Generación de ratas hipoparatiroideas mediante paratiroidectomía asistida por nanopartículas de carbono

Summary

Un modelo animal de hipoparatiroidismo adquirido (HypoPT) es crucial para comprender cómo HypoPT afecta la homeostasis de iones minerales y para verificar la efectividad de nuevos tratamientos. Aquí, se presenta una técnica para generar un modelo de rata de hipoparatiroidismo adquirido (AHypoPT) mediante paratiroidectomía (PTX) utilizando nanopartículas de carbono.

Abstract

El hipoparatiroidismo (HypoPT) es una enfermedad rara que afecta a las glándulas paratiroides que se caracteriza por una secreción reducida o potencia de la hormona paratiroidea (PTH), lo que conduce a altos niveles séricos de fósforo y bajos niveles de calcio sérico. HypoPT más comúnmente resulta de daño accidental a las glándulas o su extirpación durante la tiroides u otra cirugía anterior del cuello. La cirugía paratiroidea / tiroidea se ha vuelto más común en los últimos años, con un aumento correspondiente en la aparición de hipoPT como una complicación postoperatoria. Existe una necesidad crítica de un modelo animal HypoPT para comprender mejor los mecanismos subyacentes a los efectos de HypoPT en la homeostasis de iones minerales y para verificar la efectividad terapéutica de nuevos tratamientos. Aquí, se informa que una técnica crea HypoPT adquirido en ratas macho mediante la realización de paratiroidectomía (PTX) utilizando nanopartículas de carbono. El modelo de rata muestra una gran promesa sobre los modelos de ratón de hipoparatiroidismo. Es importante destacar que la región de unión al receptor de PTH humana tiene una similitud de secuencia del 84,2% con la de la rata, que es mayor que la similitud del 73,7% compartida con los ratones. Además, los efectos del estrógeno, que pueden afectar la vía de señalización del receptor PTH/PTHrP, no se han investigado completamente en ratas macho. Las nanopartículas de carbono son trazadores linfáticos que tiñen de negro los ganglios linfáticos tiroideos sin afectar su función, pero no tiñen las glándulas paratiroides, lo que las hace fáciles de identificar y eliminar. En este estudio, los niveles séricos de PTH fueron indetectables después de PTX, y esto resultó en hipocalcemia e hiperfosfatemia significativas. Por lo tanto, el estado clínico de HypoPT postoperatorio se puede representar notablemente en el modelo de rata. Por lo tanto, el PTX asistido por nanopartículas de carbono puede servir como un modelo extraordinariamente efectivo y fácilmente implementable para estudiar la patogénesis, el tratamiento y el pronóstico de HypoPT.

Introduction

La hormona paratiroidea (PTH) es secretada por las glándulas paratiroides. Es un modulador importante del balance de calcio, mantiene el metabolismo del fosfato y participa en el recambio óseo ^1,2. El hipoparatiroidismo (HypoPT) se manifiesta como una disminución de la secreción o pérdida funcional de PTH. Es un trastorno endocrino raro, con una prevalencia de aproximadamente 9-37 por 100.000 años-persona ^3,4,5. HypoPT se caracteriza por una disminución de la PTH sérica y los niveles de calcio acompañados de un aumento del fósforo sérico ^6,7. La hipoPT se clasifica según su causa: hipoparatiroidismo adquirido (AHypoPT) o hipoparatiroidismo idiopático (IHypoPT)⁸. AHypoPT se encuentra más comúnmente en la práctica clínica; alrededor del 75% de los casos de AHypoPT son causados por resección o lesión accidental de las glándulas paratiroides durante la cirugía de tiroides u otras cirugías de cabeza y cuello. Otras causas incluyen radioterapia y quimioterapia para tumores de cabeza y cuello y toxicidad farmacológica ^1,8. Los métodos de diagnóstico mejorados y un aumento en la detección de enfermedades asociadas a la glándula tiroides han aumentado el número de operaciones quirúrgicas de la glándula tiroides. Esto ha llevado a un aumento correspondiente en las complicaciones relacionadas con la glándula paratiroides ^9,10.

Se necesitan modelos animales fácilmente establecidos con características estables para investigar mejor AHypoPT y verificar la efectividad terapéutica de nuevos tratamientos. La paratiroidectomía (PTX) realizada en ratas y ratones ha sido reportada en estudios previos ^6,11; Sin embargo, debido al tamaño extremadamente pequeño de las glándulas paratiroides y la variabilidad en su distribución anatómica, la tasa de éxito es relativamente baja en la práctica. Así, la tiro-paratiroidectomía (TPTX) (es decir, la extirpación total de las glándulas tiroides y paratiroides) generalmente se realiza para asegurar la resección de las glándulas paratiroides¹². Sin embargo, los niveles bajos de tiroxina resultantes pueden complicar los estudios con este modelo animal¹³. Los modelos de hipoPT establecidos por otros métodos, como la estimulación farmacológica y la edición de genes, no pueden representar adecuadamente la patogénesis más común de AHypoPT. Nuestro grupo utilizó previamente modelos de ratón knockout para etiquetar las glándulas paratiroides y permitir la extirpación de las glándulas paratiroides sin dañar las glándulas tiroides y las estructuras anatómicas circundantes^14,15. Sin embargo, este método utiliza modelos de ratones transgénicos, que requieren un tiempo de desarrollo más largo debido a los requisitos de apareamiento y reproducción.

Por lo tanto, nuestro objetivo fue establecer un modelo fácilmente generado de AHypoPT. Este estudio describe un modelo de rata para PTX utilizando el etiquetado de nanopartículas de carbono. Una suspensión de nanopartículas de carbono de 50 mg/mL, que se usa comúnmente en cirugía de tiroides, se distribuye uniformemente en las glándulas tiroides después de la inyección local¹⁶. Las glándulas tiroides se vuelven negras, pero las glándulas paratiroides se dejan sin teñir¹⁷, distinguiendo así claramente las glándulas paratiroides de las glándulas tiroides y permitiendo que el PTX se realice sin afectar las glándulas tiroides. Este método es adecuado para ratas de diferentes edades. La inyección de la suspensión de nanopartículas de carbono es segura y tiene un efecto insignificante sobre la función tiroidea¹⁸. El modelo de rata PTX marcado con nanopartículas de carbono generado en este estudio mostró fenotipos significativos de hipocalcemia e hiperfosfatemia durante el período de observación de 4 semanas. Por lo tanto, este modelo AHypoPT es fácil de establecer y tiene un fenotipo reproducible.

Protocol

Este estudio fue aprobado por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales en el Laboratorio Estatal Clave de Enfermedades Orales de la Universidad de Sichuan. Se obtuvo permiso de las agencias locales pertinentes antes del experimento. Para el presente estudio se utilizaron ocho ratas Sprague-Dawley (SD) macho de 8-10 semanas de edad, con un peso promedio de 200-250 g. Los animales fueron obtenidos de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Se proporcionaron alimentos y agua ad libitum durante todo el período experimental.

1. Preparación preoperatoria para la generación de ratas PTX asistidas por nanopartículas de carbono

1. Anestesiar a las ratas de 8-10 semanas de edad usando inhalación de isoflurano al 2,0% -2,5%, seguida de una inyección intraperitoneal (i.p.) de tribromoetanol a 10 mL/kg de peso corporal. Garantizar una profundidad suficiente de anestesia probando la ausencia del reflejo lumínico pupilar. Use ungüento veterinario en los ojos para prevenir la sequedad mientras está bajo anestesia.
   NOTA: Las ratas que tienen entre 8 y 10 semanas de edad son reconocidas como ratas adultas. Sin embargo, este método de modelado se puede utilizar en ratas de tan solo 7 días de edad.
2. Preparar a las ratas SD anestesiadas para la cirugía afeitando el pelaje de la región ventral del cuello en posición supina. Desinfecte el área operatoria con bolas de algodón de povidona yodada (consulte la Tabla de materiales).
3. Cubra al animal con cortinas quirúrgicas (ver Tabla de materiales) y exponga la región quirúrgica, con el objetivo de minimizar la contaminación microbiana.

2. Paratiroidectomía (PTX)

1. Comience en el punto medio entre las dos orejas y corte una incisión de 2 cm longitudinalmente hacia la cola con un bisturí quirúrgico. Diseccionar la fascia y la capa de grasa sucesivamente con pinzas afiladas, curvas y dentadas.
2. Separe los músculos paratraqueales y exponga la tráquea usando pinzas relativamente romas bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 4x-5x.
3. Localice los lóbulos izquierdo y derecho de las glándulas tiroides en forma de mariposa al lado de la tráquea.
4. Inyecte 1 μL de la suspensión de nanopartículas de carbono (consulte la Tabla de materiales) debajo de la membrana de las glándulas tiroides utilizando una jeringa de 10 μL con una aguja biselada de 30 G. Después de 5 minutos, irrigar la región operatoria con solución salina para limpiar la suspensión de nanopartículas de carbono adicional que cubre la membrana de la glándula tiroides.
   NOTA: El punto de inyección recomendado es la porción mesial del lóbulo de la glándula tiroides, que tiene menos vasos sanguíneos. Una suspensión de nanopartículas de carbono se usa comúnmente en la cirugía de tiroides debido a su capacidad para detectar los ganglios linfáticos. Teñir las glándulas tiroides y dejar las glándulas paratiroides sin teñir facilita la identificación de estas últimas.
5. Verifique que las glándulas tiroides se vuelvan negras mientras que las glándulas paratiroides permanecen sin teñir en ~ 5 minutos. Observe las glándulas paratiroides resaltadas bajo luz ordinaria usando la luz de un microscopio estereoscópico o una lámpara de mesa.
   NOTA: Por lo general, los roedores tienen dos glándulas paratiroides en forma de gota ubicadas en las superficies izquierda y derecha de las glándulas tiroides. Ocasionalmente, las glándulas paratiroides adicionales pueden estar ubicadas más lejos.
6. Corte con precisión las glándulas paratiroides sin teñir con pinzas y tijeras de microcirugía. Use bolas de algodón estériles para la hemostasia o una esponja de gelatina si hay más sangrado.
7. Cierre los músculos, las capas de grasa y la piel, capa por capa, con una sutura horizontal interrumpida del colchón usando 6-0 suturas de poliglactina 910 (consulte la Tabla de materiales).
8. Para el grupo simulado, realice todos los pasos de la preparación preoperatoria y PTX excepto el paso 2.6. Anestesiar a las ratas y separar los tejidos por encima de la tráquea. Localice las glándulas paratiroides, pero no las extirpe. Realizar recuperación postoperatoria y observación junto con las ratas del grupo PTX.

3. Recuperación postoperatoria y observación

1. Después de la cirugía, coloque las ratas en una manta eléctrica termostática (37 ° C) para mantener su temperatura corporal. Inyectar clorhidrato de buprenorfina 0,01 mg/kg por vía subcutánea (s.c) cada 12 h como analgesia postoperatoria. Transfiera las ratas a una jaula estéril cuando comiencen a moverse y traten de gatear.
2. Observe de cerca a las ratas después de la operación durante 2 h. Devuelva las ratas a la sala de cría, obsérvelas rutinariamente y registre su estado.
3. Extraiga 10 μL de sangre de la vena de la cola 7 días después de la cirugía. Mida el Ca²⁺ sérico, el Pi sérico y la PTH sérica utilizando kits comerciales apropiados (consulte la Tabla de materiales). Una paratiroidectomía exitosa produce una reducción sérica ionizada de Ca²⁺ nivel 2 SD menor que la de las ratas operadas con simulacro (9.00 mmol / L, n = 16).
   NOTA: Para el análisis estadístico se utilizó un software de estadísticas y gráficos (ver Tabla de materiales). Se utilizó una prueba t de Student para comparar los parámetros séricos y urinarios entre los grupos simulado y PTX. p < 0,05 se consideró estadísticamente significativo. El Ca²⁺ y Pi sérico y la urea y creatinina en suero se midieron con kits comerciales de acuerdo con las instrucciones del fabricante (ver Tabla de materiales). El telopéptido C sérico de colágeno tipo I y osteocalcina se midió con kits ELISA disponibles comercialmente (ver Tabla de materiales).

Results

Las ubicaciones y el número de glándulas paratiroides se observaron inicialmente en ratas bajo un microscopio de disección. Antes de la inyección de nanopartículas de carbono, las glándulas tiroides eran de un color rojo translúcido, y las glándulas paratiroides apenas se distinguían bajo el microscopio (Figura 1A). Después de la inyección de nanopartículas, las glándulas tiroides se tiñeron de negro, mientras que las glándulas paratiroides permanecieron sin teñir (Figur...

Discussion

Los informes epidemiológicos indican que la detección de enfermedades tiroideas ha aumentado significativamente, y el número de cirugías relacionadas realizadas ha aumentado en consecuencia^19,20. La tasa de incidencia de hipoparatiroidismo posquirúrgico es de aproximadamente 7,6%^8,21, mientras que el aumento de la morbilidad del hipoparatiroidismo adquirido ha provocado que esta enfermedad rara gane mayor atención de la investig...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Solución de cloruro de sodio al 0,9%	Kelun Co. Sichuan, China
10 µ L 30G Jeringa	NanoFil WPI
6-0 polyglactin 910 sutura con aguja	Ethicon, Inc	J510G
Prueba de calcio LiquiColor	EKF	0155-225	para análisis de Ca2+
Inyección de suspensión de nanopartículas de carbono	Lummy, Chongqing, China	H20073246	1 mL : 50 mg
Kit de ensayo de creatinina (Cr) ( sarcosina oxidasa )	Jiancheng, Nanjing, China	C011-2-1	Para el análisis de creatinina
Bisturí desechable	Shinva, China
Pinzas de biología Dumstar	Shinva, China
Micro Tijeras de disección de resorte	Shinva, China
MicroVue Rata intacta PTH ELISA	Immunotopics	30-2531	Para la medición de PTH en suero
de rataPortaagujas	Shinva, China
Prueba de fósforo Liqui-UV	EKF	0830-125	Para análisis de Pi
Gasa	de capa Weian Co. Henan, China
Povidona-Yodo	Yongan farmacéutica Co.Ltd. Chengdu, China
Prism 9.0 (software de estadísticas y gráficos)	GraphPad Software, Inc., San Diego, CA, EE. UU.		https://www.graphpad.com/scientific-software/prism/
Ratón C-telopéptido de colágeno tipo I (CTX-I) Kit ELISA	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E12776r	Para análisis CTX-I
Osteocalcina de rata/Proteína Gla ósea (OT/BGP) Kit ELISA	CUSABIO, Wuhan, China	CSB-E05129r	Para el análisis de osteocalcina
Hojas de afeitar de un solo filo de seguridad	American Safety Razor Company	66-0089
Ratas			8 a 10 semanas de edad
Paños de incisión quirúrgica	Liangyou Co. Sichuan, China
Kit de ensayo de urea	Jiancheng, Nanjing, China	C013-2-1	Para análisis de urea