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Artículo de método

Cultivo a largo plazo de Caenorhabditis elegans individuales en medios sólidos para la monitorización longitudinal de fluorescencia e intervenciones aversivas

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DOI:

10.3791/64682

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2 de diciembre de 2022

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1Department of Molecular & Cellular Biology, University of Arizona, Tucson

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, presentamos un protocolo para cultivar nematodos individuales aislados en medios sólidos para el seguimiento de parámetros fisiológicos de por vida y la cuantificación de fluorescencia. Este sistema de cultivo incluye una barrera de ácido palmítico alrededor de pozos de un solo gusano para evitar que los animales huyan, lo que permite el uso de intervenciones aversivas, incluidas bacterias patógenas y estresores químicos.

Resumen

Caenorhabditis elegans son ampliamente utilizados para estudiar la biología del envejecimiento. La práctica estándar en los estudios de envejecimiento de C. elegans es cultivar grupos de gusanos en medios sólidos de crecimiento de nematodos (NGM), lo que permite la recopilación eficiente de datos a nivel poblacional para la supervivencia y otros fenotipos fisiológicos, y el muestreo periódico de subpoblaciones para la cuantificación de biomarcadores fluorescentes. Las limitaciones de este enfoque son la incapacidad de (1) seguir gusanos individuales a lo largo del tiempo para desarrollar trayectorias de edad para fenotipos de interés y (2) monitorear biomarcadores fluorescentes directamente en el contexto del entorno de cultivo. Los enfoques de cultivo alternativos utilizan cultivo líquido o microfluídica para monitorear animales individuales a lo largo del tiempo, en algunos casos incluida la cuantificación de fluorescencia, con la desventaja de que el entorno de cultivo es contextualmente distinto del NGM sólido. El WorMotel es un dispositivo microfabricado de múltiples pozos previamente descrito para cultivar gusanos aislados en NGM sólido. Cada gusano se mantiene en un pozo que contiene NGM sólido rodeado por un foso lleno de sulfato de cobre, un repelente de contacto para C. elegans, lo que permite el monitoreo longitudinal de animales individuales. Encontramos que el sulfato de cobre es insuficiente para evitar que los gusanos huyan cuando se someten a intervenciones aversivas comunes en la investigación del envejecimiento, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas y los agentes químicos que inducen estrés celular. Los dispositivos de múltiples pocillos también se moldean a partir de polidimetilsiloxano, que produce artefactos de alto fondo en imágenes de fluorescencia. Este protocolo describe un nuevo enfoque para cultivar gusanos redondos aislados en NGM sólido utilizando microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente, originalmente diseñadas para la tipificación de antígenos leucocitarios humanos (HLA), que permiten la medición de la supervivencia, los fenotipos fisiológicos y la fluorescencia a lo largo de la vida. Una barrera de ácido palmítico evita que los gusanos huyan, incluso en presencia de condiciones aversivas. Cada placa puede cultivar hasta 96 animales y se adapta fácilmente a una variedad de condiciones, incluyendo restricciones dietéticas, ARNi y aditivos químicos, y es compatible con sistemas automatizados para recopilar datos de vida útil y actividad.

Introducción

Los C. elegans son un poderoso organismo modelo para la investigación en genética, biología celular y biología molecular, porque se cultivan fácilmente en el laboratorio, tienen un tiempo de generación y vida útil cortos, comparten un alto grado de homología de proteínas con los mamíferos y tienen una estructura corporal transparente que permite la visualización in vivo de proteínas fluorescentes y colorantes1. Como resultado del uso de larga data de C. elegans como un sistema modelo importante en una variedad de campos, incluida la biología del desarrollo y el envejecimiento, su crecimiento y desarrollo son bien conocidos, su genoma ha sido completamente secuenciado y se han creado una gran cantidad de poderosas herramientas genéticas, incluidas bibliotecas de alimentación de ARNi de todo el genoma y miles de cepas mutantes y transgénicas. Históricamente, C. elegans se cultiva como poblaciones en medios de crecimiento de nematodos de agar sólido (NGM), y los fenotipos se evalúan manualmente mediante observación directa o mediante imágenes y análisis aguas abajo. La microscopía fluorescente se utiliza para capturar una variedad de fenotipos moleculares utilizando colorantes o etiquetas fluorescentes expresadas transgénicamente en C. elegans individuales. Las imágenes fluorescentes generalmente implican arreglar o paralizar a un animal en portaobjetos que contienen almohadillas delgadas de agarosa, lo cual es invasivo y a menudo letal. También implica el uso de productos químicos, como levamisol o azida de sodio, que potencialmente pueden interferir con el proceso molecular de interés 2,3. Juntos, estos enfoques permiten recopilar datos transversales a nivel de población en una amplia gama de fenotipos, pero no permiten el seguimiento de animales individuales a lo largo del tiempo.

En los últimos años, han surgido varios enfoques para cultivar C. elegans aislados, lo que permite a los investigadores capturar cambios dinámicos en fenotipos fisiológicos y moleculares de animales a lo largo del tiempo utilizando nuevas tecnologías de imagen. Una categoría del enfoque de cultivo de C. elegans son los dispositivos microfluídicos, incluyendo WormFarm4, el chip Nemalife5 y el chip de "comportamiento" de Chronis et al.6, entre varios otros 7,8,9. Relacionados con estos están los métodos de cultivo a base de líquidos, que utilizan placas de múltiples pocillos para caracterizar gusanos individuales o pequeñas poblaciones a lo largo del tiempo10,11. Los sistemas de microfluídica y microplacas proporcionan excelentes mediciones cuantitativas de las respuestas fenotípicas en C. elegans hasta un solo animal, pero el entorno de cultivo presenta una limitación clave. La gran mayoría de las investigaciones anteriores en C. elegans, particularmente en el campo del envejecimiento, se han completado en medios sólidos basados en agar. El cultivo líquido hace que C. elegans nade continuamente y representa un contexto ambiental distinto que puede alterar la biología subyacente. Por ejemplo, los animales cultivados en medios líquidos han alterado drásticamente el contenido de grasa y la expresión génica, particularmente para los genes involucrados en la respuesta al estrés, en relación con los animales cultivados en NGM sólido a base de agar12,13. Una categoría alternativa de métodos de imagen de un solo animal involucra dispositivos de polidimetilsiloxano (PDMS) que aíslan animales individuales en medios sólidos, en un esfuerzo por imitar más de cerca el entorno estándar experimentado por los gusanos cultivados en NGM sólido en cultivo grupal en placas de Petri. El WorMotel es un dispositivo PDMS de 240 pocillos diseñado para cultivar animales individuales en medios sólidos. Cada pocillo se llena con un NGM modificado utilizando agarosa de bajo punto de fusión en lugar de agar y se siembra con alimentos bacterianos, creando un entorno de medios sólidos similar al sistema de cultivo más común que utiliza placas de Petri. Las paredes del pozo son redondas, lo que permite obtener imágenes de cada animal independientemente de la ubicación en el pozo (evitando el oscurecimiento visual causado por un animal cerca de una pared en una placa de varios pocillos). El sulfato de cobre en un foso estrecho que rodea cada pozo se utiliza como elemento disuasorio para mantener a los animales en sus pozos14,15. Una limitación de este enfoque es que el sulfato de cobre es ineficaz para evitar que los gusanos huyan cuando existen condiciones ambientales aversivas, incluida la restricción dietética, las bacterias patógenas o los productos químicos que inducen estrés celular (por ejemplo, paraquat).

Un segundo sistema que utiliza medios sólidos es el Worm Corral, que emplea un hidrogel para crear un pequeño ambiente sellado para cada gusano en un portaobjetos, lo que permite el monitoreo a largo plazo de animales aislados individualmente16. Una limitación clave es que los animales deben ser sellados en el medio ambiente como huevos, lo que requiere el uso de animales estériles para evitar la reproducción y limitar los tratamientos farmacológicos a una sola aplicación. Los ensayos de medicamentos de dosis múltiples se pueden lograr en el WorMotel ya sea realizando múltiples rondas de exposición antes de transferir gusanos al dispositivo o agregando tópicamente medicamentos adicionales a los pozos durante el experimento; Sin embargo, en este último caso, la dosis de exposición real después de agregar un medicamento adicional a un pozo existente es difícil de cuantificar con precisión y depende de la rapidez con que se degrada el medicamento. Tanto el WorMotel como el Worm Corral son excelentes para obtener imágenes de campo claro u oscuro para capturar información relacionada con la actividad y la fisiología animal (por ejemplo, crecimiento y desarrollo). Si bien estos sistemas se pueden usar para monitorear la fluorescencia, en nuestra experiencia, el PDMS utilizado para crear las otras tecnologías de imágenes de un solo gusano es propenso a formar microburbujas, capturar partículas y otras pequeñas anomalías que generan artefactos fluorescentes irregulares que interfieren con la visualización y cuantificación de fluorescencia consistente, especialmente en el rango de emisión de GFP, el fluoróforo más común utilizado en la investigación de C. elegans. Hasta la fecha, las imágenes de fluorescencia en vivo de animales individuales de C. elegans de manera longitudinal se basan principalmente en dispositivos microfluídicos17.

Aquí, describimos un método novedoso para cultivar C. elegans individuales en medios sólidos que es compatible tanto con intervenciones aversivas como con imágenes fluorescentes directas. Este enfoque es similar en concepto a otras tecnologías de imágenes de un solo gusano, excepto que el chip PDMS moldeado a medida se reemplaza con microbandejas de poliestireno disponibles comercialmente desarrolladas originalmente para ensayos de microcitotoxicidad (también comúnmente llamadas bandejas Terasaki)18. Estas microbandejas cuentan con pozos que pueden llenarse con medios sólidos y sembrarse con alimentos bacterianos, imitando de cerca el entorno experimentado por los animales bajo la metodología estándar de cultivo NGM sólido. Cada pocillo está rodeado por una barrera aversiva de ácido palmítico en lugar de sulfato de cobre. El ácido palmítico se usa comúnmente para evitar que los gusanos huyan de los medios sólidos, utilizando el cultivo grupal estándar en placas de Petri en experimentos donde los gusanos son desafiados con un ambiente aversivo como la restricción dietética o la exposición a un factor estresante químico. Las microbandejas también producen un fondo fluorescente mínimo y consistente, lo que permite obtener imágenes fluorescentes de animales directamente en su entorno de cultivo. Este nuevo sistema de cultivo basado en agar sólido de un solo animal no solo permite rastrear animales individuales a lo largo de la vida y monitorear el crecimiento, el desarrollo, la actividad y la vida útil, sino que también es compatible con la microscopía fluorescente directa. Debido a que los gusanos se pueden visualizar sin parálisis ni fijación, los biomarcadores de fluorescencia in vivo se pueden cuantificar longitudinalmente en animales individuales que permanecen en sus medios de cultivo, lo que permite la observación de cambios dinámicos a lo largo de la vida de cada animal. Este sistema de cultivo también es compatible con los sistemas automatizados de la generación actual para el seguimiento de la vida útil y otras métricas de salud14,19. Proporcionamos un protocolo detallado para cultivar C. elegans individuales en este sistema basado en microbandejas, discutimos posibles dificultades y solución de problemas, y discutimos las ventajas y limitaciones en relación con otros sistemas, y en particular, un protocolo WorMotel actualizado y optimizado15.

Cada entorno de cultivo de un solo gusano consiste en una microbandeja montada dentro de una bandeja estándar de un solo pozo utilizando un adaptador personalizado impreso en 3D (Figura 1A). Los pozos están llenos de medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM), sembrados con bacterias concentradas como fuente de alimento, y rodeados por una capa de ácido palmítico para evitar que los gusanos huyan (Figura 1B). El espacio entre la microbandeja y las paredes de la placa de un solo pozo se llena con cristales de agua saturada para mantener la humedad (Figura 1B). Se aplica un recubrimiento detergente a la tapa de la bandeja para evitar la condensación. Se agrega un solo gusano a cada pocillo, y la bandeja de un solo pozo se sella con Parafilm para mantener la humedad y permitir el intercambio de oxígeno. Hasta seis microbandejas pueden ser razonablemente preparadas en paralelo por un solo investigador experimentado.

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Protocolo

1. Recetas

NOTA: Prepare soluciones madre antes de comenzar la preparación de la placa de microbandeja.

  1. Soluciones madre para medios de crecimiento de nematodos de agarosa de bajo punto de fusión (lmNGM)
    1. Preparar 1 M K 2 HPO4 disolviendo 174,18 g de K2HPO4 en 1 Lde agua desionizada estéril en una botella de 1 L. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psi, durante 30 min y almacénela a temperatura ambiente (RT).
    2. Preparar 1 M KPi (pH 6.0) disolviendo 136.09 g de KH2HPO4 en 1 L de agua desionizada estéril en una botella de 1 L. Valorar la solución con 1 M K2HPO4 para alcanzar un pH 6.0. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psig, durante 30 min y almacénela en RT.
    3. Preparar 1 M de CaCl 2 disolviendo 73,5 g de CaCl2 en 500 ml de agua desionizada estéril en una botella de 500 ml. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psig, durante 30 min y almacénela en RT
    4. Preparar 1 M deMgSO4 disolviendo 123,25 g de MgSO4 en 500 ml de agua desionizada estéril en un frasco de 500 ml. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psig, durante 30 min y almacénela en RT.
    5. Preparar 3 M NaCl para lmNGM: En una botella limpia de 100 ml, combine 100 ml de agua ultrapura y 18,20 g de NaCl. Autoclave a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
    6. Prepare 5 mg/ml de colesterol combinando 2,5 g de colesterol, 275 ml de etanol al 100% y 25 ml de agua desionizada estéril en una botella de ámbar de 500 ml. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psig, durante 30 min y almacénela en RT.
    7. Preparar 50 mM de fluorodesoxiuridina (FUdR) disolviendo 0,1231 g de FUdR en 10 ml de agua desionizada estéril en un tubo cónico de 15 ml. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de 0,22 μm para esterilizar la solución. Alícuota 1 ml de la solución cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a -20 °C.
    8. Preparar 50 mg/ml de carbenicilina disolviendo 500 mg de carbenicilina en 10 ml de agua desionizada estéril en un tubo cónico de 15 ml. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de 0,22 μm para esterilizar la solución. Alícuota 1 ml de la solución cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a -20 °C.
    9. Preparar 1 mM de isopropilß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG) disolviendo 2,38 g de IPTG en 10 ml de agua desionizada estéril en un tubo cónico de 15 ml. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de 0,22 μm para esterilizar la solución. Alícuota 1 ml de la solución cada uno en 10 tubos de microcentrífuga y almacénelos a -20 °C.
    10. Preparar 100 mg/ml de ampicilina disolviendo 1 g de ampicilina en 10 ml de agua desionizada estéril en un tubo cónico de 15 ml. Use una jeringa de 10 ml y un filtro de 0,22 μm para esterilizar la solución. Alícuota 1 ml de la solución de ampicilina de 100 mg/ml en 10 tubos de microcentrífuga y conservar los tubos a -20 °C.
  2. Preparación de medios de crecimiento de nematodos (NGM) para el mantenimiento general de C. elegans
    1. Para hacer 50 placas, disolver 10 g de agar Bacto, 1,5 g de NaCl y 1,25 g de peptona Bacto en 486 ml de agua ultrapura en un matraz de 1 L. Esterilizar el medio esterilizándolo en autoclave en un ciclo líquido a 121 °C, 15 psig, durante al menos 30 min.
    2. Después del autoclave, dejar enfriar el medio a 55 °C. Luego, agregue 12.5 ml de 1 M KPi, 500 μL de 1 M MgSO4, 500 μL de 1 M CaCl2 y 500 μL de colesterol 5 mg / ml a la solución.
    3. Utilizando una técnica estéril, verter 10 ml del medio preparado en la etapa 1.2.2 en cada placa de 60 mm (50 en total). Deje las placas con medios durante al menos 30 minutos para que se solidifiquen. Pipetear 300 μL de cultivo bacteriano cultivado durante la noche en el centro de la placa y dejar la placa en el banco. Deje que el cultivo se seque y crezca más grueso durante 1-2 días. Conservar estas placas NGM con bacterias a 4 °C.
  3. Preparación de la premezcla lmNGM
    1. En un erlenmeyer de 250 ml, combinar 2 g de agarosa baja en fusión, 0,25 g de peptona, 1 ml de NaCl 3 M y 99 ml de agua ultrapura. Autoclave la solución a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
    2. Alícuota 10 ml de lmNGM en tubos de ensayo y cubrir con Parafilm para evitar la pérdida de líquido. Tapa los tubos y deja que se enfríen y solidifiquen.
  4. Prepare 85 mM de NaCl para alimentos bacterianos: En una botella de 100 ml, combine 515.61 mg de NaCl y llene hasta 100 ml con agua ultrapura. Autoclave a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
  5. Prepare cristales de poliacrilamida absorbentes de agua disolviendo 1 g de polímero superabsorbente Tipo S en 150 ml de agua ultrapura en una botella de compresión en autoclave. Corte la punta para asegurar un tamaño de dispensación adecuado. Autoclave a 121 °C, 15 psig, durante 30 min, tapar con papel de aluminio y agitar para mezclar los cristales.
  6. Prepare una solución detergente combinando 3 ml de Tween-20 al 100% con 7 ml de agua ultrapura en un vial cónico de 15 ml.
  7. Prepare 5 mg/ml de colesterol combinando 2,5 g de colesterol, 275 ml de EtOH al 100% y 25 ml de agua ultrapura en una botella de 500 ml.
  8. Preparar la solución de trabajo de ácido palmítico
    1. Moler 500 mg de ácido palmítico sólido en un mortero y combinarlo con 15 ml de Tween-20 en un vial cónico de 50 ml. Mezclar por vórtice, disolviendo tantos cristales como sea posible.
    2. Agregue 17.5 ml de etanol al 100% y vortex la solución para disolver la mayor cantidad de ácido palmítico posible.
    3. Agregue 17.5 ml de agua ultrapura y vórtice rigurosamente. Calentar suavemente la solución en un baño de perlas a 80 °C hasta que el ácido palmítico se disuelva por completo. Un poco de ácido palmítico puede precipitar durante el enfriamiento.
  9. Prepare el caldo de lisogenia (LB) mezclando 20 g de polvo de LB en 1 L de agua desionizada en un vaso de precipitados de 1 L o más. Alícuota 500 ml del caldo en dos vasos de precipitados de 500 ml. Autoclave el caldo a 121 °C, 15 psig, durante 30 min. Guarde el caldo preparado en RT.
  10. Preparación de placas de agar caldo de lisogenia (LB)
    1. Mezclar 10 g de LB en polvo y 7,5 g de agar Bacto en 500 μL de agua desionizada en un matraz de 1 L. Autoclave la solución en un ciclo líquido a 121 °C, 15 psig, durante 30 min.
    2. Si lo desea, añadir antibióticos opcionales (500 μL de ampicilina de 100 μg/ml) después de que el medio esterilizado en autoclave se enfríe a 55 °C. Usando una técnica estéril, haga placas de agar LB vertiendo 20 ml de medios en cada placa de 100 mm (25 en total). Conservar las placas a 4 °C.

2. Preparación de una población de gusanos sincronizados por edad

  1. Prepare una población de gusanos sincronizados por edad que estén listos para agregar a la microbandeja en la etapa larvaria 4 (L4). Alternativamente, se pueden agregar gusanos en cualquier etapa de la vida (FUdR debe excluirse de los medios de microbandejas si los gusanos se agregan en una etapa de desarrollo anterior a L4 para evitar la detención del desarrollo).
    NOTA: Este paso debe completarse 2 días antes de agregar los gusanos a la microbandeja si la etapa de vida objetivo al comienzo del experimento es L4. El tiempo de sincronización se puede ajustar para permitir que los gusanos alcancen la etapa de vida deseada.
  2. La temperatura puede afectar la vida útil. Para obtener resultados consistentes, utilice placas NGM estándar (ver sección 1) para mantener C. elegans a 20 °C, y transfiera los gusanos a placas frescas si se quedan sin alimentos bacterianos.
  3. A partir de las placas de stock con muchos gusanos adultos jóvenes, use un enfoque estándar para generar una población sincronizada por edad, más comúnmente blanqueando20 o poniendo huevos cronometrados21.
  4. Aísle los huevos y agréguelos a una placa NGM manchada de bacterias. Si se usa C. elegans de tipo salvaje, los huevos eclosionarán y formarán gusanos, alcanzando la etapa larvaria L4 en 2 días.

3. Preparación del cultivo de bacterias

  1. El día antes del comienzo del experimento, inocule la fuente de alimento bacteriano deseada. Prepare ~ 5 ml de cultivo bacteriano por placa.
    NOTA: La raya bacteriana puede prepararse con hasta 1 mes de anticipación y almacenarse a 4 ° C para la fuente de alimento de E. coli.
    1. Rayar bacterias para colonias individuales en la placa de agar LB de una reserva de glicerol congelada.
    2. Cultivar el cultivo a 37 °C durante la noche.
    3. Inocular caldo LB líquido con una sola colonia por inoculación.
    4. Agitar a ~250 rpm a 37 °C durante 12-16 h.

4. Aplicación de recubrimiento de ácido palmítico a la microbandeja

NOTA: El ácido palmítico sirve como una barrera aversiva para evitar la huida de los animales de los pozos individuales. El recubrimiento se aplica a toda la superficie inferior de la microbandeja, con la excepción de las superficies interiores de los pocillos. La nistatina se agrega al ácido palmítico para mitigar la contaminación por hongos. Este paso se puede completar 1 día antes del inicio del experimento si se desea.

  1. Ajuste el baño de cuentas a 80 °C para dar tiempo al precalentamiento.
  2. Inmediatamente antes de su uso, alícuota 1 ml de la solución de trabajo de ácido palmítico por microbandeja en un recipiente estéril separado (típicamente un vial cónico de 15 ml) y agregue 4 μL de 10,000 unidades/ml de nistatina por 1 ml de solución de ácido palmítico antes de calentar.
  3. Rocíe dentro y fuera de la microbandeja con etanol (70% o más) hasta la saturación y sacuda el exceso de etanol.
    NOTA: El etanol residual debe evaporarse durante el tratamiento en reticulación UV (paso 4.4).
  4. Use un reticulante UV para esterilizar la microbandeja (las siguientes instrucciones son para el reticulante UV utilizado en este estudio):
    1. Coloque la microbandeja y la tapa en el reticulante UV por separado (es decir, no coloque las tapas en las placas, ya que los rayos UV no penetran en el plástico).
    2. Cierre la puerta y encienda el reticulante UV.
    3. Presione Tiempo, escriba 20 min y, a continuación, presione Inicio.
    4. Después de 20 minutos, voltee el plato y la tapa y repita los pasos 4.2.2-4.2.3.
    5. Mientras usa guantes, coloque las tapas en la microbandeja para evitar la contaminación después de la esterilización.
  5. Mezcle bien la solución de trabajo de ácido palmítico mediante vórtice e inversión.
  6. Coloque el vial cónico de 15 ml con la solución de trabajo de ácido palmítico en el baño de perlas y permita que los cristales visibles se disuelvan completamente antes de usarlos.
  7. Coloque la microbandeja en la repisa que rodea el baño de cuentas con las tapas puestas durante ~ 2 minutos para calentarse.
  8. Retire la tapa de la microbandeja. Agregue lentamente 200 μL de solución de trabajo de ácido palmítico a través de la pared posterior (lado largo) de la microbandeja. Reemplace las tapas y deje que la microbandeja repose en el baño de perlas durante 2-3 minutos para permitir que la solución de ácido palmítico se asiente en el fondo de la microbandeja.
    NOTA: Si bien el fondo completo de la microbandeja no estará completamente recubierto hasta el paso 4.10, la solución debe extenderse uniformemente sobre más de la mitad de la superficie inferior. Si la solución de ácido palmítico no se extiende uniformemente, encienda un vórtice o motor vibratorio cerca de la microbandeja. Esto proporcionará una pequeña cantidad de vibración que puede ayudar a permitir que la solución de ácido palmítico se propague más fácilmente. Mantenga las tapas de la microbandeja en su lugar para mitigar la contaminación.
  9. Repita el paso 4.8.
    NOTA: Aproximadamente la mitad, o más, del fondo de la microbandeja debe estar visiblemente cubierto con el ácido palmítico líquido.
  10. Gire la microbandeja 180° y repita los pasos 4.8 y 4.9 en el otro lado de la bandeja.
    NOTA: La parte inferior de la bandeja de Terasaki solo se cubrirá con una capa delgada de solución de ácido palmítico después de que se haya agregado todo el volumen combinado a ambos lados (pasos 4.9 y 4.10). Se puede requerir más o menos mezcla de ácido palmítico dependiendo de la preparación de la mezcla, la temperatura y otros factores. Generalmente, entre 400 y 800 μL de la mezcla de ácido palmítico serán suficientes para cubrir todo el fondo de la microbandeja. Tan pronto como el fondo de la microbandeja esté visiblemente cubierto, no se debe agregar ácido palmítico adicional, ya que esto puede contaminar los pocillos.
  11. Seque la bandeja en una caja de secado estéril o campana de flujo laminar durante al menos 1 h sin tapar. Alternativamente, complete este paso el día antes de cargar las placas (sección 5), secando la microbandeja con la tapa puesta a RT durante al menos 16 h.

5. Carga de la microbandeja con medios de crecimiento de nematodos de bajo punto de fusión (lmNGM)

NOTA: Este método utiliza NGM estándar mezclado con agarosa de bajo punto de fusión en lugar del agar habitual. El agar puede comenzar a gelificarse a 45 °C. Cuando se trabaja con los pequeños volúmenes necesarios para llenar los pocillos de microbandejas, el NGM a base de agar a menudo obstruye la punta de la pipeta y / o produce superficies irregulares del pozo debido a la rápida gelificación. NGM usando agarosa de bajo punto de fusión comienza a gelificarse a ~ 28 ° C, lo que permite que los medios fundidos se pipeteen fácilmente y formen consistentemente superficies planas de pozo. Prepare lmNGM el mismo día en que los gusanos se van a colocar en la microbandeja. Si prepara la microbandeja con lmNGM, siembra con bacterias y carga de C. elegans en el mismo día, asegúrese de que los animales tengan la edad deseada o cerca de ella antes de comenzar este conjunto de pasos.

  1. Coloque un recipiente de pipeta en un baño de perlas a 80 °C para calentarse.
  2. Derretir una premezcla de 10 ml de lmNGM por microbandeja que se esté preparando (paso 1.1) en el microondas durante ~30-45 s.
    1. Coloque los tubos de ensayo de premezcla lmNGM en un vaso de precipitados de 200 ml, sin tapar para que no se vuelquen.
    2. Después de ~ 10-15 s, o cuando la premezcla lmNGM comience a burbujear, haga una pausa en el microondas, vierta la premezcla lmNGM en un vaso estéril de precipitados de 200 ml y reanude el microondas.
    3. Haga una pausa según sea necesario para evitar que hierva y gire para mezclar.
    4. Deje de calentar en el microondas una vez que todo el lmNGM se haya convertido en líquido sin trozos.
      NOTA: Una sola alícuota de 10 ml es suficiente para llenar un total de 192 pocillos (dos microbandejas).
  3. Prepare lmNGM agregando los siguientes componentes en el orden indicado a la agarosa caliente de bajo punto de fusión (los volúmenes son por 10 ml de agarosa baja de fusión): 250 μL de 25 mM KPi (pH 6), 10 μL de 1 M CaCl2, 10 μL de 1 M MgSO4 y 10 μL de colesterol 5 mg/ml
    1. Si el investigador planea examinar animales adultos a lo largo del tiempo y necesita prevenir la reproducción, agregue también 10 μL de 50 mM FUdR.
    2. Si se realiza un experimento de alimentación de ARNi utilizando la cepa común de ARN115 ARNi E. coli y plásmidos de ARNi asociados, agregue también 5 μL de 50 mg / ml de carbenicilina (para seleccionar el plásmido de ARNi) y 12 μL de 1 mM IPTG (para inducir la expresión del ARN bicatenario del plásmido ARNi).
      NOTA: Se pueden incluir aditivos adicionales dependiendo de los antibióticos selectivos y otros productos químicos necesarios para la fuente de alimento deseada. Los medicamentos o factores estresantes químicos también se pueden agregar a lmNGM en esta etapa. NGM y lmNGM contienen la misma concentración final de NaCl, pero difieren en cómo se agrega el NaCl a los medios. Para NGM, todo el NaCl se agrega durante la preparación del medio (paso 1.2). Para lmNGM, se añade una porción de NaCl durante la preparación del medio (paso 5.3) y una porción con el alimento bacteriano (sección 6). La razón de este cambio proviene del pequeño volumen de medios en cada pocillo de microbandeja. La adición de 5 μL de bacterias concentradas suspendidas en LB a un pocillo que contiene 20 μL de medios alterará sustancialmente la composición de nutrientes del medio (al agregar los componentes de LB a un volumen comparable). Para evitar esto, la bacteria se resuspende en una solución de NaCl para eliminar los componentes LB y evitar el estrés osmótico en las bacterias. El NaCl agregado a los medios se reduce en consecuencia para tener en cuenta la sal agregada a las bacterias.
  4. Vierta lmNGM en el recipiente de pipeta calentado.
  5. Con la microbandeja en una mesa de sobremesa, pipetear 20 μL de lmNGM en cada microbandeja. Cubra la microbandeja cuando rellene la pipeta para minimizar la contaminación.
    NOTA: Este paso es más fácil con una pipeta de repetición electrónica.

6. Sembrar los pocillos de microbandejas con alimentos bacterianos

NOTA: 5 μL de alimento concentrado 10x de un cultivo inoculado durante la noche es suficiente para alimentar a un solo C. elegans durante toda su vida útil.

  1. Transfiera las bacterias del cultivo nocturno a un vial cónico de 50 ml.
  2. Centrifugadora a ~3.500 x g durante 20 min.
  3. Retire el sobrenadante. Resuspender el cultivo de bacterias a una concentración de 10x (1/10 de volumen del cultivo original) con una solución de NaCl de 85 mM.
  4. Antes de agregar bacterias a los pocillos, inspeccione visualmente la microbandeja para asegurarse de que el lmNGM sólido esté completamente contenido dentro de cada pozo. Si algún lmNGM cuelga del costado de un pozo, raspe el exceso de lmNGM con una punta de pipeta. Este exceso de medios puede hacer que la comida se convierta en ácido palmítico si no se elimina.
  5. Pipetear cuidadosamente 5 μL de cultivo bacteriano concentrado 10x sobre la superficie del lmNGM en cada pocillo. Trate de evitar permitir que el cultivo de bacterias corra sobre el costado del pozo y hacia el ácido palmítico, ya que esto atraerá a los gusanos a abandonar el pozo.
  6. Deje que las microbandejas se sequen en una caja de secado estéril o campana de flujo laminar durante ~ 35 min. Verifique cada ~ 5 minutos y tenga cuidado de no secar demasiado. Retire cuando algunos pozos estén visiblemente ligeramente húmedos, ya que los pozos se secarán aún más mientras se agregan los nematodos.

7. Encerrar cada microbandeja dentro de una placa de un solo pocillo

NOTA: En esta sección, la microbandeja se monta dentro de una placa estándar de un solo pozo utilizando un inserto personalizado impreso en 3D y rodeado de cristales que absorben agua. La placa de un solo pocillo se cierra y se sella con Parafilm. Esto permite el intercambio de oxígeno al tiempo que evita la contaminación y mantiene la humedad suficiente para evitar que el lmNGM se seque en el transcurso de experimentos de varias semanas (los experimentos de vida útil de los gusanos pueden durar de 6 a 8 semanas si se examinan mutaciones que prolongan la vida útil o condiciones ambientales). Durante la preparación, asegúrese de cubrir el plato siempre que no se agregue algo activamente para minimizar la contaminación bacteriana o fúngica.

  1. Esterilice una placa de un solo pocillo y un adaptador y una tapa impresos en 3D sumergiendo cada uno en una solución de lejía al 10%. Enjuague bien con agua DI estéril. Seque con un toallita de tareas.
  2. Rocíe la placa de un solo pocillo y el adaptador impreso en 3D y la tapa con una solución de etanol al 70% o más y limpie con una toallita de tareas. Deje secar al aire cualquier etanol residual.
    NOTA: La radiación UV también se puede utilizar después de la lejía y el etanol con los mismos parámetros que la microbandeja, como se describe anteriormente en el paso 4.4.
  3. Coloque el inserto estéril impreso en 3D en una placa estéril de un solo pozo.
  4. Esterilice el exterior de la microbandeja preparada rociándola con etanol al 70%.
  5. Coloque la microbandeja en el adaptador impreso en 3D en la placa de un solo pozo.
  6. Deseche la tapa de la microbandeja.
  7. Dispense generosamente cristales de agua en la parte superior del inserto impreso en 3D entre la pared exterior de la microbandeja y la pared interna de la placa de un solo pozo.
  8. Añadir inmediatamente los gusanos (sección 8) o sellar la microbandeja para utilizar al día siguiente. Cierre la tapa de la bandeja y use una sola pieza de Parafilm para envolver los cuatro lados para sellar la microbandeja. Repita el paso de sellado con Parafilm dos veces más para un total de tres capas.
  9. Después de sellar la microbandeja, déjela en el banco en RT durante un máximo de 4 días antes de agregar los gusanos (sección 8).

8. Adición de gusanos a la microbandeja

NOTA: Se puede agregar manualmente un gusano a cada pocillo transfiriendo animales de las poblaciones de gusanos sincronizados por edad (sección 2) usando una púa de platino. Solo transfiera animales en la etapa de vida deseada. Si el proceso de transferencia tarda más de 1 h, el lmNGM en los pocillos de microbandejas puede desecarse. La transferencia de grupos de 10 a 20 gusanos a la vez puede acelerar este paso, pero se necesita algo de práctica para liberar consistentemente un solo animal por pozo.

  1. Agregue un nematodo por pozo una vez que alcancen la etapa de vida deseada.
  2. Vuelva a colocar la tapa sobre la microbandeja cuando recoja gusanos de la placa de origen para minimizar la contaminación.

9. Terminar de preparar el entorno de cultivo para su uso a largo plazo

NOTA: Los pasos a continuación se realizan para garantizar que los medios y gusanos en la microbandeja permanezcan hidratados durante la duración del experimento.

  1. Agregue ~ 40 μL de la solución detergente a la tapa de una placa de un solo pocillo y use una toallita de tareas para cubrir uniformemente la tapa. Este recubrimiento evitará la condensación con el tiempo una vez que la placa esté sellada. Use toallitas de trabajo adicionales para esparcir la solución detergente hasta que la visión a través de la tapa no se distorsione (esto generalmente toma alrededor de dos toallitas de tarea).
  2. Examine los cristales de agua para asegurarse de que estén nivelados con el borde superior de la microbandeja y no se desborden. Si es necesario, agregue o retire cristales de agua al plato.
  3. Utilizando el siguiente enfoque, envuelva la bandeja con Parafilm (tres piezas en total) para asegurarse de que el sello Parafilm durará a largo plazo.
    1. Estire ligeramente la primera pieza de Parafilm para cubrir dos lados de la bandeja.
    2. Estire ligeramente la segunda pieza de Parafilm y cubra los lados restantes de la bandeja.
    3. Estire la pieza final de Parafilm y envuelva completamente los cuatro lados de la bandeja, cubriendo la primera y segunda pieza de Parafilm. Una microbandeja correctamente sellada puede permanecer hidratada durante ~ 2 meses.
      NOTA: Monitoree la integridad del Parafilm cada 1-2 semanas durante todo el experimento y reemplácelo según sea necesario.
    4. Limpie la parte superior de la bandeja con una toallita de tareas, húmeda con etanol al 70%, para eliminar las huellas dactilares.
  4. Etiquete la placa de un solo pocillo con cinta adhesiva. La microbandeja ahora está lista para obtener imágenes y almacenamiento a largo plazo para monitorear los gusanos a lo largo del tiempo. Entre sesiones de imagen, mantener la bandeja a 20 °C. La microbandeja se puede abrir y volver a sellar varias veces para la dosificación de medicamentos u otros procedimientos, pero debe minimizarse para evitar la contaminación y la pérdida de humedad.

10. Obtención de imágenes de gusanos individuales en pocillos de microbandejas

NOTA: El propósito de este protocolo es proporcionar una descripción detallada de cómo preparar el entorno de cultivo de microbandejas. Una vez preparados y poblados con gusanos, los entornos de cultivo de microbandejas de un solo gusano se pueden utilizar para monitorear longitudinalmente muchos fenotipos utilizando técnicas establecidas para el cultivo estándar en placas de Petri. La siguiente sección proporciona instrucciones básicas para medir algunos fenotipos comunes. Las imágenes fluorescentes deben realizarse en un microscopio vertical. La refracción de la luz a través de la bandeja Terasaki se minimiza en una habitación oscura.

  1. Vida útil: Mida la vida útil golpeando suavemente el costado o la parte superior de la placa o brillando una luz azul brillante en la placa y observando a cada animal. Marca un animal "muerto" si no se mueve en unos pocos segundos. Repita esta tarea cada 1-3 días hasta que todos los gusanos hayan muerto.
    NOTA: El entorno de cultivo de microbandejas es compatible con sistemas que automatizan la recolección y el análisis de imágenes para la estimación de la vida útil14,19.
  2. Microscopía estándar: realice imágenes de campo claro (o campo oscuro) en pocillos individuales o en toda la bandeja con una cámara o escáner de alta resolución. Estos datos de imágenes se pueden utilizar para una variedad de fenotipos, incluido el tamaño del animal 22,23,24, el desarrollo 25, la actividad 14,19 y la vida útil.
  3. Microscopía fluorescente: Realice imágenes fluorescentes en pozos individuales, ya sea manualmente o con un sistema de plataforma motorizada. Las bandejas de un solo pocillo son compatibles con los adaptadores de placa multipocillos estándar. La relación señal-ruido se minimiza si el aparato se coloca en una caja de paredes negras.
    NOTA: Debido a que los gusanos se visualizan mientras permanecen libres para gatear, este sistema de cultivo es adecuado para imágenes de baja resolución para capturar fluorescencia de todo el cuerpo y localización de tejido rugoso de fluoróforos. Las imágenes de alta resolución y gran aumento generalmente requieren que los animales sean inmovilizados para evitar el movimiento. Si bien debería ser posible aplicar tópicamente un agente paralizante (por ejemplo, azida de sodio o levamisol) a cada pocillo y proceder con imágenes de mayor resolución, esto impediría mediciones repetidas del mismo gusano en puntos de tiempo posteriores. El sistema de cultivo, como se describe, tampoco está destinado a ser invertido, lo que impide el uso de sistemas de microscopio invertido.
    1. Si el campo claro no se utiliza para medir la vida útil y solo se captura la fluorescencia, mida la vida útil manualmente. Dejar la luz azul (utilizada para la excitación de GFP) en el gusano durante 5 s hará que el animal se mueva. Si el animal no se ha movido dentro de 5 s, considere al animal como muerto.

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Resultados

El entorno de cultivo de gusanos individuales basado en microbandejas descrito aquí se puede usar para monitorear una variedad de fenotipos, incluida la vida útil y la duración de la salud, la actividad y el movimiento, la forma del cuerpo y la geometría de rastreo, y la expresión de biomarcadores fluorescentes expresados transgénicamente en animales individuales a lo largo del tiempo. El sistema de cultivo de microbandejas es compatible con el análisis de vida útil a través de la puntuación manual o la recopilación de i...

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Discusión

Aquí, describimos un nuevo sistema de cultivo que adapta microbandejas, originalmente desarrollado para ensayos de tipificación de tejido de antígeno leucocitario humano, para permitir el aislamiento y caracterización de C. elegans individuales a lo largo del tiempo en un entorno de medios sólidos que es contextualmente similar al NGM basado en agar que es el estándar en la investigación de C. elegans. Este sistema es compatible con una variedad de intervenciones, incluida la restricción dietética, el ...

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Divulgaciones

Los autores afirman que no tienen ningún conflicto de intereses que revelar.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por NIH R35GM133588 a G.L.S., una subvención de capacitación NIHT32GM008659 a L.E., un Premio Catalizador de la Academia Nacional de Medicina de los Estados Unidos a GLS y el Fondo de Iniciativa de Tecnología e Investigación del Estado de Arizona administrado por la Junta de Regentes de Arizona.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Inserciones de terasaki impresas en 3DEmpresa de impresión personalizadaRobot_Terasaki_tray_insert_10-20
-2021.Impresión		STL FDM, tamaño de boquilla 0,6 mm utilizando sistemas estándar de filamento PLA más AirClean
AC624LF campana de gases de flujo laminar verticalFisher Scientific36-100-4376
Peptona BactoThermo Scientific 211677
CaCl2 Acros organics349615000
Caenorhabditis elegans N2Caenorhabditis Genetics Center (CGC)N2Cepa silvestre
CarbenicillinGoldbioC-103-25
ColesterolICN Biomedicals Inc101380
Escherichia coli OP50 Centro de Genética de Caenorhabditis (CGC)OP50Alimento de laboratorio estándar para C. elegans
EthanolMilliporeex0276-4
Fisher Vortex Genie 2Fisher ScientificG-560
FUdR Research Products InternationalF10705-1.0
Cristales de agua hidratantes M2 Polymer TechnologiesTipo STipo S polímero superabsorbente
Isopropilo ß-D-1-tiogalactopiranósido (IPTG)GoldBioI2481C100
K2HPO4Fisher ChemicalP288-500
ToallitasKimTech34155Toallitas de trabajo
LB Broth, LennoxBD Difco240230
Cámara monocromática Leica K5 sCMOSLeica Microsystems11547112
Microscopio estereoscópico fluorescente Leica M205 FCALeica Microsystems10450826
Agarosa de bajo punto de fusiónResearch Products InternationalA20070-250.0
MgSO4 Fisher ChemicalM-8900
NaClBiorreactivos FisherBP358-1
Nunc OmniTray Placa de pocilloúnico Thermo Scientific264728
NystatinSigmaN1538
Ácido palmíticoAcros organics 129700010
Toallas de papelCoastwide Professional365374
Parafilm MParafilm16-101
Stratagene UV Stratalinker 2400Stratagene400075Reticulante UV
Bandejas Terasaki (Lambda)One Lambda151431
Thermolyne Dri-bathThermolyne DB28125
Tween Thermo ScientificJ20605-AP

Referencias

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