmeda.
    5. Lavar 3 veces con PBS estéril e incubar con anticuerpo secundario conjugado con fluoróforos a 1:1.000 (1% BSA/PBS) (ver la Tabla de Materiales) durante 1 h a temperatura ambiente.
    6. Teñir los núcleos con 1 μg/mL de Hoechst 33342 y las gotas de lípidos con 1 μg/mL de BODIPY durante 30 min a temperatura ambiente.
      NOTA: Las imágenes de fluorescencia se adquirieron utilizando un sistema de imágenes celulares (consulte la Tabla de materiales). En total, se adquirieron 9 o 16 fotos por pocillo con dos o tres canales con un aumento de 20x.
  2. Realice la microscopía electrónica de transmisión siguiendo los pasos que se indican a continuación.
    1. Cultivar y diferenciar los preadipocitos marrones en placas de cultivo celular de 35 mm x 10 mm.
    2. En el día 0 y el día 7 de diferenciación, retire el medio y fije las células durante 1 h con glutaraldehído al 2,5% en tampón de cacodilato de sodio 0,1 M, pH 7,0 (ver la Tabla de Materiales).
    3. Lavar las células 3 veces con tampón de cacodilato de sodio 0,05 M durante 10 min, y tratarlas con tetróxido de osmio acuoso al 1% (ver la Tabla de Materiales) durante 15 min.
    4. Lave las células 3 veces con agua bidestilada durante 5 minutos y trátelas con acetato de uranilo acuoso al 1% (consulte la Tabla de materiales) durante 15 minutos.
    5. Deshidrate las células con un gradiente de etanol del 30%, 50%, 70%, 95% y 100% durante 5 minutos cada vez.
    6. Pre-embobe las celdas en epon/etanol 1:1 durante 30 min y luego en epon durante 1 h (ver la Tabla de Materiales).
      NOTA: La inclusión de las células se realiza directamente en la placa mediante la adición de epón fresco para cubrir toda la monocapa del cultivo celular. Deje que el epón polimerice en un horno a 60 °C durante 24 h.
    7. Sumerja la placa de cultivo celular en nitrógeno líquido durante 2 minutos y luego rómbrala con unos alicates para aflojar la inclusión de plástico.
    8. Pegar los segmentos de inclusión con celdas a un bloque de resina para obtener cortes finos (80 nm) paralelos a la superficie en un ultramicrótomo (ver la Tabla de Materiales).
    9. Teñir los cortes con acetato de uranilo acuoso al 1% durante 4 min y citrato de plomo durante 5 min, según Reynolds et al.21.
    10. Visualice las rejillas en un microscopio electrónico (consulte la Tabla de materiales).

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Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La adipogénesis está regulada por una red de factores de transcripción que son responsables tanto de la expresión de proteínas clave que inducen la formación y el funcionamiento de los adipocitos marrones22, incluyendo reguladores adipogénicos clásicos como PPARγ y C/EBPα 23,24,25, así como marcadores de adipocitos maduros 26,27. A través de la pr...

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Discusión

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El presente protocolo es un procedimiento de diferenciación en dos fases simple y replicable (Figura 2) para generar células con las características moleculares y morfológicas de los adipocitos marrones maduros. La extracción quirúrgica del iBAT es el primer paso crítico, ya que el desgarro del tejido limita gravemente la viabilidad del material de partida. El procesamiento de tejidos también es clave porque una suspensión celular homogénea que está libre de residuos aumenta en gran medida l...

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Divulgaciones

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

El financiamiento fue aportado por FONDECYT (1181214 y 1221146) y Anillos (ACT210039) para las becas de VC y doctorado ANID 21171743 a AMF y ANID 21150665 a FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga por su ayuda en el procesamiento de las muestras y el asesoramiento técnico para la microscopía electrónica de transmisión. Las ilustraciones fueron producidas usando BioRender.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
10x Tampón de Tris/GlicinaBioRad1610734
16% Paraformaldehído Solución acuosade la Microscopía Electrónica15710
35 mm Tratado TC Estilo Fácil Agarre Placa de cultivo celularFalcon353001
3-isobutil-1-metilxantina (IBMX)Calbiochem410957
40% Solución de acrilamida/Bis, 37,5:1BioRad1610148
placa de 6 pocillos SPL Ciencias de la Vida -
Thermo Scientific165305estéril de 96 pocillos ópticos con cultivo de células estériles
 Maestrogen02102-250
ACK tampón de lisado GibcoA10492-01
Persulfato de amonio BioRad1610700
Antibiótico-antimicóticoGibco 
Anti-ratón IgG, anticuerpo ligado a HRPSeñalización7076
Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP   Cell Signaling7074
Bloqueador de grado secante BioRad170-6404
BODIPY 493/503 InvitrogenD3922
BSASigmaA1470
C/EBPα anticuerpoSeñalización Celular2295
CaCl2Calbiochem 
anticuerpo CD36InvitrogenPA1-16813
Cell Strainer 100 µ m, nylonFalcon352360
Cell Strainer 40 µ m, nylonFalcon352340
Colagenasa tipo IIGibco17101-015
Citación 5 Lector multimodo de imágenes celularesBiotek
Dexametasona SigmaD4902
DMEM/F-12, polvoGibco12500062
EMBed-812 KIT DE INCRUSTACIÓN (Epon)Ciencias de Microscopía Electrónica14120
Etanol absolutoMerck 100983 
Suero fetal bovino Gibco16000-044
Gelatina de piel de pescado de agua fríaSigmaG7041
GlucosaGibco 15023-021
Glutaraldehído 25% Solución acuosaCiencias de Microscopía Electrónica16210
Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594Life TechnologiesA11012
Cóctel de inhibidor de fosfatasa Halt 100X Thermo Scientific78427
Cóctel de inhibidores de proteasa Halt 100X Thermo Scientific78429
Hoechst 33258InvitrogenH1398
Immun-Blot Membrana PVDF BioRad1620177
Indometacina Sigma I7378 
Insulina SigmaI3536
KClCalbiochem 
KH2PO4Calbiochem529568
KHCO3Sigma60339
Tampón reductor de muestras de marcador de carril Thermo Scientific39000
MgSO4SigmaM2643
MilliQ estéril de agua --
Mitoprofile Total OXPHOS Roedor WB anticuerpo CóctelAbcam MS604
NaClMerck 
OmniPur  10x Concentrado líquido PBSCalbiochem6505-OP
Tetróxido de osmio Ciencias de la Microscopía Electrónica19100
Anticuerpo de perilipina 1Señalización celular9349
PPARγ (81B8) anticuerpoCell Signaling2443
RIPA tampón lysis Thermo Scientific89901
RosiglitazoneMerck557366
Bicarbonato de sodio SigmaS5761
Cacpdilato de SodioCiencias de Microscopía Electrónica12300
Dodecil Sulfato de Sodio  BioRad1610301
T3SigmaT6397
Talos F200C G2Thermo Scientific
TEMED BioRad1610800
TOM20 anticuerpoSeñalización celular42406
Tris solución salina tamponada (TBS-10X)Señalización celular12498
Triton X-100 Sigma93443
Tripsina-EDTA (0,25%)Gibco25200056
Tween 20, Grado de Biología MolecularPromega H5152
UCP1 anticuerpoSeñalización celular14670
Ultracut RLeica 
Ciencias de la microscopía electrónica deacetato de uranilo22400
Westar Sun CyanagenXLS063
Supernova de Westar CyanagenXLS3
Ciencias Escalera de proteínas preteñida AccuRuler RGB Plus 15240062 celular 2082915295521064041000

Referencias

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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