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Uso de C. elegans para monitorear los desequilibrios de proteostasis

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DOI:

10.3791/64643

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24 de agosto de 2022

 , 
1Department of Biology, Northeastern Illinois University, 2Department of Anatomy II, Faculty of Medicine, Ludwig-Maximilians-University of Munich

En este artículo

Resumen

La red de proteostasis es un sistema de control de calidad de proteínas celulares que garantiza la funcionalidad del proteoma, promoviendo la salud celular y del organismo. Con la edad, su fidelidad disminuye, lo que lleva a una mayor vulnerabilidad del proteoma al estrés y, finalmente, a enfermedades como trastornos neurodegenerativos y cáncer. Para destacar la investigación sobre esta red evolutivamente conservada, el Journal of Visualized Experiments (JoVE) presenta una colección de métodos de investigadores que utilizan C. elegans para monitorear los desequilibrios de proteostasis. Este editorial proporciona una breve descripción de estos diferentes enfoques experimentales para comprender la red de proteostasis a nivel celular, tisular y del organismo.

ARTÍCULOS DISCUTIDOS:

Golden, N. L., Plagens, R. N., Kim Guisbert, K. S., Guisbert, E. Métodos estandarizados para medir la inducción de la respuesta al choque térmico en Caenorhabditis elegans. Revista de experimentos visualizados. (161), doi:10.3791/61030 (2020).

Chauve, L. et al. RT-PCR cuantitativa de alto rendimiento en muestras de C. elegans individuales y a granel utilizando tecnología nanofluídica. Revista de experimentos visualizados. (159), doi:10.3791/61132 (2020).

Bar-Ziv, R. et al. Mediciones de respuestas fisiológicas al estrés en C. Elegans. Revista de experimentos visualizados. (159), doi:10.3791/61001 (2020).

Okkenhaug, H., Chauve, L., Masoudzadeh, F., Okkenhaug, L., Casanueva, O. Worm-align y Worm_CP, dos tuberías de código abierto para enderezar y cuantificar datos de imágenes de fluorescencia obtenidos de Caenorhabditis elegans. Revista de experimentos visualizados. (159), doi:10.3791/61136 (2020).

Lázaro-Pena, M. I., Cornwell, A. B., Samuelson, A. V. Cuantificación de la disminución proteostática específica de tejido en Caenorhabditis elegans. Revista de experimentos visualizados. (175), doi:10.3791/61100 (2021).

Dror, S., Meidan, T. D., Karady, I., Ben-Zvi, A. Uso de Caenorhabditis elegans para detectar interacciones de chaperonas específicas de tejidos. Revista de experimentos visualizados. (160), doi:10.3791/61140 (2020).

Miles, J., van Oosten-Hawle, P. Herramientas de ARNi específicas de tejido para identificar componentes para la señalización de estrés sistémico. Revista de experimentos visualizados. (159), doi:10.3791/61357 (2020).

Pigazzini, M. L., Kirstein, J. Cuantificación in vivo del recambio proteico en C. elegans en envejecimiento utilizando dendra2 fotoconvertible. Revista de experimentos visualizados. (160), doi:10.3791/61196 (2020).

Pigazzini, M. L., Gallrein, C., Iburg, M., Kaminski Schierle, G., Kirstein, J. Caracterización de estructuras amiloides en C. elegans envejecidos mediante imágenes de fluorescencia de por vida. Revista de experimentos visualizados. (157), doi:10.3791/61004 (2020).

Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Medición de la toxicidad del péptido RAN en C. elegans. Revista de experimentos visualizados. (158), doi:10.3791/61024 (2020).

Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Enfoques cuantitativos para puntuar el agregado neuronal in vivo y la extrusión de orgánulos en grandes vesículas exóferes en C. elegans. Revista de experimentos visualizados. (163), doi:10.3791/61368 (2020).

Editorial

La homeostasis de las proteínas, o proteostasis, es fundamental para la salud celular y del organismo 1,2. Los procesos celulares conservados cooperan para mantener un proteoma correctamente plegado al influir en la síntesis, el plegamiento y la eliminación de proteínas 3,4. Las perturbaciones en la proteostasis se han relacionado con enfermedades neurodegenerativas y cánceres relacionados con la edad 5,6. Con base en el alto nivel de conservación, los organismos modelo como el nematodo Caenorhabditis elegans (C. elegans) han sido fundamentales para comprender el papel de la proteostasis en la salud y la enfermedad humanas 7,8. C. elegans posee muchas características que lo convierten en un modelo experimental ideal, incluido su corto ciclo de vida, cutícula transparente y facilidad de manipulaciones químicas y genéticas9. Esta colección de métodos proporciona protocolos detallados para monitorear los desequilibrios de proteostasis a nivel molecular, celular y del organismo en C. elegans.

Las células responden a las interrupciones en la proteostasis activando una variedad de respuestas al estrés, incluida la respuesta al choque térmico (HSR), la respuesta de proteína desplegada (UPR) y la respuesta al estrés oxidativo (OxSR) para reajustar el proteoma celular10. Para mejorar la reproducibilidad en el campo, Golden y sus colegas describen prácticas estandarizadas para la inducción robusta de HSR11. La RT-qPCR es un método sensible ampliamente utilizado para analizar la expresión génica mediante la cuantificación del ARNm, y este ensayo se puede utilizar para medir los niveles de ARNm celular de varios genes inducibles por choque térmico11. Para extender este enfoque al análisis a gran escala y de alto rendimiento, Chauve et al.12 describen una nueva adaptación para la preparación de ADNc, acoplada a una plataforma nanofluídica de RT-qPCR que es robusta y altamente sensible. Se pueden realizar mediciones precisas de la expresión génica en gusanos individuales o muestras a granel12. Los objetivos genéticos de respuesta al estrés recomendados junto con los pares de cebadores para medir la regulación transcripcional de los genes de respuesta al estrés se enumeran en los protocolos correspondientes12,13.

Una limitación del uso de RT-qPCR para evaluar la activación de las respuestas al estrés es que puede ser costoso, técnicamente difícil y requiere el uso de equipos especializados. Por lo tanto, las cepas reporteras transcripcionales específicas de la vía que expresan una proteína fluorescente bajo un promotor inducible por estrés (p. ej., hsp-16.2p::gfp para monitorear HSR) se emplean con frecuencia para evaluar las respuestas al estrés celular11. Utilizando un flujo de trabajo simple de código abierto basado en Fiji llamado Worm-align junto con la canalización CellProfiler Worm_CP, Okkenhaug y sus colegas describen14 pasos para cuantificar rápidamente la fluorescencia de gusanos individuales. Además, Bar-Ziv et al.13 describen un método de alto rendimiento utilizando un citómetro de flujo de partículas grandes que permite capturar la intensidad de la fluorescencia, el tamaño y la distribución espacial (2D) para miles de animales. Se proporciona información sobre los reporteros transcripcionales para evaluar la activación de las respuestas al estrés celular junto con los ajustes recomendados para la microscopía de fluorescencia y la cuantificación utilizando un bioclasificador de gusanos13. Es importante destacar que estos reporteros se pueden combinar con ensayos de supervivencia al estrés fisiológico específicos que monitorean la salud de un animal después de un régimen de estrés específico11,13. Aunque los reporteros fluorescentes tienen la ventaja de revelar diferencias específicas de tejido, solo pueden detectar la inducción por encima de un cierto umbral y la estabilidad de ciertos fluoróforos, como GFP, impide la detección de variaciones dinámicas en la expresión génica. Además, la mayoría de los ensayos fisiológicos requieren mucho tiempo y, por lo tanto, tienen una escalabilidad limitada. A pesar de estas limitaciones, estos métodos permiten una caracterización completa de los efectos celulares y fisiológicos de los factores estresantes internos y externos.

Las perturbaciones proteotóxicas crónicas se asocian con el colapso de la red de proteostasis (NP), la maquinaria de control de calidad responsable de mantener un proteoma funcional 5,6. La disminución progresiva de la proteostasis se ha implicado en muchas enfermedades relacionadas con la edad. C. elegans es un gran sistema modelo para examinar la vulnerabilidad de tejidos específicos a fallas de proteostasis. Lázaro-Peña et al.15 describen un enfoque para monitorear la pared corporal, el músculo o la funcionalidad neuronal a medida que el gusano envejece. Este enfoque puede adaptarse para un análisis genético de mayor rendimiento o un cribado de fármacos15. El principal desafío es comprender cómo funcionan las interacciones entre los diversos componentes de la PN in vivo. Para abordar esta deficiencia, Dror y sus colegas16 han desarrollado un sistema para recopilar información específica sobre las interacciones de las chaperonas moleculares, componentes clave de la NP, en tejidos específicos durante el curso del desarrollo y el envejecimiento. Al acoplar perturbaciones específicas de tejido de equilibrio de plegamiento con mutantes disponibles o cepas transgénicas que permiten el silenciamiento específico del tejido de genes diana por ARNi, se puede examinar la red de chaperonas en un tejido dado. Complementar esta estrategia con ensayos conductuales simples que evalúan la funcionalidad de tejidos o tipos de células específicos puede descubrir interacciones biológicamente relevantes de la NP in vivo15,16. Es importante reconocer que los desequilibrios de proteostasis en un tejido o tipo de célula pueden afectar el sistema de control de calidad de tejidos adicionales de una manera celular no autónoma. Miles y van-Oosten-Hawle17 describen un enfoque para identificar mecanismos y componentes de la PN no autónoma de células utilizando enfoques de ARNi específicos de tejidos junto con una variedad de reporteros de estrés y sensores de proteostasis17. Esta estrategia permite examinar la capacidad de NP en diferentes tejidos como resultado de los mecanismos de respuesta al estrés activados por células no autónomas.

C. elegans se usa comúnmente para modelar enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad causadas por mutaciones de expansión repetida de poliglutamina, como la enfermedad de Huntington18. Un sensor de proteostasis que se utiliza mucho es un fragmento de poliglutamina (polyQ) fusionado con una proteína fluorescente que forma focos in vivo dependiendo de la longitud de polyQ y la edadde 19 años. Mejorar la reproducibilidad entre ensayos biológicos, entre individuos y entre laboratorios, requiere definir lo que se califica como focos. Lázaro-Peña et al.15 describen una estrategia para medir con precisión la formación de focos poliQ::YFP dentro de las neuronas o los músculos de la pared corporal durante el envejecimiento. Para monitorear las tasas de recambio de la proteína huntingtina mutante propensa a la agregación que lleva una expansión de poliglutamina, Pigazzini y Kirstein20 describen una técnica no invasiva que requiere el uso del fluoróforo fotoconvertible Dendra2. Utilizando microscopía confocal y una cepa de C. elegans que expresa huntingtina mutante fusionada con Dendra2, es posible monitorear y cuantificar la degradación de esta proteína propensa a la agregación en un organismo envejecido20. Para cuantificar la fibrilación amiloide de proteínas propensas a la agregación, como la huntingtina mutante, se puede emplear microscopía de imágenes de fluorescencia de por vida (FLIM)21. FLIM permite el análisis no invasivo del proceso de agregación mediante el monitoreo de la extinción de fluoróforos en las proximidades de las estructuras amiloides, lo que disminuye la vida útil de la fluorescencia21. El tiempo de vida de la fluorescencia se correlaciona negativamente con la agregación de la proteína amiloide fusionada y es independiente de los niveles de expresión de fluoróforos. Esta técnica permite a un investigador seguir los efectos del envejecimiento y el deterioro de la NP en la propensión a la agregación de cualquier proteína. Sin embargo, si la intensidad del fluoróforo es baja, esto puede volverse problemático ya que FLIM requiere la adquisición de un número relativamente grande de fotones. Por lo tanto, se necesita una mayor potencia del láser de excitación, lo que lleva a un fotoblanqueo más rápido y una curva de decaimiento poco fiable. Además, la técnica requiere equipos sofisticados y costosos como complemento de los sistemas de microscopía preexistentes. Se incluye un enfoque estandarizado importante para un protocolo diferente que investiga la traducción no dependiente de AUG (RAN) asociada a repeticiones asociada con ARN que contiene expansiones repetidas. Debido a que la traducción de RAN no requiere un codón de inicio para determinar el marco de lectura, aumenta el número de posibles péptidos tóxicos asociados a la enfermedad. Rudich y sus colegas22 proporcionan detalles sobre cómo cuantificar la toxicidad del péptido RAN utilizando el movimiento y la reproducción de C. elegans.

Los desequilibrios en la proteostasis conducen al plegamiento incorrecto de proteínas y a la acumulación de agregados proteicos que se han relacionado con múltiples enfermedades neurodegenerativas relacionadas con la edad 5,6. Las cepas de C. elegans que expresan varias proteínas propensas a la agregación fusionadas con reporteros fluorescentes se han utilizado para monitorear los desequilibrios de proteostasis en diferentes tipos de células y tejidos. El análisis de estos modelos ha dado lugar a un conjunto de observaciones novedosas; Monica Driscoll y sus colegas notaron que las neuronas liberan agregados PolyQ y otros desechos celulares, como orgánulos dañados, en "exófagos", descubriendo una rama previamente no reconocida de la proteostasis neuronal23. Dado que se trata de un fenómeno nuevo, es crucial proporcionar instrucciones claras para monitorear la producción de exopher para garantizar la reproducibilidad dentro del campo. Arnold et al.24 describen las características físicas de los exófagos de C. elegans, las estrategias para su detección, los criterios de identificación y el momento óptimo para la cuantificación. Además, este protocolo destaca la atención crítica necesaria para controlar estrictamente las condiciones de crecimiento para eliminar las tensiones no deseadas que pueden modular los niveles de exopher para lograr una evaluación reproducible de la producción de exopher.

Esta colección proporciona múltiples estrategias metodológicas para monitorear los desequilibrios de proteostasis a nivel molecular, celular y orgánico en C. elegans. Los factores estresantes, como las proteínas de la enfermedad mal plegadas, se pueden introducir experimentalmente en tipos específicos de tejidos, mientras que la respuesta celular y del organismo a la proteotoxicidad se monitorea a lo largo del tiempo. Esta colección proporciona un conjunto de herramientas para sondear y monitorear la proteostasis, evaluar los sistemas de control de calidad que mantienen un proteoma plegado e investigar la desregulación de estos sistemas que conducen a la enfermedad.

Divulgaciones

Los autores no tienen nada que revelar.

Agradecimientos

Agradecemos a nuestros colegas por sus valiosas contribuciones a esta recopilación de métodos.

Referencias

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  22. Rudich, P., Snoznik, C., Puleo, N., Lamitina, T. Measuring RAN peptide toxicity in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (158), e61024(2020).
  23. Melentijevic, I., et al. C. elegans neurons jettison protein aggregates and mitochondria under neurotoxic stress. Nature. 542 (7641), 367-371 (2017).
  24. Arnold, M. L., Cooper, J., Grant, B. D., Driscoll, M. Quantitative approaches for scoring in vivo neuronal aggregate and organelle extrusion in large exopher vesicles in C. elegans. Journal of Visualized Experiments. (163), e61368(2020).

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