Summary
Het huidige protocol laat zien hoe CD3−/CD45+CD56+ cellen met milde cytotoxiciteit kunnen worden onderscheiden van humane expanded potential stamcellen (hEPSC's) onder zowel 3D- als 2D-kweekomstandigheden. Dit maakt routinematige fenotypische validatie mogelijk zonder de vernietiging van de complexe micro-omgeving.
Abstract
De differentiatie van natural killer (NK) cellen uit menselijke pluripotente stamcellen maakt onderzoek naar en de productie van klinische cellulaire producten voor immunotherapie mogelijk. Hier wordt een tweefasenprotocol beschreven dat gebruik maakt van een serumvrij commercieel medium en een cocktail van cytokines (interleukine [IL]-3, IL-7, IL-15, stamcelfactor [SCF] en FMS-achtige tyrosinekinase 3 ligand [Ftl3L]) om menselijke geëxpandeerde potentiële stamcellen (hEPSC's) te differentiëren in cellen die NK-celeigenschappen in vitro bezitten met zowel 3-dimensionale (3D) als 2-dimensionale (2D) kweektechnologie. Volgens dit protocol worden cd3-cd56+ of cd45+cd56+ NK-cellen consistent gegenereerd. Wanneer ze gedurende 3 uur worden gecocultiveerd met tumordoelen, vertonen de gedifferentieerde producten een milde cytotoxiciteit in vergelijking met een IL-2-onafhankelijke permanente cellijn, NK92mi-cellen. Het protocol behoudt de complexiteit van de differentiatie micro-omgeving door het genereren van 3D-structuren, waardoor de studie van de ruimtelijke relaties tussen immuuncellen en hun niches wordt vergemakkelijkt. Ondertussen maakt het 2D-cultuursysteem de routinematige fenotypische validatie van celdifferentiatie mogelijk zonder de delicate differentiatieniche te schaden.
Introduction
Vergeleken met conventionele pluripotente stamcellen zoals menselijke embryonale stamcellen (hESCs) en door de mens geïnduceerde pluripotente stamcellen (hiPSC's), liggen humane geëxpandeerde potentiële stamcellen (hEPSCs) dichter bij de staat van totipotentie, omdat ze kunnen differentiëren in zowel extra-embryonale als embryonale afstammingslijnen1. HEPSC's kunnen bijvoorbeeld worden gedifferentieerd in trofoblasten1 en dooierzakachtige cellen2. Om de unieke potentie van hEPSC's te bereiken, wordt een individueel blastomere gekweekt in een medium dat verschillende kleine moleculen bevat die de afstammingssignalering remmen1, die EPSC-medium (EPSCM) wordt genoemd. Het kweken van hESCs en hiPSC's in de EPSCM breidt hun voorheen beperkte potentie uit om ze te differentiëren in trofoblastcellen1.
Pluripotente stamcellen zijn een waardevol onderzoeksinstrument om te experimenteren met nieuwe genetische modificaties. Vanwege de zelfvernieuwings- en differentiatiecapaciteiten van pluripotente stamcellen, kan één getransformeerde kloon van een pluripotente stamcel gedifferentieerde cellulaire producten produceren die dezelfde genetische modificatie op dezelfde locus bezitten. Zhu en Kaufman stelden de standaard vast voor NK-celdifferentiatie van conventionele pluripotente stamcellen (hESCs en hiPSC's)3. Ten eerste induceerden ze hematopoëtische stamcellen (HSC's) uit een embryoïde lichaam afgeleid van pluripotente stamcellen. De toevoeging van stamcelfactor (SCF), FMS-achtige tyrosinekinase 3 ligand (Ftl3L), interleukine (IL)-7, IL-15 en een vroeg supplement van IL-3 bevooroordeeld de HSC's om zich te ontwikkelen tot natural killer (NK) cellen. Vervolgens breidden ze de NK-cellen uit met kunstmatige antigeen-presenterende cellen (aAPCs), die membraangebonden IL-21 presenteren, met de continue suppletie van IL-2. Onderzoekers hebben deze benadering toegepast op immunotherapie om iPSC-afgeleide natural killer-cellen te genereren die zijn begiftigd met de chimere antigeenreceptor (CAR-iNK)4.
Menselijke NK-cellen worden gedefinieerd als CD3-CD56+ leukocyten in het perifere bloed. Ze zijn effectoren tegen virus-geïnfecteerde cellen en tumorcellen5. Sommige remmende receptoren op NK-cellen herkennen moleculen die alomtegenwoordig tot expressie komen in normale cellen. Als voorbeeld, het NKG2A/CD94 heterodimeer uitgedrukt op NK-cellen herkent MHC klasse I moleculen5. Ondertussen herkennen de activerende receptoren op NK-cellen stress-geïnduceerde liganden, zoals hoe NKG2D transformatie-geïnduceerde MHC klasse I polypeptide-gerelateerde sequentie A (MICA / MICB) herkent 6. Sommige getransformeerde cellen downreguleren hun "zelfliganden" om te ontsnappen aan immuunsurveillance en upreguleren afwijkende liganden, wat de NK-cellen triggert om hun lytische machinerie uit te voeren. De intrinsieke antitumorcapaciteiten van NK-cellen hebben de aandacht gevestigd op dit immuunceltype.
Het vermogen om tegelijkertijd aanleiding te geven tot zowel embryonale als extra-embryonale afstammingslijnen kan hEPSC's een meer getrouwe recapitulatie van de embryonale ontwikkelingsniche maken dan conventionele pluripotente stamcellen. Uit ervaring is het gemakkelijker om de potentie van hEPSC's te behouden dan hiPSC's. In deze studie werd een protocol ontwikkeld (figuur 1) om hEPSC's te vertekenen om zich te ontwikkelen tot hematopoëtische afstammingslijnen en later in vitro voorlopercellen te differentiëren in natural killer (NK) cellen. In het protocol worden commerciële media gebruikt om seruminconsistenties te voorkomen, gevolgd door de stapsgewijze toevoeging van cytokines aan biasdifferentiatie in lymfoïde afstamming. Dit protocol heeft twee systemen om de complexe 3D-micro-omgeving te behouden en tegelijkertijd CD3-CD56 +/CD45+ CD56+ cellen af te leiden die fenotypisch en functioneel lijken op menselijke NK-cellen.
Dit protocol kan nuttig zijn bij het bestuderen van de interactie van immuuncellen met hun differentiatieniches en kan het potentieel hebben om cellulaire producten te zuiveren voor immunotherapeutisch gebruik.
Protocol
De huidige studie betrof in vitro experimenten; daarom is ethische goedkeuring niet van toepassing. De gevestigde cellijnen die in deze studie werden gebruikt, werden verkregen uit commerciële bronnen (zie de tabel met materialen).
1. Generatie van 3D organoïde structuren uit hEPSC's
- Onderhoud hEPSC's door ze te kweken met 1 ml EPSC-medium (12-wellsplaat) op SNL-feedercellen1.
OPMERKING: Koepelvormige kolonies worden waargenomen (figuur 2A) als hun uitgebreide potentie blijft bestaan. - Voer pre-differentiatie van de hEPSC's uit.
- Verwijder het hEPSC-medium en voeg 1 ml DFK-medium toe (DMEM/F12 + 10% serumvervangend medium, zie de materiaaltabel). Incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Voer een gemiddelde verandering uit op de tweede dag als u de incubatie gedurende 3 dagen voortzet.
OPMERKING: Onder de microscoop worden de koepelvormige kolonies afgeplat (figuur 2B).
- Verwijder het hEPSC-medium en voeg 1 ml DFK-medium toe (DMEM/F12 + 10% serumvervangend medium, zie de materiaaltabel). Incubeer gedurende 2-3 dagen bij 37 °C en 5% CO2. Voer een gemiddelde verandering uit op de tweede dag als u de incubatie gedurende 3 dagen voortzet.
- Controleer de vorming van embryoïde lichamen met behulp van dehanging drop-techniek 7,8.
- Verwijder het DFK-medium en was eenmaal met 1 ml PBS. Voeg 500 μL 0,05% trypsine toe en incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3-7 minuten op basis van de morfologie.
OPMERKING: De hEPSC's moeten kunnen worden losgemaakt van de feedercellen wanneer de plaat enigszins wordt verstoord. - Verwijder de trypsine en voeg 2 ml DFK-medium toe om de cellen te oogsten. Draai de cellen op 300 x g gedurende 3 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant met een pipet. Voeg 1 ml DFK-medium en 1 μL Y27632 (zie de materiaaltabel) toe om de cellen te reuspenderen door te vegen.
- Tel het aantal cellen in de celsuspensie met een hemocytometer9. Verdun de celsuspensie met DFK medium en Y27632 (1.000x) zodat er 4.000 cellen/25 μL DFK medium zijn.
- Vul de dop van een petrischaaltje van 10 cm met ongeveer 30-40 druppels 25 μL celsuspensie per dop. Giet wat PBS in de onderste schaal om de verdamping van de druppels te voorkomen. Draai de dop voorzichtig om en bedek de schaal. Incubeer het gerecht op 37 °C en 5% CO2 gedurende 3 dagen.
- Verwijder het DFK-medium en was eenmaal met 1 ml PBS. Voeg 500 μL 0,05% trypsine toe en incubeer de plaat bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 3-7 minuten op basis van de morfologie.
2. Mesoderm en hemato-endotheelpatronen van het embryoïde lichaam (EB)
- Verzamel EV's in de druppel.
- Verzamel alle EB's van de druppel in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 1 ml en wat PBS. Pomp een beetje PBS in de druppel en zuig vervolgens het medium, inclusief de EB's, met de pipet uit.
OPMERKING: Druppels die meer geel zijn, duiden op meer succesvolle vorming en groei dan roze druppels. - Draai de verzamelde EB's op 100 x g gedurende 1 minuut bij kamertemperatuur en gebruik een pipet om het supernatant te verwijderen. Voeg 1 ml medium A toe (uit een in de handel verkrijgbare celdifferentiatiekit, zie de tabel met materialen) om de verzamelde EB's over te brengen naar een niet-hechtende 24-well plaat. Label deze dag als Dag 0 (Figuur 1).
OPMERKING: Gewoonlijk worden alle EB's verzameld uit één schaal van 10 cm gegroepeerd en overgebracht naar één put van een bord met 24 putten.
- Verzamel alle EB's van de druppel in een buis van 15 ml met behulp van een pipet van 1 ml en wat PBS. Pomp een beetje PBS in de druppel en zuig vervolgens het medium, inclusief de EB's, met de pipet uit.
- Voer mesoderm-patronen van de EB's uit.
- Incubeer de plaat gedurende 3 dagen bij 37 °C met 5% CO2. Verwijder op dag 2 500 μL medium A (uit de kit, stap 2.1.2) terwijl u het pipetteren van de EB's vermijdt. Voeg vervolgens 500 μL vers medium A toe.
- Voer hemato-endotheelspecificatie van het embryoïde lichaam uit.
- Verwijder 700 μL medium A uit de put en voeg 700 μL medium B toe (uit de kit, stap 2.1.2). Cultuur voor 7 dagen. Voer een halve verandering van medium B uit op dag 5, dag 7 en dag 9.
3. NK-celdifferentiatie
- Breng de patroon-EB's over op een lucht-vloeistofinterface.
- Kantel de plaat iets zodat de EB's aan de onderkant aggregeren. Gebruik een pipet van 1 ml om zoveel mogelijk medium B te verwijderen en vermijd de EB's.
- Pak de EB's op met een pipet door het resterende medium aan te zuigen. Breng ze over in een transwell in een plaat met 24 putten (zie de materiaaltabel).
OPMERKING: Beperk de aantallen tot twee tot drie EV's per transwell voor een optimale dichtheid.
- Voer lymfoïde voorloperuitbreiding uit.
- Voeg 500 μL NK-1 medium (in de handel verkrijgbaar lymfoïde expansiemedium + 14 IE/ml IL-3, 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCCF en 12 IE/ml ftl3L, zie de materiaaltabel) toe aan het onderste compartiment van de transwell. Cultuur gedurende 14 dagen en voer om de dag een gemiddelde verandering uit.
- Oogst en breng de cellen op dag 7-10 over naar een gecoate plaat.
- Om de plaat te coaten, verdunt u het coatingmateriaal (in de handel verkrijgbaar lymfoïde differentiatiecoatingmateriaal, 100x, zie de tabel met materialen) in PBS. Voeg 1 ml verdunde coatingoplossing toe aan elke put van een 12-wellsplaat en incubeer de plaat een nacht bij 4 °C. Bedek de opening van de plaat met wikkelfolie.
- Voeg 200 μL PBS toe aan de transwell en pipetteer langzaam op en neer ongeveer vijf tot zes keer om de cellen te oogsten die vrijkomen uit de organoïden. Vermijd pipetteer de organoïden.
OPMERKING: Er komen continu ronde cellen vrij uit de organoïden (figuur 2D). - Breng de geoogste celsuspensie over in een buis van 2 ml en draai de cellen op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het supernatant met een pipet en voeg 1 ml NK-1 medium (stap 3.2.1) toe om de cellen te resuspenderen door te pipetteren.
- Verwijder alle coatingoplossing uit de put en was elke put van een 12-wells plaat met 1 ml PBS tweemaal.
- Splits de geoogste cellen in een verhouding van 1:2. Breng de celsuspensie over op een gecoate 12-wellsplaat (stap 3.3.1). Voeg 1 ml NK-1 medium toe, zodat elke put 1,5 ml medium heeft.
- Om een gemiddelde verandering uit te voeren, laat je de cellen 1-2 minuten zitten om de cellen naar de bodem te laten zinken. Zuig voorzichtig 750 μL medium uit. Draai het verzamelde supernatant op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Gooi het grootste deel van het supernatant weg en resuspenseer in 750 μL NK-1-medium met pipetteren vijf tot zes keer. Voeg de cellen die in het verse medium zijn geresuspendeerd toe aan het oorspronkelijke putje.
OPMERKING: Dit parallelle systeem wordt in figuur 1 het 2D-systeem genoemd. Volg het medium veranderingsschema van de put van de organoïden waaruit de cellen afkomstig zijn.
- Voer NK-celrijping uit volgens de onderstaande stappen.
- Verwijder het oude medium van het 3D-systeem en voeg 500 μL NK-2 (in de handel verkrijgbaar NK-celdifferentiatiemedium + 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF en 12 IE/ml ftl3L, zie de materiaaltabel) toe aan het onderste compartiment van de transwell. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 14 dagen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat het medium de bodem van de transwell raakt. - Voer een volledige mediumverandering uit op de cellen in het 2D-systeem. Verzamel alle 1,5 ml cellen uit één put en centrifugeer het bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verwijder het grootste deel van het supernatant met een pipet en resuspendeer de pellet met 1,5 ml NK-2 medium (stap 3.4.1).
- Voer elke andere dag een gemiddelde verandering uit. Kantel de plaat van het 3D-systeem iets en verwijder al het oude medium buiten de transwell. Voeg 500 μL NK-2 medium toe buiten de transwell.
- Om een halve mediumverandering uit te voeren op een put van een 12-well plaat voor het 2D-systeem, laat u de cellen 1-2 minuten zitten om de cellen naar de bodem te laten zinken. Zuig voorzichtig 750 μL van het medium uit.
- Draai het verzamelde supernatant op 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur om celverlies te voorkomen. Gooi het grootste deel van het supernatant weg en resuspenseer in 750 μL NK-2-medium door vijf tot zes keer te pipetteren. Voeg de in vers medium geresuspendeerde cellen toe aan het oorspronkelijke putje.
- Verwijder het oude medium van het 3D-systeem en voeg 500 μL NK-2 (in de handel verkrijgbaar NK-celdifferentiatiemedium + 4.500 IE/ml IL-15, 8.800 IE/ml IL-7, 26 IE/ml SCF en 12 IE/ml ftl3L, zie de materiaaltabel) toe aan het onderste compartiment van de transwell. Incubeer bij 37 °C en 5% CO2 gedurende 14 dagen.
4. Rijpe cellen oogsten
- Oogst de cellen gekweekt in het 2D-systeem.
- Oogst de cellen door op en neer te pipetteren tijdens dag 38-45. Tweemaal wassen met 1 ml PBS. Centrifugeer de celsuspensie bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder het supernatant met een pipet en resuspenseer het in de buffer naar keuze (d.w.z. PBS + 2% FBS voor flowcytometrie, zie de tabel met materialen).
- Oogst de cellen ingebed in de organoïde.
- Verzamel het medium van buiten de transwell in een buis van 15 ml tijdens dag 38-45. Was de organoïde tweemaal door 200 μL PBS in de transwell toe te voegen en vijf tot zes keer op en neer te pipetteren. Breng de suspensie over op de buis van 15 ml.
- Voeg 500 μL PBS toe aan een putje van een 12-well plaat. Breng de organoïde over van de transwell naar die put van de 12-well plaat met een tang.
- Knip de organoïde 20 keer met een schaar en tang. Spoel de resterende cellen op de tang en schaar in de put met PBS. Verzamel zoveel mogelijk PBS en breng het over naar de buis van 15 ml die in stap 4.2.1 is gebruikt zonder de organoïde structuur aan te zuigen.
- Voeg 500 μL van het dissociatiereagens (zie de materiaaltabel) toe aan de transwell om de organoïde enzymatisch te verteren. Incubeer met een commerciële celloslatingsoplossing (zie de materiaaltabel) gedurende 7-10 minuten bij 37 °C en 5% CO2. Doof de reactie door 1 ml PBS met 2% FBS toe te voegen en verzamel de oplossing in een andere buis van 15 ml. Was de put tweemaal met 1 ml PBS met 2% FBS.
OPMERKING: Bepaal de lengte van de incubatie op basis van de morfologie. Probeer het punt te bereiken waarop afzonderlijke cellen beginnen te worden vrijgegeven uit het membraan van de 3D-structuur. - Voeg 1 ml PBS toe met 2% FBS en pipetteer 8-10 keer op en neer. Verzamel alle oplossingen, inclusief de organoïde structuren. Breng ze over op de buis van 15 ml die in stap 4.2.3 is gebruikt met een celzeef.
- Centrifugeer beide buizen bij 500 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Gooi het supernatant weg met een pipet. Resuspendeer de celpellet met de buffer naar keuze (stap 4.1.2).
Representative Results
Er werd verondersteld dat de huidige in vitro differentiatie (IVD) producten vergelijkbare oppervlaktemarkers en antitumorcapaciteiten zouden bezitten als menselijke NK-cellen.
De definiërende marker van menselijke NK-cellen werd benaderd om te testen of de differentiatieproducten van het 3D-kweeksysteem cellen opleverden die fenotypisch leken op menselijke NK-cellen. Ongeveer 15% van de cellen die uit het 3D-kweeksysteem werden gedissocieerd uit twee batches geïnduceerd op verschillende tijdstippen (n = 2) waren CD3−CD56+ (figuur 3A). CD3 werd vervangen door CD45 (een pan-leukocytenmarker) in het testpanel vanwege de afwezigheid van CD3 en de moeilijkheid om T-cellen in vitro te induceren. Ongeveer 16% van de cellen gedissocieerd van de 3D-structuur waren CD45+CD56+ (Figuur 3B, n = 1), wat in lijn is met de percentages CD3−CD56+ cellen die in eerdere onderzoeken werden gezien. De percentages CD3-CD56+ cellen in de cellen geoogst uit het 2D kweeksysteem varieerden van 30% tot 6%, van meer succesvolle inducties (Figuur 3C, n = 3) tot minder succesvolle inducties (Figuur 3D, n = 2). De functionaliteit en fenotypen van de cellen die uit het 2D-kweeksysteem werden geoogst, werden gevalideerd. Tijdens de Dag 18-kweek van het 2D-systeem bracht ongeveer 12% van de cellen zowel ectopische CD56 als CD107a tot expressie na 2 uur 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 en 20 ng / ml anti-CD244 antilichaamstimulatie (figuur 4C, n = 1). Ongeveer 28% van de geoogste cellen waren CD94+CD159a+ (Figuur 4B, n = 1). De ectopische expressie van CD107a, een eiwitvoering op het membraan van korrels, duidt op degranulatie10, terwijl het CD94 / NKG2A (CD159a) heterodimeer een andere bepalende marker van NK-cellen is. Dit geeft een voorbeeld van de fenotypische en functionaliteitsvalidatie van IVD-producten.
De functionaliteit van de IVD-producten werd getest door hun cytotoxiciteit tegen menselijke erythroleukemia-cellen-K562-cellen. Uitgebreide ligandprofilering op K562-cellen onthult hun gedownreguleerde grote histochemiecomplex I (MHC-I) en relatief sterke NKG2D-ligandexpressie (zoals ULBP-1, ULBP-2/5/6 en ULBP-3)11; K562-cellen zijn dus gevoelig voor de lytische activiteit van NK-cellen12. Zowel IVD-eindpuntproducten als NK92mi-cellen werden 's nachts geprimed met 50 ng / ml IL-18, 455 IE / ml IL-2 en 20 ng / ml anti-CD244-antilichamen. De GFP+ K562-cellen werden gecocultureerd met geoogste cellen van IVD- of NK92mi-cellen in verschillende effector-to-target-verhoudingen (E: T) in aanwezigheid van 50 ng / ml (IE niet meegeleverd) IL-18, 455 IE / ml IL-2 en 20 ng / ml anti-CD244-antilichamen in hetzelfde volume H5100-medium gedurende 3 uur. De uitlezing van NK-celdodingsactiviteit was de expressie van de dode celmarker op GFP+ subsets. De K562-cellen werden getransduceerd met een in de handel verkrijgbare controlevector (zie de tabel met materialen) om GFP constitutief uit te drukken, en de efficiëntie van de transductie was ongeveer 80% (aanvullende figuur 1A). De percentages van het toegevoegde GFP-signaal waren evenredig met het aantal toegevoegde GFP+ K562-cellen, wat wijst op specifieke GFP-expressie van de getransduceerde K562-cellen (aanvullende figuur 1B).
De percentages stervende doelcellen in figuur 5 werden berekend met de volgende formule13:
Percentage stervende cellen = (FITC + DAPI + % van de cocultuur [bijvoorbeeld figuur 5A]) - (FITC + DAPI + % van de getransduceerde K562-cellen)
Van alle drie de beoordeelde E:T-verhoudingen (0,1:1, 0,33:1, 1:1) waren de percentages stervende GFP+ cellen positief gecorreleerd met de E:T-verhoudingen bij coculture met IVD-producten (Figuur 5B, hEPSC-NK) of NK92mi-cellen (Figuur 5B, NK92mi), wat wijst op het specifieke doden van tumordoelen. De cytotoxiciteit van de IVD-producten was echter relatief bescheiden binnen het geteste tijdsbestek (figuur 5C).
Ten slotte werd de lymfoïde voorlopercelgeneratie vergeleken tussen de 3D- en 2D-culturen. Het bleek dat de 3D-cultuurconditie meer voorlopercellen genereerde (55.000 cellen) dan de 2D-cultuurconditie (36.000 cellen) (aanvullende figuur 2). Dit suggereert dat de context van weefselarchitectuur en cellulaire componenten in de 3D-cultuur de generatie van lymfoïde voorlopercellen ondersteunde.
Figuur 1: Schematisch diagram met de differentiatiestrategie om NK-cellen te differentiëren van hEPSC's. (A) Hier wordt de tijdlijn van de 3D-cultuursystemen weergegeven, met details over de kweekomstandigheden en korte trefwoorden van elke stap. De lucht-vloeistof interface van het 3D-systeem wordt gehandhaafd tijdens de NK-celinductie. (B) Hier wordt de tijdlijn van de 2D-cultuursystemen weergegeven. De vrijgekomen cellen die vanaf dag 7-10 worden geoogst uit structuren in het 3D-systeem, worden gezaaid op een gecoate plaat zonder de lucht-vloeistofinterface. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Morfologie van de cellen waargenomen in verschillende stadia van differentiatie. (A) De morfologie van hEPSC's wanneer gehandhaafd in EPSCM. De hEPSC's vormen koepelvormige kolonies. (B) De morfologie van hEPSC's na pre-differentiatie. De koepelvormige kolonies zijn afgeplat. De hEPSC's worden geoogst en vormen EV's met de hanging drop techniek. De EB's worden verzameld en gekweekt in medium A en vervolgens medium B. (C) De morfologie van een EB op dag 10. Tijdens deze periode begint de EB uit te breiden en op te blazen, waardoor vliezige structuren worden gevormd. (D) De morfologie van een cel-releasing EB. Na het zaaien op de transwell groeit de EB en geeft constant ronde cellen af aan de omgeving. Sommige van de vrijgekomen cellen worden verzameld en gekweekt op een 12-well plaat bedekt met lymfoïde differentiatie coating materialen. De celpopulaties zijn morfologisch heterogeen en hebben de neiging om samen te voegen. (E) De morfologie van cellen waargenomen op het eindpunt van de IVD. Kleine, cirkelvormige suspensiecellen (zwarte pijl) worden waargenomen. Schaalstaven: (A,B,E) = 100 μm; (C,D) = 100 μm. Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.
Figuur 3: Representatieve FACS-percelen van hEPSC-afgeleide producten op het eindpunt. Cellen worden geïncubeerd met fluoroscoop-geconjugeerde antilichamen op ijs gedurende 30 minuten. De monsters worden gekleurd met DAPI voordat ze in de FACS-monsterinjectiepoort worden geladen. Niet-gekleurde cellen worden gebruikt om de negatieve gating vast te stellen. (A) Representatieve FACS-plot op CD3- en CD56-expressie in cellen die zijn gedissocieerd van het 3D-kweeksysteem uit twee batches (n = 2). (B) Representatieve FACS-plot op CD45- en CD56-expressie in cellen die zijn gedissocieerd van de 3D-cultuur (n = 1). (C) Representatief FACS-waarnemingspunt op CD3- en CD56-expressie in cellen die zijn geoogst uit de gecoate plaat van een succesvolle inductie (n = 3). (D) Representatieve FACS-plot op CD3- en CD56-expressie van de gecoate plaat wanneer de inductie suboptimaal is (n = 2). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Representatieve FACS-plot op hEPSC-afgeleide producten tijdens dag 18-cultuur (n = 1). (A) FACS-plot op CD56- en CD107a-expressie na 2 uur stimulatie met IL2-, IL-18- en anti-CD244-antilichamen. (B) FACS-plot op CD159a- en CD94-expressie. De monsters worden gekleurd met DAPI voordat ze in de FACS-monsterinjectiepoort worden geladen. Niet-gekleurde cellen worden gebruikt om de negatieve gating vast te stellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Grafiek van de percentages stervende cellen tegen verschillende E:T-verhoudingen uit de cocultuur van GFP+ K562-cellen met ofwel het IVD-eindpuntproduct ofwel NK92mi-cellen (n = 1). De expressie van FITC+ DAPI+ cellen werd beoordeeld met een celanalysator en de data-analyse werd uitgevoerd met compatibele software. (A) Een representatieve FACS-plot met de gating van FITC + DAPI + subsets uit de cocultuur van IVD-producten en K562-cellen met een E: T-verhouding van 1. (B) Individuele plots uit het cocultuurexperiment met GFP+ IVD-producten (links) of NK92mi-cellen (rechts) gedurende 3 uur. Beide weerspiegelen een positieve proportionele relatie tussen het percentage stervende cellen en de E: T-verhouding. (C) Een grafiek met de killing curves van IVD-producten en NK92mi-cellen op dezelfde schaal. De IVD-producten vertoonden een milde cytotoxiciteit in vergelijking met de NK92mi-cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Aanvullende figuur 1: Functionele assay van NK-cellen uit hEPSC's. (A) FACS-histogram van getransduceerde K562-cellen. De FITC+ K562 cellen brachten GFP tot expressie. (B) FACS-histogrammen van de cocultuur van GFP+ K562-cellen en de eindpunt IVD-producten in drie E:T-verhoudingen (n = 1). De percentages FITC+ cellen in de cocultuur kwamen overeen met het aantal toegevoegde getransduceerde K562 cellen. De gatings werden vastgesteld met niet-getransduceerde K562-cellen. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Aanvullende figuur 2: Lymfoïde voorloperdifferentiatie in 2D versus 3D-cultuur. Het huidige op organoïden gebaseerde protocol werd gebruikt om lymfoïde voorlopercellen te induceren uit menselijke geëxpandeerde potentiële stamcellen. Er werden twee voorwaarden opgesteld: (1) lymfoïde voorlopercellen werden in cultuur gehouden in de organoïden (3D) en (2) lymfoïde voorlopers werden geïsoleerd en op de kweekschaal gehouden (2D). Na 2 weken extra cultuur werden de celnummers bepaald om de 2D- versus 3D-cultuur te vergelijken. Klik hier om dit bestand te downloaden.
Discussion
Er zijn een paar cruciale stappen om de succesvolle differentiatie van CD45 + CD56 + -cellen van hEPSC's te garanderen. De pre-differentiatie (stap 1.2) is cruciaal omdat het EPSC-medium remmers van afstammingsverbintenis1 bevat. Na pre-differentiatie worden de koepelvormige kolonies van hEPSC's afgevlakt (figuur 2B). De toevoeging van Y27632, een Rho-kinaseremmer (ROCKi), tijdens de vorming van EB's uit hEPSC's (stap 1.3) is onmisbaar voor de overleving van de hEPSCs na dissociatie. Een andere belangrijke overweging is het aantal EB's dat op elke transwell is geplant. Omdat het een kleinschalig systeem is, is twee tot drie EV's per transwell de optimale dichtheid om overconsumptie van de media te voorkomen. De lucht-vloeistof interface wordt gehandhaafd gedurende het hele verloop van NK-celdifferentiatie voor het 3D-systeem, waarvan wordt aangenomen dat het de polariteit van de stromale cellen handhaaft en de expansie van de van AGM afgeleide hematopoietische voorlopers ondersteunt14,15.
Zoals eerder vermeld, is de dichtheid van EV's op de transwell een bepalende factor voor succesvolle differentiatie. Het belangrijkste teken hiervoor is de kleur van het medium 1 dag na de implantatie van EV's op de transwell. Als de kleur snel geel wordt, duidt dit op besmetting of overbevolking. Om het probleem op te lossen, moet een pipet van 1 ml worden gebruikt om handmatig extra EB's op te pakken en over te brengen naar een andere transwell.
Een belangrijke beperking van dit protocol is de zuiverheid van CD3−/CD45+ CD56+ cellen in de IVD-producten, waarvan wordt aangenomen dat deze gedeeltelijk verantwoordelijk is voor de inferieure cytotoxiciteit in vergelijking met pure NK92mi-cellen. Een 3D-kweeksysteem werd gebruikt om hematopoëtische voorlopercellen te induceren via de generatie van een EB die lijkt op de drie embryonale kiemlagen. Deze strategie bootst de ontwikkeling van bloedcellen in de micro-omgeving van het beenmerg na, waardoor de noodzaak voor stromale cellen om de differentiatie te ondersteunenwordt weggenomen 3. Zonder een sorteerstap om de hematopoietische voorlopers te zuiveren, wordt verwacht dat de zuiverheid van de IVD-producten zal worden verminderd. Een strategie om de complexe differentiatieniche te behouden en tegelijkertijd de zuiverheid van het eindpuntproduct te vergroten, is het ontwikkelen van een uitbreidingsmethode voor de gesorteerde CD3-CD56 + IVD-producten. De gesorteerde CD3−CD56+ IVD-producten kunnen bijvoorbeeld worden gekweekt op kunstmatige antigeen-presenterende cellen (aAPCs), zoals bestraalde K562-cellen die zijn ontworpen met membraangebonden IL-21. Met de aanvoer van IL-2 in de kweek kan deze methode een 1.000-voudige toename van NK-celnummers3 bereiken.
Een andere beperking is de beperkte toegang tot bonafide menselijke NK-cellen als positieve referentie. NK92mi is de positieve referentie die wordt gebruikt in de cocultuurtest, maar het is niet nauwkeurig genoeg. NK92mi-cellen worden vervaardigd uit NK92-cellen, een permanente cellijn die geactiveerde NK-celfenotypen16 tot expressie brengt, om autonoom IL-2 te produceren om aan de kweekvereisten te voldoen. NK92-cellen vertonen in vitro een superieure dodingsactiviteit tegen K562-cellen dan menselijke primaire NK-cellen17. Een eerlijkere vergelijking van de tumordodende capaciteit van IVD-producten zou kunnen worden bereikt door de cytotoxiciteit van perifere bloed-NK-cellen parallel te testen, maar helaas ontbreekt toegang tot bloedbanken.
Dit cultuurprotocol met twee systemen is bedoeld om CD3−/CD45+CD56+ cellen te genereren uit hEPSC's. De beoordeling van de oppervlaktemarkers en cytotoxiciteit met FACS kan routinematig worden uitgevoerd op cellen uit 2D-systemen zonder de differentiatieniche te verstoren. Ondanks de verschillen in de percentages CD3-CD56+ cellen, kunnen de 3D- en 2D-systemen CD3-CD56+ cellen afleiden met vergelijkbare variaties in CD56-expressie (figuur 3), en het 2D-systeem weerspiegelt het bestaan van lymfoïde voorlopercellen uit de 3D-cultuurconditie.
Het belang van het gebruik van het 3D-cultuursysteem is dat het het gebruik van profileringstests met hoge resolutie mogelijk maakt, zoals ruimtelijke transcriptomica of imaging massaspectrometrie, om de ruimtelijke relaties en cel-celinteracties binnen de complexe differentiatieniche te onderzoeken.
Disclosures
De auteurs verklaren geen belangenconflicten.
Acknowledgments
We willen Dr. Handi Cao, Sanxing GAO, David Xiang, Yiming Chao, Ritika Jogani, Owen Chan, Stephanie Cheung en Celine Chan bedanken voor hun technische assistentie en nuttige discussies. Dit werk werd ondersteund door het Platform Technology Fund. Figuur 1 is gemaakt met BioRender.com.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 30 w/v% Albumin Solution, from Bovine Serum(BSA), Fatty Acid Free | Wako Chemicals | 017-22231 | For resuspending cytokines. |
| ACCUMAX | STEMCELL Technologies | 07921 | |
| Anti-human-CD159a-PE | BD | 375104 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Anti-human-CD3-APC antibodies | BD | 555355 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 2% FBS) |
| Anti-human-CD45-APC antibodies | BD | 555485 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 3% FBS) |
| Anti-human-CD56-PE antibodies | BD | 555516 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 4% FBS) |
| Anti-human-CD56-PEcy7 antibodies | BD | 335826 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Anti-human-CD94-APC | BD | 559876 | During antibody staining, 0.5 µL of antibodies is added into the staining buffer (PBS + 5% FBS) |
| Bemis Parafilm M Laboratory Wrapping Film | Thermo Scientific | 11772644 | |
| Cd244 Monoclonal Antibody (eBioC1.7 (C1.7)), Functional Grade, eBioscience | Thermo Scientific | 16-5838-85 | |
| Costar 6.5 mm Transwell, 0.4 µm Pore Polyester Membrane Inserts | STEMCELL Technologies | 3470 | |
| Dapi Solution, 1 mg/mL | BD | 564907 | It is resuspended with ddH2O so the concentration is 10 µM/mL. Add 1 µL of the aliquot in 300 µL of FACS buffer (PBS + 2% FBS) |
| DMEM | CPOS-Bioreagent core | 11965092 | |
| DMEM/F12 | Thermo Scientific | 11320033 | |
| FcX, human | Biolengend | 422302 | |
| Fetal Bovine Serum(FBS) qualified E.U.-approved South America | CPOS-Bioreagent core | 10270106 | |
| FlowJo v10.8.0 | BD | ||
| Gibco PBS (10x) pH 7.4 | CPOS-Bioreagent core | 70011044 | 10x concentrated PBS is manufactured as follows: without calcium, magnesium or phenol red |
| K562 cells | ATCC | CCL-243 | |
| Knockout Serum Replacement | Thermo Scientific | 10828-028 | |
| MyeloCult H5100 medium | STEMCELL Technologies | 5150 | |
| NK92mi cells | ATCC | CRL-2408 | Lot: 70045208. Once thawed, they are cultured in MyeloCult H5100 medium, and maintained the density between 2 x 105 to 1 x 106 cell/mL. |
| Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 12 well plate | Thermo Scientific | 150628 | flat bottom |
| Nunc Cell-Culture Treated Multidishes 24 well plate | Thermo Scientific | 142475 | |
| Nunc EasYDish Dishes | Thermo Scientific | 150460 | |
| pLenti-GFP Lentiviral Control Vector | CELL BIOLABS | LTV-400 | It is packaged as the manufactuer suggested (https://www.cellbiolabs.com/sites/default/files/LTV-400-gfp- lentiviral-plasmid.pdf). 40 μL of 50x lentivirus is added with 1 μL 10 mg/mL polybrene per 1 mL of cell suspension. Complete medium change is performed 24 h after the addition of lentivirus. Cells are incubated undisputedly for 3 days at 37 °C, 5% CO2. |
| Polybrene | EMD Millipore | TR-1003-G | |
| Recombinant Human Flt-3 Ligand/FLT3L Protein | R&D Systems | 308-FK-005 | It is resuspend with PBS + 0.2% BSA. Thr working concentration is 10 ng/mL or 12 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-15 Protein | R&D Systems | 247-ILB-005 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 10 ng/mL or 4500 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-18/IL-1F4 Protein | R&D Systems | 9124-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL. The IU is not provided by the company. |
| Recombinant Human IL-2 Protein | R&D Systems | 202-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 50 ng/mL or 455 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-3 Protein, 50ug | PeproTech | 200-03 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 5 ng/mL or 14 IU/mL. |
| Recombinant Human IL-7 Protein | R&D Systems | 207-IL-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 8800 IU/mL. |
| Recombinant Human SCF Protein | R&D Systems | 255-SC-010 | It is resuspended with PBS + 0.2% BSA. The working concentration is 20 ng/mL or 26 IU/mL. |
| STEMdiff Hematopoietic Kit | STEMCELL Technologies | 5310 | Medium A: 45 mL STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement A ; Medium B: 75 STEMdiff Hematopoietic Basal Medium + STEMdiff Hematopoietic Supplement B |
| StemSpan lymphoid differentiation coating material | STEMCELL Technologies | 9950 | It is resuspended in PBS (100x) |
| StemSpan NK cell differentiation medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 500 µL StemSpan NK Cell Differentiation Supplement (100x) into 49.5 mL of SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
| StemSpan lymphoid expansion medium | STEMCELL Technologies | 9960 | It is prepared by adding 5 mL StemSpan Lymphoid Progenitor Expansion Supplement (10x) into 45 mL of StemSpan SFEM II. Both are provided in StemSpan NK Cell Generation Kit. |
| StemSpan NK Cell Generation Kit | STEMCELL Technologies | 9960 | Thaw the medium and materials in room temperature and the medium is stored in 4 °C once thawed. |
| The BD LSRFortessa cell analyzer | BD | ||
| Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Thermo Scientific | 25300054 | |
| Y-27632 dihydrochloride | Tocris | 1254 | working concentration: 10 µM |
References
- Gao, X., et al. Establishment of porcine and human expanded potential stem cells. Nature Cell Biology. 21 (6), 687-699 (2019).
- Mackinlay, K. M. L., et al. An in vitro stem cell model of human epiblast and yolk sac interaction. eLife. 10, 63930 (2021).
- Zhu, H., Kaufman, D. S. An improved method to produce clinical-scale natural killer cells from human pluripotent stem cells. Methods in Molecular Biology. 2048, 107-119 (2019).
- Li, Y., Hermanson, D. L., Moriarity, B. S., Kaufman, D. S. Human iPSC-derived natural killer cells engineered with chimeric antigen receptors enhance anti-tumor activity. Cell Stem Cell. 23 (2), 181-192 (2018).
- Vivier, E., Tomasello, E., Baratin, M., Walzer, T., Ugolini, S.
- Dhar, P., Wu, J. D. NKG2D and its ligands in cancer. Current Opinion in Immunology. 51, 55-61 (2018).
- Dang, S. M., Kyba, M., Perlingeiro, R., Daley, G. Q., Zandstra, P. W. Efficiency of embryoid body formation and hematopoietic development from embryonic stem cells in different culture systems. Biotechnology and Bioengineering. 78 (4), 442-453 (2002).
- Rungarunlert, S., Techakumphu, M., Pirity, M. K., Dinnyes, A. Embryoid body formation from embryonic and induced pluripotent stem cells: Benefits of bioreactors. World Journal of Stem Cells. 1, 11-21 (2009).
- Counting cells using a hemocytometer. abcam. , Available from: https://www.abcam.com/protocols/counting-cells-using-a-haemocytometer (2022).
- Alter, G., Malenfant, J. M., Altfeld, M. CD107a as a functional marker for the identification of natural killer cell activity. Journal of Immunological Methods. 294, 15-22 (2004).
- Tremblay-McLean, A., Coenraads, S., Kiani, Z., Dupuy, F. P., Bernard, N. F. Expression of ligands for activating natural killer cell receptors on cell lines commonly used to assess natural killer cell function. BMC Immunology. 20, 8 (2019).
- Inoue, T., Swain, A., Nakanishi, Y., Sugiyama, D. Multicolor analysis of cell surface marker of human leukemia cell lines using flow cytometry. Anticancer Research. 34 (8), 4539 (2014).
- Mhatre, S. Rapid flow cytometry based cytotoxicity assay for evaluation of NK cell function. Indian Journal of Experimental Biology. 52 (10), 983-988 (2014).
- Medvinsky, A., Dzierzak, E. Definitive hematopoiesis is autonomously initiated by the AGM region. Cell. 86 (6), 897-906 (1996).
- Motazedian, A., et al. Multipotent RAG1+ progenitors emerge directly from haemogenic endothelium in human pluripotent stem cell-derived haematopoietic organoids. Nature Cell Biology. 22 (1), 60-73 (2020).
- Gong, J. H., Maki, G., Klingemann, H. G. Characterization of a human cell line (NK-92) with phenotypical and functional characteristics of activated natural killer cells. Leukemia. 8 (4), 652-658 (1994).
- Yan, Y., et al. Antileukemia activity of a natural killer cell line against human leukemias. Clinical Cancer Research. 4 (11), 2859-2868 (1998).
