Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

Luis Espejo; Bradford Hull; Leah M. Chang; Destiny DeNicola; Samuel Freitas; Vanessa Silbar; Anne Haskins; Emily A. Turner; George  L. Sutphin

doi:10.3791/64682

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Artículo de método

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

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DOI:

10.3791/64682

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2 de diciembre de 2022

Luis Espejo^*¹ , Bradford Hull^*¹ , Leah M. Chang¹ , Destiny DeNicola¹ , Samuel Freitas¹ , Vanessa Silbar¹ , Anne Haskins¹ , Emily A. Turner¹ , George L. Sutphin¹

¹Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

^* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos para el seguimiento de parámetros fisiológicos de por vida y la cuantificación de fluorescencia. Este sistema de cultivo incluye una barrera de ácido palmítico alrededor de pozos de un solo gusano para evitar que los animales huyan, lo que permite el uso de intervenciones aversivas, incluidas bacterias patógenas y estresores químicos.

Resumen

Caenorhabditis elegans son ampliamente utilizados para estudiar la biología del envejecimiento. La práctica estándar en los estudios de envejecimiento de C. elegans es cultivar grupos de gusanos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM), lo que permite la recopilación eficiente de datos a nivel poblacional para la supervivencia y otros fenotipos fisiológicos, y el muestreo periódico de subpoblaciones para la cuantificación de biomarcadores fluorescentes. Las limitaciones de este enfoque son la incapacidad de (1) seguir gusanos individuales a lo largo del tiempo para desarrollar trayectorias de edad para fenotipos de interés y (2) monitorear biomarcadores fluorescentes directamente en el contexto del entorno de cultivo. Los enfoques de cultivo alternativos utilizan cultivo líquido o microfluídica para monitorear animales individuales a lo largo del tiempo, en algunos casos incluida la cuantificación de fluorescencia, con la desventaja de que el entorno de cultivo es contextualmente distinto del NGM sólido. El WorMotel es un dispositivo microfabricado de múltiples pozos previamente descrito para cultivar gusanos aislados en NGM sólido. Cada gusano se mantiene en un pozo que contiene NGM sólido rodeado por un foso lleno de sulfato de cobre, un repelente de contacto para C. elegans, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales individuales. Encontramos que el sulfato de cobre es insuficiente para evitar que los gusanos huyan cuando se someten a intervenciones aversivas comunes en la investigación del envejecimiento, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas y los agentes químicos que inducen estrés celular. Los dispositivos de múltiples pocillos también se moldean a partir de polidimetilsiloxano, que produce artefactos de alto fondo en imágenes de fluorescencia. Este protocolo describe un nuevo enfoque para cultivar gusanos redondos aislados en NGM sólido utilizando microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente, originalmente diseñadas para la tipificación de antígenos leucocitarios humanos (HLA), que permiten la medición de la supervivencia, los fenotipos fisiológicos y la fluorescencia a lo largo de la vida. Una barrera de ácido palmítico evita que los gusanos huyan, incluso en presencia de condiciones aversivas. Cada placa puede cultivar hasta 96 animales y se adapta fácilmente a una variedad de condiciones, incluyendo restricciones dietéticas, ARNi y aditivos químicos, y es compatible con sistemas automatizados para recopilar datos de vida útil y actividad.

Introducción

Los C. elegans son un poderoso organismo modelo para la investigación en genética, biología celular y biología molecular, porque se cultivan fácilmente en el laboratorio, tienen un tiempo de generación y vida útil cortos, comparten un alto grado de homología de proteínas con los mamíferos y tienen una estructura corporal transparente que permite la visualización in vivo de proteínas fluorescentes y colorantes¹. Como resultado del uso de larga data de C. elegans como un sistema modelo importante en una variedad de campos, incluida la biología del desarrollo y el envejecimiento, su crecimiento y desarrollo son bien cono....