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Artículo de método

Preparación de suspensión unicelular del intestino de tilapia del Nilo para secuenciación unicelular

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DOI:

10.3791/64688

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10 de febrero de 2023

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1State Key Laboratory of Marine Resource Utilization in South China Sea, Hainan University, 2Provincial Key Laboratory of Aquatic Animal Disease Control and Healthy Culture, College of Fishery, Guangdong Ocean University, 3Hainan Provincial Key Laboratory for Tropical Hydrobiology and Biotechnology, College of Marine Science, Hainan University, 4Department of Animal Wealth Development, Faculty of Veterinary Medicine, Suez Canal University

* These authors contributed equally

En este artículo

Resumen

Aquí, demostramos la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad de intestino de tilapia para secuenciación de células individuales.

Resumen

La tilapia del Nilo es una de las especies de peces de agua dulce más comúnmente cultivadas en todo el mundo y es un modelo de investigación ampliamente utilizado para estudios de peces acuícolas. La preparación de suspensiones unicelulares de alta calidad es esencial para estudios a nivel de una sola célula, como el ARN unicelular o la secuenciación del genoma. Sin embargo, no existe un protocolo listo para usar para las especies de peces de acuicultura, particularmente para el intestino de la tilapia. Las enzimas de disociación efectivas varían según el tipo de tejido. Por lo tanto, es esencial optimizar el protocolo de disociación tisular seleccionando la enzima o combinación de enzimas adecuada para obtener suficientes células viables con un daño mínimo. Este estudio ilustra un protocolo optimizado para preparar una suspensión unicelular de alta calidad a partir del intestino de tilapia del Nilo con una combinación enzimática de colagenasa / dispasa. Esta combinación es altamente efectiva para la disociación con la utilización de albúmina sérica bovina y DNasa para reducir la agregación celular después de la digestión. La salida celular satisface los requisitos para la secuenciación de una sola célula, con una viabilidad celular del 90% y una alta concentración celular. Este protocolo también se puede modificar para preparar una suspensión unicelular de los intestinos de otras especies de peces. Esta investigación proporciona un protocolo de referencia eficiente y reduce la necesidad de ensayos adicionales en la preparación de suspensiones unicelulares para especies de peces de acuicultura.

Introducción

Las células son las unidades fundamentales de los organismos. En comparación con los estudios de tejido a granel, los estudios a nivel de una sola célula pueden reflejar la heterogeneidad celular y proporcionar información de mayor resolución1. En los últimos años, los investigadores han aplicado tecnologías de secuenciación de células individuales para estudios de genoma, transcriptoma, epigenoma o multiómicos a nivel de una sola célula en mamíferos, peces cebra y otros organismos modelo y reportaron grandes avances 2,3,4,5,6,7 . Si bien la mayoría de los estudios se han centrado en organismos modelo, existen pocos protocolos de referencia o kits de disociación comercial para la secuenciación de células individuales en especies de peces económicas, lo que limita la aplicación de la secuenciación de células individuales en la investigación acuícola. Por lo tanto, es crucial desarrollar protocolos de disociación tisular que produzcan suspensiones unicelulares de alta calidad con alta viabilidad celular e integridad de ácidos nucleicos.

Optimizar el protocolo de disociación tisular con la enzima o combinación de enzimas adecuada para obtener suficientes células viables con un daño mínimo es esencial. La enzima más eficaz para la disociación tisular varía según el tipo de tejido. En mamíferos, se han utilizado varias enzimas para preparar suspensiones unicelulares para tejidos sólidos de mamíferos, incluyendo colagenasa, dispasa, tripsina, papaína, elastasa, hialuronidasa, liberasa, accutasa y tripLE 8,9. La digestión de tripsina combinada con la interrupción mecánica se ha utilizado comúnmente para disociar tejidos para el cultivo celular en peces 10,11,12,13,14. La tripsina también se ha utilizado o añadido en el cóctel de digestión para la disociación tisular en el intestino de rata15 y el tejido branquial del pez cebra16. Sin embargo, por varias razones, la tripsina no es la mejor opción para la secuenciación de células individuales. La tripsina sola suele ser ineficaz para la disociación tisular. Además, la tripsina induce roturas de la cadena de ADN 17,18 y degradación del ARN19.

La papaína degrada las proteínas que forman las uniones estrechas entre las células. En las células nerviosas y musculares lisas de mamíferos, la papaína es más eficiente y menos destructiva que otras proteasas20,21. Sin embargo, al igual que la tripsina, la papaína resulta en la agregación de células inducida por ADN libre debido a la lisis celular que ocurre durante la digestión enzimática9. La elastasa descompone la elastina, que se encuentra típicamente en la piel, los pulmones, los ligamentos, los tendones y los tejidos vasculares22. A menudo se utiliza en combinación con colagenasa, dispasa o tripsina para disociar el tejido pulmonar8. La hialuronidasa rompe los enlaces glucosídicos del hialuronano, contribuyendo a la digestión de la matriz extracelular en diversos tejidos conectivos y piel 9,23.

En general, la colagenasa y la dispasa son buenas opciones para la ruptura de la matriz extracelular. Se han utilizado en la disociación de intestinos humanos, de ratón y de pez cebra24,25,26,27. La colagenasa destruye el enlace peptídico en el colágeno, promueve la digestión de la matriz extracelular y libera las células en suspensión y, por lo tanto, la colagenasa se usa a menudo para la disociación del tejido sólido humano y de ratón, incluso para el hígado 28,29, bazo30, páncreas31 e intestino 25. La dispasa es una proteasa que hidroliza los enlaces peptídicos N-terminales de los residuos de aminoácidos no polares y es más suave que la colagenasa. Escinde los componentes de la matriz extracelular, como la fibronectina, el colágeno tipo IV y, en menor medida, el colágeno tipo I, sin afectar las uniones célula-célula. La dispasa se usa por separado o con otras enzimas para la disociación de tejidos, como para el intestino25,32, el cerebro33, el hígado34, etc. Además, los cócteles de digestión disponibles comercialmente, incluyendo liberasa, accutasa y trypLE, también son buenas alternativas para la disociación del tejido sólido, especialmente para la piel, el hígado y el riñón 8,9.

La tilapia del Nilo (Oreochromis niloticus) pertenece a la familia Cichlidae del orden Perciformes. Es una de las especies de peces de agua dulce más cultivadas en áreas tropicales y subtropicales, con una producción anual de 4,5 millones de toneladas en 202235. Es una de las especies de peces de acuicultura mejor estudiadas con un genoma bien anotado. La tilapia del Nilo es un modelo de investigación ideal para las especies de peces de acuicultura debido a su corto tiempo de generación, facilidad de cría y adaptabilidad a una amplia gama de entornos de cría. El intestino es de gran interés de investigación, ya que es el órgano de nutrición, digestión y absorción, metabolismo e inmunidad de la mucosa. El intestino es el hábitat de las poblaciones microbianas y es un tejido inmune esencial36. Es inmunológicamente activo debido a la presencia de numerosos tipos de células inmunes, incluyendo macrófagos, células B, granulocitos y células T.

En el estudio actual, desarrollamos un protocolo para preparar una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo para facilitar estudios a nivel de una sola célula en especies de peces acuícolas. De acuerdo con las características de estas enzimas específicas del tejido y el trabajo preliminar, la colagenasa/dispasa es apropiada para disociar el tejido intestinal de la tilapia. El último tipo de enzima a considerar en la preparación de suspensiones unicelulares es DNasa-I, que previene la agregación celular al degradar el ADN libre liberado a través de la lisis de células muertas durante la digestión enzimática sin iniciar vías apoptóticas9 y aumenta el rendimiento de células vivas36. Además, la albúmina sérica bovina (BSA) se agrega al tampón de lavado para reducir la aglutinación celular y mejorar la viabilidad celular. Varias compañías de reactivos describen BSA como un estabilizador enzimático. La adición de 0,04%-1% de BSA al PBS (solución salina tamponada con fosfato) se ha utilizado para desarrollar una solución de lavado para la preparación de suspensiones de secuenciación unicelular sin efectos adversos38. La adición de una baja proporción de BSA podría ayudar a mantener la viabilidad celular y evitar la agregación de células inducida por ADN libre debido a la lisis celular. Este protocolo también puede proporcionar una referencia valiosa para desarrollar protocolos de disociación celular de los intestinos de otras especies de peces de acuicultura.

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Protocolo

Todos los protocolos con animales durante este estudio fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de Hainan (número de protocolo: HNUAUCC-2022-00063; Fecha de aprobación: 2022-03-03). Una lista de los equipos y suministros utilizados en este experimento se puede encontrar en la Tabla de materiales. En la figura 1 se ilustra un resumen del protocolo actual.

1. Preparación del pescado

  1. Obtenga tilapia del Nilo de 6 meses de edad con un peso corporal promedio de 100 g de una fuente confiable. Seleccione peces que estén libres de cualquier signo de enfermedad.
  2. Deje de alimentar a los peces 24 h antes de continuar con el siguiente paso.
    NOTA: El ayuno de pescado reduce el volumen del contenido intestinal y facilita la preparación de los segmentos intestinales.
  3. Enjuague el pescado en agua estéril bien aireada durante 15 minutos para eliminar las bacterias sueltas en la superficie del cuerpo.
  4. Eutanasia de los peces con 300 mg/L de metanosulfonato de tricaína (MS-222) durante unos 10 minutos hasta que se detenga todo el movimiento.

2. Preparación del reactivo

  1. Prepare solución salina tamponada con fosfato al 0,08% de BSA-Dulbecco (BSA-DPBS, para enjuague y resuspensión celular). Disolver 0,08 g de BSA (0,8% p/v) en 100 ml de 1x DPBS. Conservar a 4 °C y enfriar previamente en hielo cuando se utilice.
    NOTA: La adición de BSA es beneficiosa para minimizar la aglutinación celular. La relación BSA se puede aumentar de 0.04% a 1% de acuerdo con las condiciones de aglutinación celular.
  2. Preparar el reactivo de disociación celular enzimática.
    1. Diluir la colagenasa/dispasa con 1x PBS hasta una concentración final de 1 mg/ml (0,1 U/ml de colagenasa y 0,8 U/ml de dispasa). Asegúrese de que se utiliza PBS y no DPBS.
      NOTA: PBS proporciona los iones de calcio necesarios para que la enzima funcione correctamente. DPBS no debe usarse en este paso porque está libre de Ca 2+/Mg2+. Además, la colagenasa tipo I se utiliza en el protocolo actual.
    2. Filtrar la dilución a través de un filtro de membrana estéril de 0,22 μm.
    3. Prepare un reactivo de disociación celular que esté compuesto por un 95% de volumen de solución de colagenasa/dispasa y un volumen de 5% de suero fetal bovino (FBS).
      NOTA: El reactivo de disociación debe hacerse fresco cada vez que se utilice. El uso de FBS al 5% ayuda a mantener la viabilidad celular durante la digestión.
  3. Prepare la solución de azul de tripano.
    1. Tome la solución de tripano azul de la nevera a 4 °C y manténgala a 15-20 °C durante unos minutos antes de usarla para evitar la precipitación.
    2. Filtrar la solución a través de una membrana estéril de 0,22 μm.

3. Preparación del equipo

  1. Enfríe previamente la centrífuga refrigerada a 4 °C antes de su uso.
  2. Obtenga tubos centrífugos estériles de 1,5 ml libres de RNasa, tubos cónicos de 50 ml, pipetas y puntas de vidrio de gran calibre, filtros de membrana, filtros celulares y todos los tubos y puntas de baja retención.
  3. Pipetas de vidrio en autoclave y herramientas de disección, incluidos fórceps, tijeras y bisturíes, y pretratarlos con la solución de eliminación de RNasa para prevenir los efectos adversos de la RNasa para el RNA-seq unicelular.

4. Disección tisular y disociación celular

  1. Ponga el pez sacrificado en hielo para su disección. Asépticamente, recolecte 3-4 cm de la sección media del intestino y elimine tanta grasa y mesenterio como sea posible. Retire con cuidado la grasa adherida a la superficie intestinal y la capa de mucosa transparente elástica y maleable con fórceps.
    NOTA: La grasa y el mesenterio están unidos a la superficie externa del intestino.
  2. Eliminar la mayor cantidad de grasa posible para prevenir sus efectos adversos sobre el protocolo de disociación. Con una jeringa, enjuague suavemente los fragmentos con PBS estéril helado varias veces para lavar el contenido intestinal y el moco. Evite el manejo brusco.
  3. Diseccionar el segmento del intestino en trozos pequeños y transferirlos a un tubo de 1,5 ml lleno de 1 ml de PBS helado.
  4. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C. Retire el sobrenadante suavemente y reemplácelo con 1 ml de BSA-DPBS al 0,08% helado. Resuspender los fragmentos de tejido mediante una aspiración suave con una pipeta de vidrio. Repita este paso dos veces.
  5. Retirar el sobrenadante y digerir los fragmentos de tejido utilizando 1 ml del reactivo de disociación enzimática (950 μL de solución de colagenasa/dispasa y 50 μL de FBS) en un baño maría a 37 °C durante 30-60 min.
    1. Además, añadir 5 μL de inhibidor de la RNasa (40 U/μL en la solución madre) al reactivo de disociación si las muestras están preparadas para la secuenciación de ARN unicelular.
      NOTA: La concentración final de la mezcla colagenasa/dispasa es de 1 mg/ml, incluyendo colagenasa a 0,1 U/ml y dispasa a 0,8 U/ml.
  6. Invierta manualmente el tubo a intervalos de 5 minutos durante el baño de agua de 30-60 minutos.
    NOTA: El tiempo exacto de incubación varía según los tejidos utilizados. Verifique el progreso de la disociación bajo un microscopio hasta que no se vea tejido a granel. Coloque 10 μL de la suspensión celular en un portaobjetos de vidrio con una pipeta y examínelo bajo el microscopio. Aumente el tiempo de digestión si las células no están completamente disociadas.
  7. Girar los tubos a 300 × g durante 5 min a 4 °C y retirar suavemente el reactivo de disociación celular enzimática utilizando puntas de gran calibre. Agregue 1 ml de BSA-DPBS al 0,08% helado y pipete suavemente las células hacia arriba y hacia abajo con una pipeta de vidrio de diámetro ancho durante 1 minuto.
    1. Repita este paso dos veces.
      NOTA: El pipeteo hacia arriba y hacia abajo debe realizarse con cuidado utilizando puntas de calibre ancho y baja retención para evitar la interrupción celular.
  8. Humedezca previamente un filtro celular de 40 μm con BSA-DPBS al 0,08% y colóquelo en un tubo cónico de 50 ml. Pase la suspensión celular a través del filtro. Golpee y enjuague con un DPBS adicional de 200 μL y recoja la suspensión en la parte inferior del tubo.
  9. Transfiera la suspensión a un tubo de 1,5 ml. Añadir 5 μL de DNasa I (1 U/μL) e incubar durante 15 min a 15-20 °C. Centrifugar a 300 × g durante 5 min a 4 °C.
  10. Retire el sobrenadante y vuelva a suspender el pellet celular en 400 μL de DPBS helado (libre de Ca 2+/Mg2+). Pipetea suavemente hacia arriba y hacia abajo con puntas de gran calibre para mezclar las células. Repita este paso dos veces.

5. Tinción y examen microscópico

  1. Para la tinción, mezcle la suspensión celular con una solución de azul de tripano al 0,4% en una proporción de 1:1. Incubar durante 3 min a temperatura ambiente.
  2. Agregue 5-10 μL de la mezcla en un hemocitómetro y examínela bajo el microscopio.
    NOTA: Las células viables tendrán citoplasma no teñido, mientras que las células muertas tendrán un citoplasma azul (Figura 2).
  3. Cuente las células viables y muertas en tres campos diferentes bajo el microscopio. Calcule el porcentaje de viabilidad celular dividiendo el número de celdas viables por el número total de celdas en un campo.
    NOTA: La viabilidad celular debe ser superior al 85%, y la concentración celular no debe ser inferior a 1 x 105-1 x 107/mL. El fondo de suspensión celular debe estar limpio, sin grumos, fragmentos o impurezas.

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Resultados

Este protocolo describe la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo para la secuenciación unicelular (Figura 1). Esta investigación muestra que la mezcla colagenasa/dispasa tiene un buen efecto de disociación y es leve para el tejido intestinal. La selección de la enzima de digestión óptima es esencial para preparar una suspensión unicelular de alta calidad. En el trabajo preliminar, se compararon las eficiencias de disociación de varias enzi...

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Discusión

Este protocolo describe la preparación de una suspensión unicelular de alta calidad del intestino de tilapia del Nilo. Antes de la disociación, es necesaria la eliminación de grasa y mesenterio del intestino, particularmente para los intestinos de peces carnívoros con mucha grasa. El uso de una jeringa en lugar de raspado duro para lavar el contenido intestinal reduce el daño mecánico a las células. Para garantizar la viabilidad celular, también es esencial mantener la temperatura a 20 °C o menos para los pasos de disecc...

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Divulgaciones

Los autores no tienen conflictos de intereses que revelar.

Agradecimientos

Los autores desean agradecer el apoyo de la Fundación Provincial de Ciencias Naturales de Hainan de China (NO. 320QN211) y el Programa del Fondo de Investigación del Laboratorio Provincial Clave de Control de Enfermedades de Animales Acuáticos y Cultura Saludable de China de Guangdong (NO. PBEA2021ZD01).

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
0.22-μ m Filtro estérilSolarbio Life SciencesSLGV033RBSe utiliza para filtrar y esterilizar la solución enzimática.
40-μ m Filtro de célulasSolarbio Life SciencesF8200El filtro de células se aplica para eliminar los trozos de tejido no digeridos.
Albúmina sérica bovina (BSA)Sigma-AldrichSRE0098polvo; diluir 0,04 g BSA con 100 mL 1&veces; DPBS para preparar 0.04% BSA-DPBS lavado bffer. Almacene a 2 - 8 °C.
Colagenasa IISangon BiotechA004202Diluido con PBS hasta una concentración final de 1 mg/mL.
Colagenasa/dispasaRoche10269638-001Diluir con PBS hasta una concentración final de 1 mg/mL.
DispasaSigma-AldrichD4818Diluir con PBS hasta una concentración final de 1 mg/mL.
DNasa ISigma-AldrichAMPD1La DNasa I ayuda a reducir la aglomeración celular.
Solución salina tamponada con fosfato (DPBS) de Dulbecco, Ca2+/Mg2+ libre deSolarbio Life SciencesE607009-0500Almacene a temperatura ambiente.
ElastaseSangon BiotechA600438Diluido con PBS hasta una concentración final de 0,5 mg/mL.
Suero fetal bovino (FBS)Gibco16000-044Suero, utilizado a un volumen del 5% en solución de digetsción.
Invertido  MicroscopioLeicaqTOWER3GSe utiliza para examinar la viabilidad de las células.
LiberaseRoche5401119001Diluir con PBS hasta una concentración final de 0,25 mg/mL.
Tilpia del Nilo (Oreochromis niloticus)ProGift Aquaculture Technology Co. Ltd.NAPeces sanos sin signos de enfermedad (Peso corporal medio: 100 g). 
Solución salina tamponada con fosfato (PBS)Solarbio Life SciencesP1020Almacenar a temperatura ambiente.
Centrífuga refrigeradaEppendorf5424Se utiliza para centrifugar el tejido y la célula petet.
Inhibidor de la ARNasaNEBM0314LInhibir la actividad de la ARNasa
Reactivo de fase sólida RNasa-Be-GoneSangon BiotechB644201-0050Se utiliza para eliminar la ARNasa de herramientas como tijeras de disección y pipetas de vidrio. Almacene a temperatura ambiente.
Metanosulfonato de tricaína (MS-222)Sigma-AldrichE10521Para la eutanasia de peces. 
Azul de tripanoInvitrogenC0040Se utiliza para teñir las células muertas.
TripsinaSangon BiotechE607001Diluir con PBS hasta una concentración final de 1 mg/mL.

Referencias

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