Un método de homogeneización rápido, simple y estandarizado para preparar emulsiones de antígeno/adyuvante para inducir encefalomielitis autoinmune experimental

Resumen

Para inducir la encefalomielitis autoinmune experimental, un modelo animal de esclerosis múltiple, los ratones son inmunizados con una emulsión de agua en aceite que contiene un autoantígeno y un adyuvante completo de Freund. Si bien existen varios protocolos para la preparación de estas emulsiones, aquí se presenta un protocolo de homogeneización rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones.

Resumen

La encefalomielitis autoinmune experimental (EAE) comparte características inmunológicas y clínicas similares con la esclerosis múltiple (EM) y, por lo tanto, se usa ampliamente como modelo para identificar nuevos objetivos farmacológicos para un mejor tratamiento del paciente. La EM se caracteriza por varios cursos diferentes de la enfermedad: EM recurrente-remitente (EMRR), EM progresiva primaria (EMPP), EM progresiva secundaria (EMSP) y una forma rara de EM progresiva-recurrente (EMPR). Aunque los modelos animales no imitan con precisión todos estos fenotipos contrastantes de enfermedades humanas, existen modelos EAE que reflejan algunas de las diferentes manifestaciones clínicas de la EM. Por ejemplo, la EAE inducida por la glicoproteína oligodendrocitos de mielina (MOG) en ratones C57BL / 6J imita la EMPP humana, mientras que la EAE inducida por la proteína proteolípida de mielina (PLP) en ratones SJL / J se asemeja a RRMS. Otros autoantígenos, como la proteína básica de mielina (MBP), y una serie de cepas de ratón diferentes también se utilizan para estudiar la EAE. Para inducir la enfermedad en estos modelos EAE de autoinmunización con antígenos, se prepara una emulsión de agua en aceite y se inyecta por vía subcutánea. La mayoría de los modelos de EAE también requieren una inyección de toxina pertussis para que la enfermedad se desarrolle. Para una inducción EAE consistente y reproducible, es necesario un protocolo detallado para preparar los reactivos para producir emulsiones antígeno/adyuvantes. El método descrito aquí aprovecha un método estandarizado para generar emulsiones de agua en aceite. Es simple y rápido y utiliza un homogeneizador agitador en lugar de jeringas para preparar emulsiones de calidad controlada.

Introducción

Una ruptura de la tolerancia inmunológica puede resultar en la generación de trastornos autoinmunes, como la esclerosis múltiple (EM). Se estima que 2,8 millones de personas viven con EM en todo el mundo¹. Aunque la causa exacta de la EM es todavía en gran parte desconocida, la desregulación de las células T y B autorreactivas, así como los defectos en la función Treg, juegan un papel importante en la patogénesis de la enfermedad ^2,3.

Los modelos animales de enfermedades autoinmunes son herramientas esenciales para investigar posibles modalidades terapéuticas....

Protocolo

Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con las prácticas de la Junta Sueca de Investigación Animal y fueron aprobados por el Comité de Ética Animal, Lund-Malmö, Suecia (Número de permiso: M126-16).

NOTA: En la figura 1 se describe un flujo esquemático del método.

1. Preparación del material

NOTA: Preparar todos los reactivos asépticamente en una campana estéril, y alícuota y almacenar a la temperatura indicada. Los reactivos se pueden almacenar hasta 2 años sin perder su efecto.

1. Prepare CFA que contenga 20....

Resultados

El protocolo rápido, simple y estandarizado para la preparación de emulsiones CFA/MOG se muestra en la Figura 1. Este método ha sido descrito recientemente en otra parte⁶. Las emulsiones CFA/MOG también se pueden preparar con otros métodos, como el método tradicional de jeringa o por vórtice. Estos métodos se compararon aquí evaluando la calidad de las emulsiones. Todos los métodos produjeron emulsiones de agua en aceite; La homogeneidad y la calidad de estas emulsion.......

Discusión

Las emulsiones de agua en aceite, como el antígeno/adyuvante de Freund, se han utilizado durante más de medio siglo para inducir EAE¹⁷. Actualmente no existe un método estandarizado para preparar emulsiones de antígenos que sea independiente de la influencia humana. La mezcla manual con jeringas es estándar para la mayoría de los laboratorios, sin embargo, este método lleva mucho tiempo, a menudo resulta en una pérdida excesiva de material y la calidad difiere según el científico que lo prepara.

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
1 mL Jeringa inyectable	B. Braun	9166017V
1 mL Jeringa inyectable	Sigma-Aldrich Z683531
7 ml tubos vacíos con tapones	Bertin-Instruments	P000944LYSK0A.0	tubo de 7 mL
tubo de centrífuga estéril de 50 mL	Fisher Scientific	10788561	50 mL tubo
Bordetella pertussis toxina	Sigma-Aldrich	P2980	Almacene a -20 & grados; C
Dispersante, aceite mineral ligero	Sigma-Aldrich	M8410	Almacenar en RT
Kit de emulsión	Bertin-Instruments	D34200.10 ea	Contiene un tubo, una tapa y un émbolo
Adyuvante de Freund incompleto	Sigma-Aldrich	F5506	Tienda en +4 ° C
Mycobacterium tuberculosis, H37RA	Fisher Scientific	DF3114-33-8	Store en +4 ° C
Mastersizer 2000	Malvern	Panalytical N/A	Analizador de tamaño de partícula
Minilys-Homogeneizador personal	Bertin-Instruments	P000673-MLYS0-A	Homogeneizador
de agitación MOG 35-55 Péptido	Innovagen	N/A
Montanide ISA 51 VG	Seppic	36362Z	Adyuvante de aceite aprobado por la FDA
Filtros de jeringa Pall Acrodisc 0.2 μ m	Fisher Scientific	17124381	Filtro Sterlie
PBS, libre de Ca2+/Mg2+	Microscopio Fisher Scientific	14190144	PBS
Phase-Constrast	Olympus	BX40-B
Perlas de acero 3,2 mm	Fisher Scientific		NC0445832 Autoclave y almacén en RT
Triton X-100	Sigma-Aldrich	648463	Tienda en RT