Los preadipocitos se aíslan de la fracción vascular estromal del tejido adiposo marrón interescapular de ratones recién nacidos y se diferencian en células que acumulan gotas de lípidos, expresan marcadores moleculares y muestran la morfología mitocondrial de los adipocitos marrones maduros. Estas células se analizan posteriormente mediante inmunofluorescencia y microscopía electrónica de transmisión.
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Artículo de método
Diferenciación e imagen de adipocitos marrones de la fracción vascular estromal de tejido adiposo interescapular de ratones recién nacidos
En este artículo
Resumen
Resumen
El tejido adiposo marrón (BAT) solo está presente en los mamíferos y tiene una función termogénica. Los adipocitos marrones se caracterizan por un citoplasma multilocular con múltiples gotas de lípidos, un núcleo central, un alto contenido mitocondrial y la expresión de la proteína de desacoplamiento 1 (UCP1). El BAT se ha propuesto como una posible diana terapéutica para la obesidad y sus trastornos metabólicos asociados debido a su capacidad para disipar la energía metabólica en forma de calor. Para investigar la función y regulación de las MTD, es indispensable el cultivo de adipocitos marrones. El presente protocolo optimiza el procesamiento de tejidos y la diferenciación celular para el cultivo de adipocitos marrones de ratones recién nacidos. Además, se muestran los procedimientos para la obtención de imágenes de adipocitos diferenciados con inmunofluorescencia confocal y microscopía electrónica de transmisión. En los adipocitos marrones diferenciados con las técnicas descritas en este trabajo, se conservan las principales características definitorias de la MTD clásica, incluidos los niveles altos de UCP1, el aumento de la masa mitocondrial y el contacto físico muy estrecho entre las gotas de lípidos y las mitocondrias, lo que convierte a este método en una herramienta valiosa para los estudios de BAT.
Introducción
El tejido adiposo blanco y marrón difiere en su ubicación anatómica, origen celular, función, morfología y masa total. El tejido adiposo blanco (WAT) es el principal reservorio de energía fisiológica del cuerpo y almacena grandes cantidades de triacilglicerol (TAG) en células altamente especializadas que tienen una sola gota de lípidos gigante que ocupa la mayor parte desu volumen celular. La lipólisis de TAG libera ácidos grasos libres, que entran en la circulación sistémica para satisfacer las demandas energéticas durante el ayuno u otros estados de balance energético negativo. Además, el WAT segrega proteínas y productos lipídicos, llamados ....
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Protocolo
Los procedimientos con animales fueron aprobados por la Comisión Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Pontificia Universidad Católica de Chile. Para este estudio se utilizaron ratones recién nacidos P0,5 de ambos sexos, derivados de un fondo mixto de cepas C57BL/6J y 129J.
1. Extracción de tejidos
- Limpie y desinfecte el banco de trabajo con una solución de etanol al 70% y utilice material quirúrgico estéril.
- Eutanasiar a los cachorros recién nacidos P0.5 por decapitación con tijeras quirúrgicas siguiendo el protocolo aprobado institucionalmente.
- Coloque al ratón en posición prona (b....
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Resultados
La adipogénesis está regulada por una red de factores de transcripción que son responsables tanto de la expresión de proteínas clave que inducen la formación y el funcionamiento de los adipocitos marrones22, incluyendo reguladores adipogénicos clásicos como PPARγ y C/EBPα 23,24,25, así como marcadores de adipocitos maduros 26,27. A través de la pr.......
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Discusión
El presente protocolo es un procedimiento de diferenciación en dos fases simple y replicable (Figura 2) para generar células con las características moleculares y morfológicas de los adipocitos marrones maduros. La extracción quirúrgica del iBAT es el primer paso crítico, ya que el desgarro del tejido limita gravemente la viabilidad del material de partida. El procesamiento de tejidos también es clave porque una suspensión celular homogénea que está libre de residuos aumenta en gran medida l.......
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Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
El financiamiento fue aportado por FONDECYT (1181214 y 1221146) y Anillos (ACT210039) para las becas de VC y doctorado ANID 21171743 a AMF y ANID 21150665 a FS. Agradecemos a Alejandro Munizaga por su ayuda en el procesamiento de las muestras y el asesoramiento técnico para la microscopía electrónica de transmisión. Las ilustraciones fueron producidas usando BioRender.
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Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| 10x Tampón de Tris/Glicina | BioRad | 1610734 | |
| 16% Paraformaldehído Solución acuosa | de la Microscopía Electrónica | 15710 | |
| 35 mm Tratado TC Estilo Fácil Agarre Placa de cultivo celular | Falcon | 353001 | |
| 3-isobutil-1-metilxantina (IBMX) | Calbiochem | 410957 | |
| 40% Solución de acrilamida/Bis, 37,5:1 | BioRad | 1610148 | |
| placa de 6 pocillos | SPL Ciencias de la Vida | - | |
| Thermo Scientific | 165305 | estéril de 96 pocillos ópticos con cultivo de células estériles | |
| Maestrogen | 02102-250 | ||
| ACK tampón de lisado | Gibco | A10492-01 | |
| Persulfato de amonio | BioRad | 1610700 | |
| Antibiótico-antimicótico | Gibco | ||
| Anti-ratón IgG, anticuerpo ligado a HRP | Señalización | 7076 | |
| Anti-conejo IgG, anticuerpo ligado a HRP | Cell Signaling | 7074 | |
| Bloqueador de grado secante | BioRad | 170-6404 | |
| BODIPY 493/503 | Invitrogen | D3922 | |
| BSA | Sigma | A1470 | |
| C/EBPα anticuerpo | Señalización Celular | 2295 | |
| CaCl2 | Calbiochem | ||
| anticuerpo CD36 | Invitrogen | PA1-16813 | |
| Cell Strainer 100 µ m, nylon | Falcon | 352360 | |
| Cell Strainer 40 µ m, nylon | Falcon | 352340 | |
| Colagenasa tipo II | Gibco | 17101-015 | |
| Citación 5 Lector multimodo de imágenes celulares | Biotek | ||
| Dexametasona | Sigma | D4902 | |
| DMEM/F-12, polvo | Gibco | 12500062 | |
| EMBed-812 KIT DE INCRUSTACIÓN (Epon) | Ciencias de Microscopía Electrónica | 14120 | |
| Etanol absoluto | Merck | 100983 | |
| Suero fetal bovino | Gibco | 16000-044 | |
| Gelatina de piel de pescado de agua fría | Sigma | G7041 | |
| Glucosa | Gibco | 15023-021 | |
| Glutaraldehído 25% Solución acuosa | Ciencias de Microscopía Electrónica | 16210 | |
| Anticuerpo secundario de adsorción cruzada IgG (H + L) anti-conejo de cabra, Alexa Fluor 594 | Life Technologies | A11012 | |
| Cóctel de inhibidor de fosfatasa Halt 100X | Thermo Scientific | 78427 | |
| Cóctel de inhibidores de proteasa Halt 100X | Thermo Scientific | 78429 | |
| Hoechst 33258 | Invitrogen | H1398 | |
| Immun-Blot Membrana PVDF | BioRad | 1620177 | |
| Indometacina | Sigma | I7378 | |
| Insulina | Sigma | I3536 | |
| KCl | Calbiochem | ||
| KH2PO4 | Calbiochem | 529568 | |
| KHCO3 | Sigma | 60339 | |
| Tampón reductor de muestras de marcador de carril | Thermo Scientific | 39000 | |
| MgSO4 | Sigma | M2643 | |
| MilliQ estéril de agua | - | - | |
| Mitoprofile Total OXPHOS Roedor WB anticuerpo Cóctel | Abcam | MS604 | |
| NaCl | Merck | ||
| OmniPur 10x Concentrado líquido PBS | Calbiochem | 6505-OP | |
| Tetróxido de osmio | Ciencias de la Microscopía Electrónica | 19100 | |
| Anticuerpo de perilipina 1 | Señalización celular | 9349 | |
| PPARγ (81B8) anticuerpo | Cell Signaling | 2443 | |
| RIPA tampón lysis | Thermo Scientific | 89901 | |
| Rosiglitazone | Merck | 557366 | |
| Bicarbonato de sodio | Sigma | S5761 | |
| Cacpdilato de Sodio | Ciencias de Microscopía Electrónica | 12300 | |
| Dodecil Sulfato de Sodio | BioRad | 1610301 | |
| T3 | Sigma | T6397 | |
| Talos F200C G2 | Thermo Scientific | ||
| TEMED | BioRad | 1610800 | |
| TOM20 anticuerpo | Señalización celular | 42406 | |
| Tris solución salina tamponada (TBS-10X) | Señalización celular | 12498 | |
| Triton X-100 | Sigma | 93443 | |
| Tripsina-EDTA (0,25%) | Gibco | 25200056 | |
| Tween 20, Grado de Biología Molecular | Promega | H5152 | |
| UCP1 anticuerpo | Señalización celular | 14670 | |
| Ultracut R | Leica | ||
| Ciencias de la microscopía electrónica de | acetato de uranilo | 22400 | |
| Westar Sun | Cyanagen | XLS063 | |
| Supernova de Westar | Cyanagen | XLS3 |
Referencias
- Luo, L., Liu, M. Adipose tissue in control of metabolism. Journal of Endocrinology. 231 (3), 77-99 (2016).
- Gaspar, R. C., Pauli, J. R., Shulman, G. I., Muñoz, V. R. An update on brown adipose tissue biology: A discussion of recent findings.
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Reimpresiones y permisos
