Cultivo tridimensional de tejido adiposo termogénico vascularizado a partir de fragmentos microvasculares

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo detallado que describe el uso de fragmentos microvasculares aislados de tejido graso humano o de roedores como un enfoque directo para diseñar tejido adiposo beige vascularizado funcional.

Resumen

La ingeniería de tejido adiposo termogénico (por ejemplo, tejidos adiposos beige o marrones) se ha investigado como una terapia potencial para enfermedades metabólicas o para el diseño de microtejidos personalizados para la detección de la salud y las pruebas de drogas. Las estrategias actuales son a menudo bastante complejas y no logran representar con precisión las propiedades multicelulares y funcionales del tejido adiposo termogénico. Los fragmentos microvasculares, pequeños microvasos intactos compuestos por arteriolas, vénulas y capilares aislados del tejido adiposo, sirven como una única fuente autóloga de células que permiten la vascularización y la formación de tejido adiposo. Este artículo describe métodos para optimizar las condiciones de cultivo para permitir la generación de tejidos adiposos termogénicos tridimensionales, vascularizados y funcionales a partir de fragmentos microvasculares, incluidos los protocolos para aislar fragmentos microvasculares del tejido adiposo y las condiciones de cultivo. Además, se discuten las mejores prácticas, al igual que las técnicas para caracterizar los tejidos diseñados, y se proporcionan resultados de muestras de fragmentos microvasculares humanos y de roedores. Este enfoque tiene el potencial de ser utilizado para la comprensión y el desarrollo de tratamientos para la obesidad y las enfermedades metabólicas.

Introducción

El objetivo de este protocolo es describir un enfoque para desarrollar tejido adiposo beige vascularizado a partir de una sola fuente potencialmente autóloga, fragmento microvascular (MVF). Se ha demostrado que los tejidos adiposos marrones y beige muestran propiedades beneficiosas relacionadas con la regulación metabólica; Sin embargo, el pequeño volumen de estos depósitos de tejido adiposo en adultos limita el impacto potencial sobre el metabolismo sistémico, particularmente en condiciones enfermas como la obesidad o la diabetes tipo 2 1,2,3,4,5,6,7.

Protocolo

Este estudio se realizó de conformidad con la Ley de Bienestar Animal y el Reglamento de Bienestar Animal de Implementación de acuerdo con los principios de la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio. Todos los procedimientos con animales fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Texas en San Antonio.

NOTA: Para los pasos descritos a continuación, se utilizan ratas Lewis macho. Se deben realizar ligeros ajustes de protocolo para una hembra, así como para la colección de fragmentos microvasculares de ratón (MFV)²⁹. Para los protocolos que utilizan MVF ....

Resultados

Hay algunas características morfológicas fenotípicas clave del tejido adiposo beige / marrón: es multilocular / contiene pequeñas gotas de lípidos, posee una gran cantidad de mitocondrias (la razón de su apariencia característicamente "pardusca" in vivo), tiene una alta tasa de consumo de oxígeno / bioenergética mitocondrial, está altamente vascularizada, ha aumentado la lipólisis / absorción de glucosa estimulada por la insulina y, lo más notorio, expresa altos niveles de proteína de desacoplamiento 1 (UCP1), .......

Discusión

El campo de la ingeniería de tejidos adiposos marrones/beige es en gran medida inmaduro 22,23,24,25,26,27,28, con la mayor parte de los modelos adiposos desarrollados para el tejido adiposo blanco ^{8,22,31.......}

Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo

Nombre	Empresa	Número de catálogo	Comentarios
Ácido aminocaproico	Sigma Aldrich	A2504-100G	Añadido en DMEM a la concentración de 1 mg/mL
Tijeras de punta roma	Fisher scientific	12-000-172	Esterilizar en autoclave
Bovin Albúmina sérica (BSA)	Millipore	126575-10GM	Diluido en PBS a 4 mg/mL y 1 mg/mL
Colagenasa tipo 1	Fisher scientific	NC9633623	Diluido a 6 mg/mL en BSA 4 mg/mL, Digestión de grasa picada
Dexametasona	Thermo Scientific	AC230302500	Diluido en etanol a una concentración de 2 mg/ml
Almohadillas desechables	Fisher scientific	23-666-062	Para la absorción de líquidos durante la cirugía
Tijeras de disección	Fisher scientific	08-951-5	Esterilizar en autoclave
Dulbecco′ s Eagle&prime modificado; s Medio (DMEM)	Fisher científico	11885092
Dulbecco′ s Eagle&prime modificado; s Mezcla Medio/Nutriente F-12 Jamón (DMEM/F12)	Sigma Aldrich	D8062
Suero Fetal Bovino	Fisher Scientific	16140089	Añadido en DMEM al 20% v/v.
Fibrinógeno	Sigma Aldrich	F8630-25G	Solubilizado en DMEM a la concentración de 20 mg/mL, Proteína que se encuentra en el plasma sanguíneo y componente principal del hidrogel
Matraz, 250 mL	Fisher scientific	FB500250	Permite la digestión de la grasa utilizando una gran superficie
Pinza Fisher	scientific	50-264-21	Esterilizar en autoclave, Para la manipulación de tejidos y filtros
Forskolin	Sigma Aldrich	F6886	Diluido en etanol a una concentración de stock de 10 mM
MVF	Soluciones Avanzadas de Humano Life Scienes, LLC	https://www.advancedsolutions.com/microvessels	MVF humanos (hMVF) aislados de tres pacientes diferentes (mujeres de 52, 54 y 56 años).
Indometacina	Sigma Aldrich	I7378	Diluido en etanol a una concentración de stock de 12,5 mM
Insulina de páncreas porcino	Sigma Aldrich	I5523	Diluido en HCl de 0,01 N a una concentración de stock de 5 mg/ml
MycoZap	Fisher scientific	NC9023832	Añadido en DMEM al 0,2% p/v, Mycoplasma Prophylactic
Polecilina/estreptomicina (10,000 U/mL)	Fisher Scientific	15140122	Añadido en DMEM al 1% v/v.
Placas de Petri, poliestireno (100 mm x 15 mm).	Fisher scientific	351029	3 para la extracción de vasos sanguíneos y picado, 8 (tapa) para el remojo previo de las pantallas y 8 (plato) para usar cuando se filtra con 500 o 37 µ Pantallas M Placas de
Petri, poliestireno (35 mm x 10 mm).	Fisher scientific	50-202-036	Para contar fragmentos
Tampón de fosfato solución salina (PBS)	Fisher scientific	14-190-250	Diluido a 1x con agua desionizada estéril.
Cortaratas (Andwin Mini Arco Pet Trimmer)	Fisher scientific	NC0854141
Rosiglitazona	Fisher scientific R0106200MG		Diluido en DMSO a una concentración de 10 mM
Tijeras	Fine Science Tools	14059-11	1 para incisión inicial, 1 para incisión epididimaria, 1 para recorte de punta
Pantalla  37 µ M	Carolina Biological Supply Company	652222R	Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, atrapamiento de fragmentos y eliminación de fragmentos muy pequeños/células individuales y escombros
Screen 500 µ M	Carolina Biological Supply Company	652222F	Cortado en cuadrados redondeados de 3" y esterilizado en óxido de etileno, Elimina fragmentos / desechos más grandes
Hemostático dentado	Fisher scientific	12-000-171	Esterilizar en autoclave, Para el pinzamiento de la piel antes de la incisión
Filtro Steriflip 0.22 μ m	Millipore	SE1M179M6
Trombina	Fisher scientific	6051601KU	Diluido en agua desionizada a 10 U/mL, utilizado como agente de coagulación convirtiendo el fibrinógeno en fibrina
Hormona tiroidea (T3)	Sigma Aldrich	T2877	Diluido en NaOH 1N a una concentración de stock de 0,02 mM
Zucker ratas diabéticas grasas (ZDF) - obesas (FA/FA) o magras (FA/+) machos	Charles River	https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-lean-fa?region=3611 https://www.criver.com/products-services/find-model/zdf-rat-obese?region=3611	Obtenido de Charles River (Wilmington, MA). Las ratas fueron adquiridas a las 4 semanas de edad y alimentadas con Purina 5008 hasta la eutanasia (15-19 semanas de edad). Los niveles de glucosa (sangre de la vena safena lateral) fueron superiores a 300 mg/dL en todas las ratas FA/FA utilizadas en el estudio. Todos los animales fueron alojados en un ambiente de temperatura controlada con un ciclo de luz-oscuridad de 12 horas y alimentados ad libitum.

En el presente estudio se utilizaron