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Artículo de método

Análisis de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem en ratas con dismenorrea primaria

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DOI:

10.3791/64691

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23 de diciembre de 2022

 ,  ,  ,  ,  , 
1Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Evaluation of Chinese Medicine, Chongqing Academy of Chinese Materia Medica

En este artículo

Resumen

Aquí, se presenta un análisis comparativo de muestras crudas y procesadas de rizoma de Cyperi (CR) utilizando cromatografía líquida de ultra alto rendimiento-espectrometría de masas en tándem de alta resolución (UPLC-MS / MS) en ratas con dismenorrea primaria. Los cambios en los niveles sanguíneos de los metabolitos y los componentes de la muestra se examinaron entre ratas tratadas con RC y RC procesadas con vinagre (CRV).

Resumen

El rizoma Cyperi (CR) es ampliamente utilizado en ginecología y es una medicina general para tratar enfermedades de las mujeres en China. Dado que el efecto analgésico de la RC se mejora después del procesamiento con vinagre, la RC procesada con vinagre (CRV) generalmente se usa clínicamente. Sin embargo, el mecanismo por el cual el efecto analgésico se ve reforzado por el procesamiento del vinagre no está claro. En este estudio, se utilizó la técnica de cromatografía líquida de ultra alta presión espectrometría de masas en tándem (UPLC-MS / MS) para examinar los cambios en los niveles sanguíneos de los constituyentes exógenos y metabolitos entre ratas tratadas con CR y tratadas con CRV con dismenorrea. Los resultados revelaron diferentes niveles de 15 componentes y dos metabolitos en la sangre de estas ratas. Entre ellos, los niveles de (-)-mirtenol y ácido [(1R,2S,3R,4R)-3-hidroxi-1,4,7,7-tetrametilbiciclo[2.2.1]hept-2-il]acético en el grupo de VCR fueron considerablemente más altos que en el grupo de RC. CRV redujo el nivel de prostanoides de la serie 2 y leucotrienos de la serie 4 con actividades proinflamatorias, de agregación plaquetaria y vasoconstricción y proporcionó efectos analgésicos al modular el metabolismo del ácido araquidónico y el ácido linoleico y la biosíntesis de ácidos grasos insaturados. Este estudio reveló que el procesamiento del vinagre mejora el efecto analgésico de la RC y contribuye a nuestra comprensión del mecanismo de acción de la RCV.

Introducción

La dismenorrea primaria (EP) es la afección más prevalente en ginecología clínica. Se caracteriza por dolor de espalda, hinchazón, dolor abdominal o molestias antes o durante la menstruación sin patología pélvica en el aparato reproductor1. Un informe sobre su prevalencia mostró que el 85,7% de los estudiantes sufren de DP2. Los anticonceptivos orales de dosis bajas son la terapia estándar, pero sus efectos secundarios adversos, como la trombosis venosa profunda, han llamado cada vez más la atención3. La prevalencia de trombosis venosa profunda entre las usuarias de anticonceptivos orales es de >1 por cada 1.000 mujeres, y el riesgo es mayor durante los primeros 6-12 meses y en usuarias mayores de 40 años4.

Utilizado durante mucho tiempo en la medicina tradicional china (MTC), el rizoma Cyperi (CR) se deriva del rizoma seco del Cyperus rotundus L. de la familia Cyperaceae. La RC regula los trastornos menstruales y alivia la depresión y el dolor5. La RC es ampliamente utilizada en ginecología y es considerada una medicina general para tratar las enfermedades de la mujer6. La RC procesada con vinagre (CRV) se usa típicamente clínicamente. En comparación con la RC, la VCR muestra una mejor regulación de la menstruación y el alivio del dolor. Estudios modernos han demostrado que la RC inhibe la ciclooxigenasa-2 (COX-2) y la posterior síntesis de prostaglandinas (PGs), logrando así un efecto antiinflamatorio. Mientras tanto, la RC exhibe un efecto analgésico sin efectos secundarios7, haciendo de la RC una buena opción para los pacientes con dismenorrea. Sin embargo, el mecanismo subyacente a la regulación de la menstruación y la provisión de alivio del dolor por CRV no está claro. La investigación de la RC se ha centrado principalmente en los cambios en sus componentes químicos activos y actividades farmacológicas, como sus efectos antiinflamatorios, antidepresivos y analgésicos 8,9,10,11,12.

Aunque los ingredientes de la MTC son complejos, son absorbidos por la sangre y deben alcanzar una concentración sanguínea específica para ser efectivos13. El alcance de la detección de los ingredientes activos de la MTC se puede reducir utilizando la estrategia de determinación de constituyentes en la sangre. La ceguera puede evitarse en el estudio de los componentes químicos in vitro, y la unilateralidad puede evitarse en el estudio de los constituyentes individuales14. Al comparar las composiciones de RC y CRV en la sangre, los cambios en los ingredientes activos de la RC procesada se pueden detectar de manera efectiva y rápida. La eficacia del fármaco es el proceso por el cual un fármaco influye en el cuerpo. Los cambios en los componentes del fármaco debido a la respuesta metabólica del cuerpo, que pueden estar relacionados con el mecanismo de acción del fármaco, se pueden determinar con metabonómica. La metabonómica tiene como objetivo medir las respuestas metabólicas globales y dinámicas, lo que es consistente con la determinación de la eficacia general de la medicina tradicional china15. Además, los metabolitos son el producto final de la expresión génica, que está más estrechamente relacionada con los fenotipos16. Por lo tanto, la metabonómica puede ser adecuada para explorar las diferencias en las vías metabólicas entre la RC y la VRC en el tratamiento de la EP. La cromatografía líquida y la espectrometría de masas en tándem de alta resolución (LC-MS/MS) basada en la metabolómica no dirigida se caracteriza por un alto rendimiento, alta sensibilidad y alta resolución y se puede utilizar para medir muchos componentes moleculares pequeños diferentes17,18 . Este método puede determinar simultáneamente los metabolitos endógenos y los componentes exógenos absorbidos en la sangre. La metabonómica ha sido ampliamente utilizada en estudios sobre MTC19, toxicología de drogas20, manejo de la salud 21, deportes22, alimentos23 y otros campos.

En este estudio, las diferencias en los componentes exógenos absorbidos en la sangre y los metabolitos endógenos se midieron entre ratas modelo de dismenorrea tratadas con RC y tratadas con CRV utilizando metabolómica no dirigida basada en LC-MS / MS para revelar los mecanismos de los efectos analgésicos de CRV.

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Protocolo

Todos los experimentos relacionados con animales se llevaron a cabo con la aprobación del Comité de Ética de Experimentos del Instituto de MTC de Chongqing. En este experimento se utilizaron veinticuatro ratas hembras Sprague Dawley (SD) que tenían entre 8 y 10 semanas de edad y pesaban 200 g ± 20 g.

1. Preparación de la extracción

  1. Cálculo
    1. Planifique administrar el extracto de RC o CRV a un grupo de tratamiento de seis ratas Sprague-Dawley (10 g/[kg∙día]) durante 3 días. Use una concentración de extracto de CR o CRV de 1 g / ml (1 ml del extracto se obtiene de 1 g de hierbas).
      NOTA: La dosis de CR es de 6-10 g. En este estudio, la dosis máxima de 10 g se utilizó como dosis. Como el peso promedio de una persona adulta es de 60 kg, la dosis para adultos es de 0,1667 g / kg. Según el algoritmo de conversión de peso24, como el coeficiente de conversión de dosis entre humanos y ratas es de 6,3, la dosis para ratas es de 1,05 g/kg. La dosis del fármaco se incrementó 10 veces a 10,5 g/kg para ratas. La dosis se fijó en 10 g/kg para la conveniencia del cálculo y el experimento real. Por ejemplo, según el cálculo, si se necesita un total de 36 g de CR o CRV, la medicina herbal china debe prepararse al menos dos veces. Por lo tanto, se requirieron 200 g de RC: se utilizaron 100 g de RC como RC y 100 g de RC se procesaron en CRV.
    2. Calcule el volumen de RC o CRV a aplicar por rata utilizando la ecuación (1):
      V = 10 g/(kg∙día) × 200 g/(1 g/ml) = 2 ml (1)
  2. Tramitación del CRV
    1. Mezclar bien 100 g de CR y 20 g de vinagre (>5,5 g de ácido acético/100 mL) e incubar durante 12 h.
      NOTA: Para asegurarse de que el interior del CR se humedezca con vinagre después de 12 h, el CR y el vinagre se mezclaron, se agitaron bien y luego se agitaron nuevamente hasta que la porción interna estuviera húmeda.
    2. Saltear la mezcla en una sartén durante 10 min a 110-120 °C. Luego, saca la mezcla y déjala enfriar a temperatura ambiente.
      NOTA: Para evitar que el CR se queme, es necesario agitar continuamente mientras se calienta. Si el CRV procesado está demasiado húmedo, se puede secar a 60 °C. Cuando la superficie del CR es sepia, se puede detener el salteado.
  3. Extracción
    1. Extracto de CR
      1. Agregue 10 veces (la cantidad de CR) agua pura al CR y remoje durante 2 h. Asegúrese de que los materiales medicinales estén por debajo del nivel de líquido al remojar.
        NOTA: El CR solo necesita cortarse por la mitad antes de la extracción. El propósito del remojo es extraer los componentes activos de manera más efectiva. El proceso de remojo es esencial.
      2. Lleve la mezcla de agua y medicina a ebullición a fuego alto, y manténgala hirviendo a fuego lento durante 20 minutos. Filtrar con un paño filtrante (malla 100), y recoger el filtrado.
        NOTA: Al decoctar, se usó un calor alto antes de hervir y un calor bajo para mantener la ebullición.
      3. Repita el paso 1.3.1.2 una vez y combine los filtrados.
      4. Concentrar el extracto con un evaporador rotativo a 1 g/ml (según el medicamento original, la temperatura de concentración debe ser inferior a 60 °C).
        NOTA: Los componentes activos en CR son volátiles, por lo que la temperatura de concentración no debe ser superior a 60 ° C.
    2. Extracto de CRV
      1. Realice los mismos pasos (1.3.1.1-1.3.1.3) que para el método de extracción de RC.
    3. Extracto de CR para pruebas
      1. Pipetear 500 μL del extracto de CR y 500 μL de metanol en un tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, y vórtice durante 30 s para mezclar.
        NOTA: Una mezcla de metanol y agua extrae mejor los componentes activos. El extracto no debe filtrarse directamente para su análisis.
      2. Centrifugar cada muestra durante 15 min a 1,6502 × g a 4 °C. Filtre el sobrenadante y, a continuación, transfiéralo al vial de muestra para su análisis.
        NOTA: Después de la centrifugación a alta velocidad de la mezcla de metanol y extracto, el sobrenadante se puede transferir directamente a la botella de muestra para su determinación sin filtración. Debido al calor generado por el proceso de centrifugación, es preferible utilizar una centrífuga criogénica.
    4. Extracto de CRV para pruebas
      1. Realice los pasos 1.3.3.1-1.3.3.2 para preparar el extracto de CRV para la prueba.

2. Animales

  1. Cálculo
    1. Tome 50 mg de benzoato de estradiol y agréguelo a 50 ml de aceite de oliva para preparar una solución de 1 mg / ml. Tome 50 mg de oxitocina y agréguela a 50 ml de solución salina normal para preparar una solución de 1 mg / ml.
      NOTA: La dosis de la inyección intraperitoneal de benzoato de estradiol y oxitocina es de 10 mg/(kg∙día). El benzoato de estradiol se disuelve en el aceite de oliva y la oxitocina se disuelve en la solución salina normal. El benzoato de estradiol no es fácil de disolver en aceite de oliva y se puede tratar con ultrasonido para acelerar la disolución. Tanto el benzoato de estradiol como las soluciones de oxitocina deben prepararse diariamente.
    2. Calcular el volumen de solución de benzoato de estradiol que se aplicará por rata (es decir, V = 10 mg/[kg∙día] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml). Calcular el volumen de solución de oxitocina a aplicar por rata (es decir, V = 10 mg/[kg∙día] × 200 g/[1 g/ml] = 2 ml).
  2. Agrupación y administración de animales
    NOTA: Se asignaron diez días para la administración25,26. Durante el tratamiento, las ratas tuvieron acceso sin restricciones a comida y agua estándar. Dentro de los 30 minutos de la administración de oxitocina, se rastreó la actividad de retorcimiento de cada rata. El modelo de rata PD fue desarrollado con éxito, como lo demuestran las respuestas de torsión de las ratas modelo, que incluyeron contracción uterina, rotación de una extremidad, extensión de extremidades posteriores, tronco hueco y contracción abdominal26.
    1. Asigne 24 ratas Sprague-Dawley hembras (ratas SD, de 8 a 10 semanas de edad, con un peso de 200 g ± 20 g) en cuatro grupos al azar -control, modelo, CR y CRV- y aliméntelas durante 7 días.
    2. Administración de animales
      1. Inyectar intraperitonealmente ratas en los grupos modelo, CR y CRV con 2 ml de solución de benzoato de estradiol todos los días. Inyectar intraperitonealmente a las ratas en el grupo control con 2 ml de solución salina normal.
      2. A partir del día 8, complete el paso 2.2.2.1. Luego, administre por vía intragástrica 2 ml de extracto de CRV a las ratas en el grupo CRV, 2 ml de extracto de CR a las ratas en el grupo CR y 2 ml de solución salina normal a las ratas en los grupos control y modelo.
      3. El día 10, complete el paso 2.2.2.2. Luego, inyecte por vía intraperitoneal a las ratas en los grupos modelo, CR y CRV con 2 ml de solución de oxitocina y a las ratas en el grupo control con 2 ml de solución salina normal.
    3. Registre los tiempos de retorcimiento de las ratas dentro de los 30 minutos posteriores a la inyección de oxitocina.
  3. Recogida de muestras
    1. Recoja muestras de sangre de la aorta abdominal, extirpe el útero rápida y completamente, y separe cuidadosamente el tejido conectivo y la grasa que se adhieren a la pared uterina.
      NOTA: La sangre se recolectó tan cerca como dentro de 1 h después de la dosis final.
    2. Use tubos de microcentrífuga para preservar y transferir el tejido uterino a nitrógeno líquido. Conservar las muestras de tejido a -80 °C.
    3. Centrifugar las muestras de sangre durante 10 min a 4.125 × g. Retirar el sobrenadante que contiene suero y centrifugar a 16.502 × g durante 10 min a 4 °C. Centrifugar el suero y luego mantenerlo en el tubo a -80 °C para su almacenamiento.
      NOTA: Las muestras de sangre deben dejarse a temperatura ambiente durante 1 h para su reprocesamiento.
  4. Procesamiento de muestras
    1. Muestras de suero
      1. Poner 400 μL de metanol y 200 μL de suero en un tubo de microcentrífuga, y el vórtice durante 30 s para mezclar. Centrifugar cada muestra durante 15 min a 16.502 × g a 4 °C. Llene las botellas de muestra con el sobrenadante después de la recolección y filtración. Mezcle todos los sobrenadantes de cada muestra con el mismo volumen para preparar muestras de control de calidad para la prueba.
    2. Muestras de tejido uterino
      1. Tome 100 mg de tejido uterino del segmento ipsilateral y muélalo con un volumen nueve veces mayor de solución salina normal. Centrifugar el homogeneizado durante 10 min a 4.125 × g y recoger el sobrenadante. Coloque el sobrenadante en nevera a 4 °C para la prueba o a -80 °C si no se va a probar el mismo día.
      2. Coloque las bolas normales de solución salina, tejido y acero en un tubo de microcentrífuga de 2 ml, coloque el tubo de microcentrífuga en nitrógeno líquido durante 3-5 s y luego coloque el tejido en un molinillo de tejido para molerlo.
  5. Pruebas de muestra
    1. Utilice un ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas (ELISA) para medir el contenido de PGF2α y PGE2 en los tejidos uterinos de las muestras de rata.
      NOTA: El kit ELISA PGE 2 para ratas se utilizó para medir el contenido de PGE 2, y el kit ELISA PGF 2α de rata se utilizó para medir el nivel de PGF 2α. Los pasos detallados se pueden encontrar en las instrucciones del fabricante. Los detalles del kit se dan en la Tabla de materiales.
    2. Evalúe la muestra de suero, el extracto de CR y el extracto de CRV utilizando UPLC-MS / MS.
      1. Para UPLC, use una columna C18 (2.6 μm, 2.1 mm x 100 mm) y un método de gradiente binario con fase móvil A que contiene 0.1% de ácido fórmico y fase móvil B que contiene acetonitrilo. Establezca el gradiente de elución de la siguiente manera: de 0 min a 1 min, 15% B; de 1 min a 8.5 min, 15% a 85% B; de 8,5 min a 11,5 min, 85% B; de 11,5 min a 11,6 min, 99% a 1% B; y de 11,6 min a 15 min, 15% B. Ajuste el caudal a 0,35 mL/min y el volumen de inyección a 2 μL.
      2. Para MS, ajuste la temperatura a 600 °C, el caudal de gas cortina (CUR) a 0,17 MPa y los caudales de gas auxiliar y de cubierta a 0,38 MPa. Ajuste el voltaje de pulverización iónica del modo de iones positivos y el modo de iones negativos a 5.5 kV y −4.5 kV, respectivamente, el voltaje de potencial de desagrupamiento (DP) a 80 V o −80 V, la energía de colisión (CE) a 40 eV o −25 eV, y la superposición de energía de colisión (CES) a 35 eV ± 15 eV.
      3. Realice la prueba siguiendo el protocolo del fabricante utilizando UPLC-MS/MS. Realice MS para un rango de masa de 50-1,000 m/z.
      4. Obtenga los resultados de UPLC-MS/MS utilizando el programa de estación de trabajo correspondiente junto con la adquisición dependiente de la información del modo de detección, el filtro de defectos de masa múltiple y la deducción dinámica de fondo. Utilice las muestras de control de calidad de suero combinado para probar la repetibilidad y estabilidad del equipo UPLC-MS / MS para verificar el enfoque convencional. Antes de las muestras de investigación, inyecte las muestras de control de calidad durante cuatro series sucesivas y luego inyéctelas después de cada cinco muestras de suero.

3. Tratamiento de datos

  1. Preparación de datos
    1. Utilice software de conversión para convertir los datos sin procesar al formato mzXML. Normalizar los datos de corriente iónica total (TIC) de cada muestra.
      NOTA: Se utilizó una aplicación interna basada en R (www.lims2.com) basada en XCMS para analizar la información para la integración, alineación, extracción y detección de picos27.
    2. Realice anotaciones de metabolitos utilizando una base de datos MS2 patentada (www.lims2.com). Establezca el umbral de anotación en 0,328.
      NOTA: Los metabolitos endógenos fueron identificados en cada grupo.
  2. Análisis de componentes principales y análisis discriminante de mínimos cuadrados parciales ortogonales
    1. Utilice software de análisis para realizar el análisis de componentes principales (PCA) y el modelado. Importe los datos estandarizados de los metabolitos al software de análisis. A continuación, utilice el ajuste automático para crear el modelo de análisis. Finalmente, use la puntuación para obtener el gráfico de dispersión de puntuación de la PCA.
      NOTA: El agrupamiento de cada grupo se obtuvo con el diagrama de dispersión de puntuación del ACP. PCA es un modo de análisis no supervisado que agrupa principalmente las muestras a través de la reducción de dimensiones sin intervención.
    2. Utilice el software de análisis para realizar el análisis discriminante mínimo cuadrático parcial ortogonal (OPLS-DA).
      1. Importe los datos estandarizados sobre los metabolitos en los grupos CR y CRV en el software de análisis.
      2. Importe los datos del grupo CR al grupo CR creado e importe los datos del grupo CRV al grupo CRV creado.
        NOTA: OPLS-DA es un modo de análisis supervisado y es necesario agrupar las muestras.
      3. A continuación, utilice el ajuste automático para crear el modelo de análisis y utilice la puntuación para obtener la gráfica de dispersión de puntuaciones de la OPLS-DA. Finalmente, use VIP para obtener la significación variable en el valor de proyección (VIP) en el OPLS-DA.
        NOTA: La significación variable en los valores de proyección (VIP) de los metabolitos en los grupos CR y CRV se obtuvo a través del OPLS-DA.
  3. Identificación de los metabolitos diferenciales potenciales
    1. Descartar los metabolitos con valores VIP superiores a 1 en el paso 3.2.2.3.
    2. Utilice software estadístico para calcular el valor de p de los metabolitos que fueron eliminados en el paso 3.3.1 por la prueba t de Student.
      NOTA: Las diferencias significativas en los metabolitos diferenciales potenciales en los grupos de RC y CRV se determinaron mediante una prueba t de Student. Los metabolitos diferenciales potenciales fueron aquellos con un valor p de la prueba t de Student < 0,05 y una significación variable en la proyección (VIP) mayor que 1. La representación se logró utilizando una parcela volcánica.
  4. Identificación de los metabolitos diferenciales
    1. Eliminar los metabolitos diferenciales potenciales en el paso 3.3. Utilice los resultados del paso 3.1.2 para identificar estos metabolitos diferenciales.
      NOTA: Se identificó un pequeño número de metabolitos diferenciales potenciales, y se convirtieron en los metabolitos diferenciales candidatos.
    2. Descartar los metabolitos diferenciales para que coincidan en la base de datos KEGG. Muestre los cambios en los metabolitos diferenciales en los grupos CR y CRV dibujando un mapa de calor.
      NOTA: Se emparejó un pequeño número de metabolitos diferenciales candidatos y se convirtieron en los metabolitos diferenciales.
  5. Examen de las posibles vías metabólicas
    1. Cargue los diferentes metabolitos en la base de datos de Metaboanalyst (www.metaboanalyst.ca).
    2. Utilice el análisis de vías para obtener las posibles vías metabólicas.
      NOTA: Las vías metabólicas potenciales se obtuvieron en los grupos RC y CRV. El valor de p y el valor de impacto fueron dos indicadores muy importantes en la selección de las vías críticas. El valor de P fue más importante que el valor de impacto. La significancia fue definida por un valor de p < 0,05; Los valores de impacto más grandes se asociaron con mejores correlaciones.
    3. Analizar las posibles vías metabólicas cargando los diferentes metabolitos a la base de datos KEGG (http://www.kegg.jp/kegg/pathway.html).
      NOTA: También se debe considerar la relación entre la función de la vía metabólica y la EP. Se obtuvieron las vías metabólicas críticas.
  6. Identificación de los componentes absorbidos en la sangre
    1. Identifique los componentes químicos en los extractos de CR y CRV utilizando la base de datos interna MS2 (www.lims2.com), la base de datos de metaboloma humano (HMDB) y las bases de datos Massbank y Chemspider.
    2. Determinar los componentes absorbidos en la sangre en los grupos CR y CRV, y comparar los constituyentes entre los grupos CR y CRV.
      NOTA: Los componentes absorbidos en la sangre deben detectarse en los grupos CR o CRV, pero no pueden detectarse en el grupo control.
  7. Análisis estadístico
    1. Analizar los datos utilizando análisis univariado (UVA) y métodos estadísticos multivariados, incluyendo el análisis de varianza (ANOVA) y la prueba t de Student.
      NOTA: La información experimental se presentó utilizando software estadístico como media ± desviación estándar (±DE). P < 0,01 fue considerada una diferencia altamente significativa, y P < 0,05 representó una diferencia significativa28.

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Resultados

Análisis del experimento del modelo de dismenorrea
No hubo respuesta de retorcimiento dentro de los 30 minutos en el grupo de control porque estas ratas no fueron inyectadas intraperitonealmente con oxitocina y benzoato de estradiol para causar dolor. Las ratas en los grupos modelo, CR y CRV mostraron reacciones de retorcimiento sustanciales después de la inyección de oxitocina. Estos resultados demuestran la eficacia de la combinación de benzoato de estradiol y oxitocina para inducir dismenorrea. Las...

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Discusión

Debido a la amplia variedad y naturaleza diferente de las MTC, estas hierbas a veces no funcionan en la práctica clínica, y esto puede deberse al procesamiento y decocción inapropiados de las MTC. Los mecanismos de la MTC son cada vez más evidentes con el uso de la ciencia y la tecnología contemporáneas29,30. Este estudio muestra que tanto la RC como la CRV tienen efectos terapéuticos en ratas modelo de EP y que el efecto terapéutico de la CRV es más sustancial. ...

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Divulgaciones

Los autores declaran que no tienen intereses financieros contrapuestos.

Agradecimientos

Este trabajo fue apoyado por el Proyecto de Ciencia y Tecnología de Medicina China de la Comisión Municipal de Salud y Planificación Familiar de Chongqing (Número de proyecto: ZY201802297), Proyecto general de la Fundación de Ciencias Naturales de Chongqing (Número de proyecto: cstc2019jcyj-msxmX065), Característica del área montañosa moderna de Chongqing Plan de construcción de equipos de innovación del sistema de tecnología agrícola de alta eficiencia 2022 [10], y el Proyecto de construcción de disciplina clave de la Comisión Municipal de Salud de Chongqing de materia china Procesamiento de medicamentos.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Acetonitrilo Fisher Scientific, Pittsburg, Pensilvania, EE. UU.197164
BECKMAN COULTER Microfuge 20Beckman  Coulter, Inc.
benzoato de estradiolShanghai Macklin Biochemical Co., LtdC10042616
ácido fórmicoFisher Scientific, Pittsburg, PA, EE. UU. 177799
sistema LC 30AShimadzu, Kioto, Japón228-45162-46
Aceite de olivaShanghai Yuanye Biotechnology Co., LtdH25A11P111909
Oxitocina sintéticaBiología del péptido de Zhejiang Co., Ltd 
Rata PGF2α Kit de ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., Ltd202101
Rata PGFE2 Kit de ELISAShanghai lmai Bioengineering Co., LtdEDL202006217
SPF Ratas Sprague-Dawley HunanSJA Laboratory Animal Co., LtdNúmero de certificado SCXK (Hunan) 2019-0004
Tecan Infinite 200 PRO   Tecan Austria GmbH, Austria1510002987
Sistema Triple TOF 4600SCIEX, Framingham, MA, EE. UUBK20641402
aguaFisher Scientific, Pittsburg, PA, EE. UU. 152720
MRZ15K0472019092001.

Referencias

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