El presente protocolo combina la estimulación ex vivo y la citometría de flujo para analizar los perfiles de células T polifuncionales (T PF) en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en niños vacunados contra el virus de la encefalitis japonesa (JEV). El método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de los TPF específicos de JEV se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Se requiere una suscripción a JoVE para ver este contenido. Inicie sesión o comience su prueba gratuita.
Artículo de método
Detección de células T polifuncionales en niños vacunados con la vacuna contra la encefalitis japonesa mediante la técnica de citometría de flujo
* These authors contributed equally
En este artículo
Resumen
Resumen
La inmunidad mediada por células T juega un papel importante en el control de la infección por flavivirus, ya sea después de la vacunación o después de una infección natural. La "calidad" de una célula T debe evaluarse por función, y una mayor función se asocia con una protección inmune más potente. Las células T que pueden producir simultáneamente dos o más citoquinas o quimiocinas a nivel de una sola célula se denominan células T polifuncionales (TPFs), que median las respuestas inmunes a través de una variedad de mecanismos moleculares para expresar marcadores de desgranulación (CD107a) y secretar interferón (IFN)-γ, factor de necrosis tumoral (TNF)-α, interleucina (IL)-2 o proteína inflamatoria de macrófagos (MIP)-1α. Cada vez hay más pruebas de que losPFT están estrechamente relacionados con el mantenimiento de la memoria y la protección inmunitaria a largo plazo y que su mayor proporción es un marcador importante de inmunidad protectora y es importante en el control efectivo de la infección viral y la reactivación. Esta evaluación se aplica no solo a respuestas inmunes específicas, sino también a la evaluación de respuestas inmunes de reacción cruzada. Aquí, tomando el virus de la encefalitis japonesa (JEV) como ejemplo, el método de detección y el esquema de color de citometría de flujo de TPFespecíficos de JEV producidos por células mononucleares de sangre periférica de niños vacunados contra la encefalitis japonesa se probaron para proporcionar una referencia para estudios similares.
Introducción
El virus de la encefalitis japonesa (JEV) es un importante virus transmitido por mosquitos perteneciente al género Flavivirus dentro de la familia Flaviviridae1. Muchos países de Asia y el Pacífico han enfrentado durante mucho tiempo enormes desafíos de salud pública debido a la enorme carga de enfermedad causada por la encefalitis japonesa (EJ), pero esto ha mejorado dramáticamente con la creciente disponibilidad de varios tipos de vacunas2. Las respuestas inmunes protectoras adaptativas evocadas por la infección natural o la vacunación contribuyen a la prevención y la regulación antiviral. La inmunidad humoral....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Protocolo
La aprobación ética para el presente estudio fue obtenida por el Comité de Ética del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital (Número de aprobación: 2020-k-85). Los voluntarios fueron reclutados del Hospital de Niños de Beijing, Universidad Médica Capital. Se obtuvieron muestras de sangre venosa periférica de niños aparentemente sanos (2 años de edad) que habían recibido previamente una vacuna principal y potenciada con la vacuna JE SA14-14-2 viva atenuada durante menos de medio año (niños vacunados con JE, n = 5) y niños no vacunados (6 meses de edad, n = 5). El consentimiento informado de los sujetos humanos no se aplicó ya que sólo las muestras resi....
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Resultados
La Figura 1 muestra la estrategia de activación utilizada para dividirla CM T ola EM T de las células T CD8+ o CD4+ de un grupo representativo de estimulación JEV de niños vacunados con JE. El diagrama de puntos FSC-A/SSC-A se utiliza para identificar linfocitos, y el diagrama de puntos FSC-A/FSC-W se utiliza para identificar células individuales. Las células viables se seleccionan en el diagrama de puntos vivo/muerto/SSC-A. El diagrama de puntos C.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Discusión
Este protocolo representa un método de detección factible basado en citometría de flujo para perfiles deT PF en las PBMC de niños vacunados con la vacuna JEV SA14-14-2. Este estudio utilizó las PBMC de sangre venosa de niños vacunados y no vacunados como materiales de investigación. Con la estimulación de PBMC con el antígeno JEV, esos antígenosT PFespecíficos amplificados pueden caracterizarse por tinción de anticuerpos de citometría de flujo multicolor. En comparación con el método convencional de.......
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Divulgaciones
Los autores no tienen nada que revelar.
Agradecimientos
R.W. fue apoyado por la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (82002130), la Fundación de Ciencias Naturales de Beijing de China (7222059). ZD.X. fue apoyado por el Fondo de Innovación CAMS para Ciencias Médicas (2019-I2M-5-026).
....Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Materiales
| Nombre | Empresa | Número de catálogo | Comentarios |
|---|---|---|---|
| anti-humano CD28 | Biolegend | 302934 | Anticuerpo |
| anti-humano CD49d | Biolegend | 304339 | Anticuerpo |
| APC anti-humano MIP-1α | BD | 551533 | Anticuerpo fluorescente |
| Contador de células | automatizado BIO RAD | TC20 | Recuento de células |
| BD FACSifónico A5 | BD | A5 | Citometría de flujo |
| BUV395 anti-humano CD4 | BD | 563550 | Anticuerpo fluorescente |
| BUV737 anti-humano CCR7 | BD 741786 | anticuerpo fluorescente | |
| BUV737 anti-humano CD27 | BD | 612829 anticuerpo fluorescente | |
| BV421 anti-humano CD8 | Biolegend | 344748 | Anticuerpo fluorescente |
| BV480 anti-humano CD45RA | BD 566114 | anticuerpo fluorescente | |
| BV480 anti-humano CD45RO | BD | 566143 | anticuerpo fluorescente |
| BV605 anti-humano CD107a | Biolegend | 328634 | Anticuerpo fluorescente |
| BV650 anti-humano CD3 | BD | 563999 | Anticuerpo fluorescente |
| BV785 anti-humano IL-2 | Biolegend | 500348 | Anticuerpo fluorescente |
| Tubo de centrífuga | BD Falcon | BD-35209715 | Tubo de centrífuga de 15 mL |
| Kit de solución de fijación/permeabilización Cytofix/Cytoperm | BD | 554714 | Fijación y permeabilización |
| gradiente de densidad | Dakewe | DKW-KLSH-0100 | Ficoll-Paque, medio de separación de linfocitos humanos |
| FITC anti-IFN-y gamma humano; | Biolegend | 502506 | Anticuerpo fluorescente |
| Suero fetal bovino Gibco | Thermo Fisher Scientific | 16000-044 | Suero fetal bovino |
| Gibco RPMI-1640 medio | Thermo Fisher Scientific | 22400089 | medio de cultivo |
| celular Alta velocidad centrífuga | Sigma | Centrifugación de celdas 3K15 | para tubo de centrífuga de 15 mL |
| de alta velocidad centrífuga | Eppendorf | 5424R | Centrifugación celular para tubo Eppendorf (EP) de 1,5 mL |
| Tubos de microcentrífuga | Axygen | MCT-150-C tubo de | microcentrífuga de 1,5 mL |
| PE antihumano TNF-α | Biolegend | 502909 | Anticuerpo fluorescente |
| Solución salina tamponada con fosfato (PBS) | BI | 02-024-1ACS | |
| Inhibidor del transporte de proteínas PBS (que contiene brefeldina A, GolgiPlug) | BD | 555029 | bloquea los procesos de transporte intracelular |
| de proteínas Inhibidor del transporte de proteínas (que contiene monensina) | BD | 554724 | bloquea los procesos de transporte de proteínas intracelulares |
| Tubo de ensayo de fondo redondo | BD Falcon | 352235 | Tubo de ensayo de 5 mL |
| Kit de ensayo de viabilidad celular de tinción con azul de tripano | Beyotime | C0011 | Tinción con azul de tripano |
| Colorante de viabilidad NIR | Zombie Biolegend | 423106 | Tinción de células muertas |
Referencias
- Vanden Eynde, C., Sohier, C., Matthijs, S., De Regge, N. Japanese encephalitis virus interaction with mosquitoes: A review of vector competence, vector capacity and mosquito immunity. Pathogens. 11 (3), 317(2022).
- Wang, R., et al.
Acceso restringido. Inicie sesión o comience una prueba gratuita para ver este contenido.
Reimpresiones y permisos
