Modelado del carcinoma de células escamosas oral-esofágico en organoides 3D

Samuel Flashner; Cecilia Martin; Norihiro Matsuura; Masataka Shimonosono; Yasuto Tomita; Masaki Morimoto; Ogoegbunam Okolo; Victoria X. Yu; Anuraag S. Parikh; Andres J. P. Klein-Szanto; Kelley Yan; Joel T. Gabre; Chao Lu; Fatemeh Momen-Heravi; Anil K. Rustgi; Hiroshi Nakagawa

doi:10.3791/64676

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Artículo de método

Modelado del carcinoma de células escamosas oral-esofágico en organoides 3D

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DOI:

10.3791/64676

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23 de diciembre de 2022

Samuel Flashner^*¹ , Cecilia Martin^*¹^,² , Norihiro Matsuura¹ , Masataka Shimonosono¹ , Yasuto Tomita¹ , Masaki Morimoto¹ , Ogoegbunam Okolo¹ , Victoria X. Yu¹^,³ , Anuraag S. Parikh¹^,³ , Andres J. P. Klein-Szanto⁴ , Kelley Yan¹^,² , Joel T. Gabre¹^,⁵ , Chao Lu¹^,⁶ , Fatemeh Momen-Heravi¹^,⁷ , Anil K. Rustgi¹^,⁵ , Hiroshi Nakagawa¹^,²^,⁵

¹Herbert Irving Comprehensive Cancer Center, Columbia University, ²Organoid and Cell Culture Core, Columbia University Digestive and Liver Diseases Research Center, Columbia University, ³Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Columbia University, ⁴Histopathology Facility, Fox Chase Cancer Center, ⁵Division of Digestive and Liver Diseases, Department of Medicine, Columbia University, ⁶Department of Genetics and Development, Columbia University, ⁷Section of Oral, Diagnostic and Rehabilitation Sciences, College of Dental Medicine, Columbia University

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Este protocolo describe los pasos clave para generar y caracterizar organoides 3D oralesesofágicos murinos que representan lesiones de carcinoma de células escamosas normales, preneoplásicas y escamosas inducidas a través de carcinogénesis química.

Resumen

El carcinoma de células escamosas de esófago (ESCC) es prevalente en todo el mundo, representa el 90% de todos los casos de cáncer de esófago cada año, y es el más mortal de todos los carcinomas de células escamosas humanas. A pesar del progreso reciente en la definición de los cambios moleculares que acompañan al inicio y desarrollo de ESCC, el pronóstico del paciente sigue siendo malo. La anotación funcional de estos cambios moleculares es el siguiente paso necesario y requiere modelos que capturen las características moleculares de ESCC y puedan manipularse de manera fácil y económica para la anotación funcional. Los ratones tratados con el humo de tabaco mimético 4-nitroquinolina 1-óxido (4NQO) forman previsiblemente ESCC y preneoplasia esofágica. Cabe destacar que las lesiones 4NQO también surgen en la cavidad oral, más comúnmente en la lengua, así como en el estómago anterior, que comparten el epitelio escamoso estratificado. Sin embargo, estos ratones no pueden ser simplemente manipulados para pruebas de hipótesis funcionales, ya que la generación de modelos de ratón isogénicos requiere mucho tiempo y recursos. Aquí, superamos esta limitación mediante la generación de organoides tridimensionales (3D) derivados de células individuales de ratones tratados con 4NQO para caracterizar ESCC murino o células preneoplásicas ex vivo. Estos organoides capturan las características sobresalientes de ESCC y preneoplasia esofágica, pueden aprovecharse de manera económica y rápida para formar modelos isogénicos y pueden utilizarse para experimentos de trasplante singénico. Demostramos cómo generar organoides 3D a partir de tejido esofágico murino normal, preneoplásico y SCC y mantener y criopreservar estos organoides. Las aplicaciones de estos organoides versátiles son amplias e incluyen la utilización de ratones genéticamente modificados y una mayor caracterización por citometría de flujo o inmunohistoquímica, la generación de líneas organoides isogénicas utilizando tecnologías CRISPR y la detección de fármacos o el trasplante singénico. Creemos que la adopción generalizada de las técnicas demostradas en este protocolo acelerará el progreso en este campo para combatir la grave carga de ESCC.

Introducción

El carcinoma de células escamosas de esófago (CCE) es el más mortal de los carcinomas de células escamosas humanas, debido a su diagnóstico tardío, resistencia al tratamiento y metástasis ^1,2. ESCC surge del epitelio escamoso estratificado, que recubre la superficie luminal del esófago. El epitelio escamoso está compuesto por células basales proliferativas y células diferenciadas dentro de la capa de células suprabasales. En condiciones fisiológicas, las células basales expresan marcadores como p63, Sox2 y citoqueratina K5 y K14, mientras que las células diferenciadas expresan K4, K13 e IVL. Las células basale....