Summary
Denne protokol beskriver højfrekvent ultralyd til visualisering af hele musens skjoldbruskkirtel og overvågning af væksten af anaplastisk skjoldbruskkirtelkarcinom.
Abstract
Anaplastisk thyreoideakarcinom (ATC) er forbundet med en dårlig prognose og kort median overlevelsestid, men ingen effektiv behandling forbedrer resultaterne betydeligt. Gensplejsede murinmodeller, der efterligner ATC's progression, kan hjælpe forskere med at studere behandlinger for denne sygdom. Krydsning af tre forskellige genotyper af mus, en TPO-cre / ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgen ATC-model blev udviklet. ATC-murinmodellen blev induceret ved en intraperitoneal injektion af tamoxifen med overekspression af BrafV600E og deletion af Trp53, og tumorerne blev genereret inden for ca. 1 måned. Ultralyd med høj opløsning blev anvendt til at undersøge tumorinitiering og progression, og den dynamiske vækstkurve blev opnået ved at måle tumorstørrelserne. Sammenlignet med magnetisk resonansbilleddannelse (MRI) og computertomografiscanning har ultralyd fordele ved at observere ATC-murinmodellen, såsom at være ikke-invasiv, bærbar, i realtid og uden strålingseksponering. Ultralyd med høj opløsning er velegnet til dynamiske og flere målinger. Imidlertid kræver ultralydsundersøgelse af skjoldbruskkirtlen hos mus relevant anatomisk viden og erfaring. Denne artikel indeholder en detaljeret procedure til brug af ultralyd med høj opløsning til at scanne tumorer i den transgene ATC-model. I mellemtiden er ultralydparameterjustering, ultralydscanningsfærdigheder, anæstesi og genopretning af dyrene og andre elementer, der har brug for opmærksomhed under processen, opført.
Introduction
Selvom anaplastisk skjoldbruskkirtelkarcinom (ATC) tegner sig for færre end 2% af kræft i skjoldbruskkirtlen, forårsager det mere end 50% af skjoldbruskkirtelkræftrelaterede dødsfald årligt. Den mediane overlevelsestid efter diagnose med ATC er kun ca. 6 måneder, og der findes ingen behandlinger, der signifikant forbedrer overlevelsen 1,2.
Sjældenheden af ATC har hæmmet forskningen, der studerer, hvordan sygdommen begynder og aggressivt skrider frem. Gensplejsede musemodeller, der efterligner sygdommen, er for nylig blevet tilgængelige, som giver indsigt i sygdommen og dens reaktioner på mulige behandlinger 3,4,5. Sådanne undersøgelser kræver nøjagtig tumorbilleddannelse til målinger og overvågning, som typisk udføres ved hjælp af magnetisk resonansbilleddannelse, computertomografi eller ultralydsscanning med høj opløsning 6,7. Ultralyd har været meget udbredt i museorganer. Det har fordele i forhold til magnetisk resonansbilleddannelse og computertomografi, da det kan udføres i realtid og ikke udsætter motivet for stråling, og det nødvendige udstyr er lille nok til at være bærbart 8,9. Imidlertid er undersøgelser af kontinuerlig overvågning af ATC-vækst ved hjælp af ultralyd sjældne; Derfor udforsker dette arbejde nytten af ultralyd i denne sammenhæng.
Her præsenteres en protokol til brug af ultralyd med høj opløsning til nøjagtigt at scanne, overvåge og måle tumorer i en musemodel af ATC.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Denne undersøgelse blev udført med godkendelse fra Animal Care and Use Committee ved Sichuan University. TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10 transgene mus10 blev anvendt i denne undersøgelse (se materialetabel). Protokoltrinnene kan ændres for forskellige dyrearter, hvis det er nødvendigt. Tolv mus, herunder seks hunner og seks hanner, med en gennemsnitsalder på 93 dage, blev brugt her.
1. Eksperimentel forberedelse
- Tænd ultralydssystemet (se materialefortegnelsen) og opret en ny mappe til optagelse af billederne og indsamling af dataene. Vælg 40 MHz linjesonden, og klik på overfladisk vævsmønster for at aktivere den overfladiske vævstransducer. Brug "B-tilstand" til billeddannelse af skjoldbruskkirtlen (figur 1A).
BEMÆRK: B-tilstand er den grundlæggende ultralydsbilleddannelsestilstand. Udseendet af ultralydsbilleder er afhængig af de fysiske interaktioner mellem lyd og væv i kroppen. B-mode billeder produceres som grå billeder11,12. - Hold musene i bestemte bure med fri adgang til mad og vand. Placer buret på en supplerende opvarmningsanordning (se materialetabellen) for at sikre termoregulering.
- Sørg for tilstrækkelig isofluran i fordamperen ogO2 i tanken. Hvis forsyningerne er utilstrækkelige, skal du bytte tankene til nye.
- Rengør dyrebilledplatformen med sterilt saltvand, og tænd for varmeknappen. Kontroller, at temperaturen er 38-40 °C, før dyret anbringes på platformen (figur 1C).
2. Forberedelse af dyr til billeddannelse
- Tænd for isofluranfordamperen. Overfør musen fra buret til bedøvelsesboksen.
- Bedøv dyret ved hjælp af en blanding af 1% -2% isofluran fra fordamperen og ilt, der strømmer ved 0,8 l / min.
- Påfør hårfjerningscreme fra brystet til nakken, vent 30 sekunder, og tør derefter cremen og pelsen helt væk. Skyl området og den omgivende pels grundigt med varmt sterilt saltvand.
- Placer det bedøvede dyr på den opvarmede platform. Dæk trynen med en næsekegle, der er forbundet til anæstesiudløbet (figur 2A, B).
OBS: Musen skal være helt bedøvet inden for 1-2 min. Hvis dyret stadig er aktivt, skal der udføres langvarig induktion af isofluran, indtil dyret ikke længere udviser pedaltilbagetrækningsrefleks. Sørg for, at dyret trækker vejret stabilt. - Under billeddannelse skal du overvåge musens puls gennem den opvarmede platform.
BEMÆRK: Ultralydsbilledbehandlingssystemet er udstyret med en pulsmåler. - Brug tape til at fastgøre musens lemmer til den opvarmede platform, med dyret i liggende stilling. Sørg for, at næsekeglen er stabilt placeret med en konstant bedøvelsesgasstrøm (1,5 l / min).
- Beskyt øjnene ved at anvende oftalmisk salve.
3. Tumor billeddannelse
- Juster billedbehandlingssystemet for at optimere opløsningen. Indstil følgende parametre: todimensionel forstærkning, 25-30 dB; billeddybde, 10 mm; antal brændvidder, 3; og center, 3-6 mm.
BEMÆRK: Til denne undersøgelse blev der anvendt en 40 MHz sonde. B-tilstanden blev specificeret til dataindsamling. - Påfør liberalt ultralydsgel (se materialetabel) på området med bar hud.
- Hold sonden og sæt den i kontakt med ultralydsgelen på brystet, og scan derefter fra brystet mod halsen for at lokalisere skjoldbruskkirtlen (figur 2C).
BEMÆRK: Tryk forsigtigt under scanning; Overdreven pres på dyrets hals kan forårsage gisp eller apnø. Denne protokol blev udviklet baseret på håndholdt scanning, men mekaniseret scanning kan også udføres ved hjælp af en maskine til at styre sonden, såsom en dyrebilleddannelsesplatform, der bevæger sig langs x- og y-akserne. - Scan op og ned for at identificere tumorens grænser og vurdere dens størrelse og form.
BEMÆRK: En sund skjoldbruskkirtel fremstår normalt som en hypoechogen, homogen struktur foran luftrøret. Anaplastiske tumorer får skjoldbruskkirtlen til at virke meget større, hvilket let kan identificeres ved halsscanning (figur 3). - Identificer ATC-tumorerne fra luftrøret og remmusklerne afhængigt af den anatomiske placering og ultralydekkoet.
BEMÆRK: Remmusklerne er placeret foran skjoldbruskkirtlen og luftrøret såvel som bag skjoldbruskkirtlen. Ultralydekkoet af remmusklerne forekommer højere end ATC's, mens dæmpning eksisterer bag luftrøret13.- Baseret på indtrykket af den samlede tumor skal du bekræfte billedafsnittet med den største venstre mod højre tumordiameter. Tryk på fryseknappen , og mål anteroposterior og venstre mod højre tumordiametre ved hjælp af ultralydstykkelsen.
BEMÆRK: Den anteroposteriore diameter skal måles vinkelret på venstre mod højre tumordiameter (figur 4). ATC's tumorstørrelse blev beregnet ved at multiplicere den anteroposteriore diameter med venstre mod højre tumordiameter14. Da størrelsen af tumorerne på venstre og højre side var inkonsekvent, blev hver side af tumorerne beregnet separat. Den samlede størrelse af tumorerne blev opnået ved at tilføje de bilaterale tumorer. Størrelserne blev registreret for at observere ATC's vækstkurve.
- Baseret på indtrykket af den samlede tumor skal du bekræfte billedafsnittet med den største venstre mod højre tumordiameter. Tryk på fryseknappen , og mål anteroposterior og venstre mod højre tumordiametre ved hjælp af ultralydstykkelsen.
- Gem optagelsen som en cine loop, hvilket letter gennemgangen af de valgte billeder.
4. Genopretning af dyr
- Efter scanning skal du tørre ultralydgelen og fjerne fastholdelsesbåndet fra dyrets lemmer.
- Placer musen på den supplerende varmeanordning (trin 1.2). Læg dyret på sin side (figur 2D).
- Når musen er kommet sig (~ 5 min), skal du overføre den tilbage til buret.
- Rengør ultralydssystemet, sonden og platformen ved hjælp af en blød klud og isopropylalkohol eller glutaraldehydservietter.
- Sluk for billedbehandlingssystemet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Den gennemsnitlige højre ATC-størrelse i begyndelsen af undersøgelsen var 4,867 mm 2, og den gennemsnitlige venstre ATC-størrelse var 5,189 mm2. På den fjerde måling var den gennemsnitlige højre ATC-størrelse vokset til 11.844 mm 2, mens tumorstørrelsen på venstre lap var vokset til 9.280 mm2. Den samlede ATC-størrelse steg fra 10.057 mm 2 til 15.843 mm2. I den senere fase af undersøgelsen voksede ATC hurtigt. Med hensyn til musen mærket "P92" (tabel 1) var tumorstørrelsen på den fjerde måling vokset til næsten fire gange større end størrelsen på den oprindelige måling. De repræsentative målinger af fire mus og vækstkurverne er vist i figur 5.
Højfrekvent ultralyd er den billeddannelsesmodalitet, der oftest bruges til at undersøge skjoldbruskkirtlen hos mennesker, og teknikken synes også velegnet til mus. Det kan visualisere hele musens skjoldbruskkirtel og detaljer om skjoldbruskkirtlen læsion vækst. Denne protokol til anvendelse af metoden til højfrekvent ultralyd kunne bruges til nøjagtigt at scanne, overvåge og måle tumorer i en genetisk manipuleret musemodel af ATC.
Figur 1: Udstyr anvendt i nærværende undersøgelse . (A) Det højfrekvente ultralydssystem. (B) Laboratorieartikler: (1) Elektrisk varmetæppe. (2) Køkkenrulle. (3) Ultralyd gel. (4) Isofluran fordamper. (5) Hårfjerningscreme. (6) Vatpinde. (7) Saks. (8) Selvklæbende tape. (9) Medicinske handsker. (10) Kammer til anæstesiinduktion. (11) Anæstesisystem. (C) Et mekaniseret scanningssystem til ultralydsbilleddannelse. Den helt bedøvede mus blev placeret på den opvarmede platform (vist med grønt), og scanningssonden blev fastgjort til en præcisions bevægelig arm. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Forberedelse af mus og ultralydsscanning. (A) Anæstesi induktion. (B) Fastgørelse af dyret på den opvarmede platform og anæstesivedligeholdelse. (C) Ultralydsscanning med frihåndsmetode. D) Dyrets bjærgning på varmetæppet. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Ultralydsbilleder af en ortopisk ATC-tumormusemodel. Den grønne linje afgrænser luftrøret, den røde linje afgrænser ATC-tumoren, og den gule linje afgrænser remmusklen. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Beregning af tumorstørrelsen. Tumorstørrelsen blev beregnet ved at multiplicere den anteroposteriore diameter (orange linje) med venstre mod højre tumordiameter (hvid linje). Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: Longitudinel analyse af ortopisk ATC-vækst i musemodellen . (A) Højre skjoldbruskkirtellap. (B) Venstre skjoldbruskkirtellap. (C) Hele skjoldbruskkirtlen. Hver kurve svarer til et dyr målt fire gange. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Dato | 2021.08.24 | 2021.09.16 | 2021.10.19 | 2021.11.19 | |
| Etiket | Sted | Tumor størrelse (mm2) | |||
| P71 | Højre | 6.39 | 6.688 | 6.327 | 8.461 |
| Venstre | 6.461 | 6.419 | 6.984 | 8.6 | |
| total | 12.851 | 13.107 | 13.311 | 17.062 | |
| P85 | Højre | 5.962 | 7.318 | 7.057 | 7.352 |
| Venstre | 6.809 | 7.165 | 8.514 | 30.836 | |
| total | 12.711 | 14.483 | 15.571 | 38.188 | |
| P89 | Højre | 4.423 | 5.423 | 5.988 | 8.911 |
| Venstre | 4.872 | 5.949 | 7.183 | 7.016 | |
| total | 9.296 | 11.372 | 13.172 | 15.928 | |
| P92 | Højre | 3.593 | 3.509 | 3.769 | 6.734 |
| Venstre | 2.724 | 4.033 | 5.39 | 19.97 | |
| total | 6.317 | 7.542 | 9.159 | 26.704 | |
Tabel 1: Data om måling af tumorstørrelse. "P71", "P85", "P89" og "P92" repræsenterer musenes etiketter. Til højre: tumorstørrelsen på højre side. Venstre: tumorstørrelsen på venstre side. I alt: den samlede tumorstørrelse ved at tilføje de bilaterale tumorer. Den første linje omfatter tumorstørrelsen (mm2: kvadratmillimeter) og datoen for målingerne.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Denne protokol bruger ultralyd med høj opløsning til at analysere ortopiske ATC-tumorer i en genetisk manipuleret musemodel. Den transgene model med en genotype af TPO-cre/ERT2; BrafCA/wt; Trp53 Δex2-10/Δex2-10, blev udviklet i vores laboratorium. Dyrene overudtrykker BrafV600E og mangler Trp53; Injektion af dyrene intraperitonealt med tamoxifen fører til tumorvækst efter ca. 1 måned10. Tumorerne vokser hurtigt og når en målbar størrelse inden for 50 dage. Denne protokol blev brugt til at overvåge tumorvækst i 4 måneder.
Ultralyd har vist sig pålidelig hos mus til billeddannelse væv, der optager lignende kropssteder som humane væv, herunder leveren, skjoldbruskkirtlen og fosteret9. Som hos mennesker er musens skjoldbruskkirtel placeret på hver side af skjoldbruskkirtlen brusk og luftrør13. Den præsenterede protokol tillader analyse af ATC-tumorer i skjoldbruskkirtlen, hvilket muliggør undersøgelse af tumorinitiering, progression og respons på behandlinger. Skjoldbruskkirteltumorerne i musemodellen voksede sig ret store og besatte rummet omkring luftrøret og remmusklerne. De viste solid-cystiske træk i ultralyd, svarende til follikulære strukturer. Den ikke-invasivitet, korte varighed og bekvemmelighed ved ultralyd kan gøre det mere attraktivt for mange forskergrupper end magnetisk resonansbilleddannelse eller computertomografi8. Da lange sedations- eller anæstesiperioder er unødvendige, kan ultralydets fordele lette langsgående undersøgelser.
Anvendelse af tilstrækkelig ultralydsgel under scanning er afgørende for at fjerne luftlommer, der kan påvirke billeddannelse og for at undgå overdreven kompression, der kan føre til apnø. Denne protokol udføres rutinemæssigt i vores laboratorium af erfarne ultralydspecialister, der udfører frihåndsscanning. Frihåndsscanning foretrækkes frem for en mekaniseret platform, fordi den giver fleksibilitet til at justere ultralydssondens position i henhold til dyrets tilstand. Når der anvendes en mekaniseret platform, skal x- og y-koordinaterne justeres for at forhindre overdreven kompression på dyret. Resultaterne viste, at tumorerne voksede langsomt i den tidlige periode, men fra dag 60 udviklede tumorerne sig dramatisk hurtigere, og den maksimale tumorstørrelse var 38.188 mm2. Den største dødsårsag var kvælning i det sene stadium. I kliniske forsøg er det på grund af sjældenheden af ATC-tumorer vanskeligt at indsamle nok prøver til at observere processen og udviklingsmekanismen. Metoden med ATC-læsioner kunne bedre observeres i murinmodellen. I fremtiden kan disse prøver give mere information til kliniske behandlinger.
En begrænsning af ultralydsbilleddannelse er, at ekkogeniciteten af ATC-tumorer kan ligne det omgivende væv og dermed skjule tumormargener, især i et stillbillede. Disse margener kan imidlertid identificeres ved hjælp af dynamisk kontrast, så dynamiske billeder blev gemt i denne undersøgelse til efterfølgende analyse. For at sikre de mest nøjagtige og pålidelige resultater skal sonden placeres på forskellige måder for at visualisere hele skjoldbruskkirtlen og tumoren fra forskellige vinkler. I denne undersøgelse udførte kun en ultrasonograf alle målingerne, så pålidelighedsmålinger mellem forskellige eksaminatorer blev ikke evalueret.
Denne protokol kan lette brugen af ultralyd med høj opløsning til lokalisering og måling af ATC-tumorer hos dyr og dermed bane vejen for detaljerede undersøgelser af kræftdebut, progression og behandling.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at erklære.
Acknowledgments
Denne forskning modtog ingen specifik bevilling fra offentlige, kommercielle eller non-profit finansieringsorganer.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Adhesive tape | Winner | ||
| Anesthesia system | RWDlifescience | ||
| Brafflox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Chamber for anesthesia induction | RWDlifescience | ||
| Cotton swabs | Winner | ||
| Depilatory cream | Veet | ||
| Electric heating blanket | Petbee | ||
| Isoflurane vaporizer | RWDlifescience | ||
| Medical gloves | Winner | ||
| Paper towels | Breeze | B914JY | |
| TPO-cre/ERT2 mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Trp53flox/wt mice | Collaboration with Institute of Life Science, eBond Pharmaceutical Technology Ltd, Chengdu, China | ||
| Ultrasound gel | Keppler | KL-250 | |
| Ultrasound machine | VisualSonics | Vevo 3100 |
References
- Maniakas, A., et al. Evaluation of overall survival in patients with anaplastic thyroid carcinoma, 2000-2019. JAMA Oncology. 6 (9), 1397-1404 (2020).
- Molinaro, E., et al. Anaplastic thyroid carcinoma: From clinicopathology to genetics and advanced therapies. Nature Reviews Endocrinology. 13 (11), 644-660 (2017).
- Champa, D., Di Cristofano, A. Modeling anaplastic thyroid carcinoma in the mouse. Hormones and Cancer. 6 (1), 37-44 (2015).
- Vitiello, M., Kusmic, C., Faita, F., Poliseno, L. Analysis of lymph node volume by ultra-high-frequency ultrasound imaging in the Braf/Pten genetically engineered mouse model of melanoma. Journal of Visualized Experiments. (175), e62527 (2021).
- Wang, Y., et al. Low intensity focused ultrasound (LIFU) triggered drug release from cetuximab-conjugated phase-changeable nanoparticles for precision theranostics against anaplastic thyroid carcinoma. Biomaterials Science. 27 (1), 196-210 (2018).
- Mohammed, A., et al. Early detection and prevention of pancreatic cancer: Use of genetically engineered mouse models and advanced imaging technologies. Current Medicinal Chemistry. 19 (22), 3701-3713 (2012).
- Wege, A. K., et al. High resolution ultrasound including elastography and contrast-enhanced ultrasound (CEUS) for early detection and characterization of liver lesions in the humanized tumor mouse model. Clinical Hemorheology and Microcirculation. 52 (2-4), 93-106 (2012).
- Greco, A., et al. Preclinical imaging for the study of mouse models of thyroid cancer. International Journal of Molecular Sciences. 18 (12), 2731 (2017).
- Renault, G., et al.
- McFadden, D. G., et al. p53 constrains progression to anaplastic thyroid carcinoma in a Braf-mutant mouse model of papillary thyroid cancer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (16), 1600-1609 (2014).
- Garassini, M.
- Aldrich, J. E.
- Mancini, M., et al. Morphological ultrasound microimaging of thyroid in living mice. Endocrinology. 150 (10), 4810-4815 (2009).
- Ying, M., Yung, D. M., Ho, K. K. Two-dimensional ultrasound measurement of thyroid gland volume: a new equation with higher correlation with 3-D ultrasound measurement. Ultrasound in Medicine & Biology. 34 (1), 56-63 (2008).
