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Imágenes intravitales de la expresión de proteínas fluorescentes en ratones con una lesión cerebral traumática de cráneo cerrado y ventana craneal utilizando un microscopio de dos fotones

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DOI:

10.3791/64701

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21 de abril de 2023

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1Department of Neurology, University of Massachusetts Chan Medical School, 2Department of Neurosurgery, The First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, 3Department of Neurobiology, University of Massachusetts Chan Medical School

En este artículo

Resumen

Este estudio demuestra la administración de una lesión cerebral traumática repetitiva a ratones y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales de un EGFP expresado por neuronas mediante microscopía de dos fotones.

Resumen

El objetivo de este protocolo es demostrar cómo visualizar longitudinalmente la expresión y localización de una proteína de interés dentro de tipos celulares específicos del cerebro de un animal, tras la exposición a estímulos exógenos. En este trabajo se muestra la administración de un traumatismo craneoencefálico (TCE) cerrado y la implantación simultánea de una ventana craneal para la posterior obtención de imágenes intravitales longitudinales en ratones. A los ratones se les inyecta intracranealmente un virus adenoasociado (AAV) que expresa una proteína verde fluorescente mejorada (EGFP) bajo un promotor neuronal específico. Después de 2 a 4 semanas, los ratones se someten a una lesión cerebral traumática repetitiva utilizando un dispositivo de caída de peso sobre el lugar de inyección de AAV. Dentro de la misma sesión quirúrgica, a los ratones se les implanta un poste de cabeza de metal y luego una ventana craneal de vidrio sobre el sitio de impacto de la LCT. La expresión y localización celular de EGFP se examina utilizando un microscopio de dos fotones en la misma región cerebral expuesta a un trauma en el transcurso de meses.

Introducción

Las lesiones cerebrales traumáticas (TBI, por sus siglas en inglés), que pueden ser el resultado de lesiones deportivas, colisiones de vehículos y combates militares, son un problema de salud mundial. El TCE puede provocar déficits fisiológicos, cognitivos y conductuales, y discapacidad o mortalidad de por vida 1,2. La gravedad del TCE se puede clasificar en leve, moderada y grave, siendo la gran mayoría un TCE leve (75-90%)3. Cada vez se reconoce más que el TCE, en particular la ocurrencia repetitiva de TCE, puede promover la degeneración neuronal y servir como factores de riesgo para varias enfermedades neurodegenerativas, incluida la enfermedad de Alzheimer (EA), la esclerosis lateral amiotrófica (ELA), la demencia frontotemporal (DFT) y la encefalopatía traumática crónica (ETC)4,5,6. Sin embargo, los mecanismos moleculares que subyacen a la neurodegeneración inducida por LCT siguen sin estar claros y, por lo tanto, representan un área activa de estudio. Para obtener información sobre cómo las neuronas responden y se recuperan de un TCE, se describe aquí un método para monitorear proteínas de interés marcadas con fluorescencia, específicamente dentro de las neuronas, mediante imágenes intravitales longitudinales en ratones después de un TCE.

Con este fin, este estudio muestra cómo combinar un procedimiento quirúrgico para la administración de TCE de cráneo cerrado que es similar al descrito previamente7,8, junto con un procedimiento quirúrgico para la implantación de una ventana craneal para la imagen intravital posterior, según lo descrito por Goldey et al9. En particular, no es factible implantar primero una ventana craneal y posteriormente realizar un TCE en la misma región, ya que es probable que el impacto de la caída de peso que induce el TCE dañe la ventana y cause daños irreparables al ratón. Por lo tanto, este protocolo fue diseñado para administrar el TCE y luego implantar la ventana craneal directamente sobre el sitio del impacto, todo dentro de la misma sesión quirúrgica. Una ventaja de combinar el TCE y el implante de la ventana craneal en una sola sesión quirúrgica es la reducción del número de veces que un ratón se somete a cirugía. Además, permite monitorear la respuesta inmediata (es decir, en la escala de tiempo de horas) a la LCT, en lugar de implantar la ventana en una sesión quirúrgica posterior (es decir, las imágenes iniciales comienzan en una escala de tiempo de días después de la LCT). La ventana craneal y la plataforma de imagen intravital también ofrecen ventajas sobre la monitorización de proteínas neuronales mediante métodos convencionales como la inmunotinción de tejidos fijos. Por ejemplo, se requieren menos ratones para la obtención de imágenes intravitales, ya que el mismo ratón se puede estudiar en múltiples puntos de tiempo, a diferencia de las cohortes separadas de ratones necesarias para puntos de tiempo discretos. Además, las mismas neuronas pueden ser monitoreadas a lo largo del tiempo, lo que permite rastrear eventos biológicos o patológicos específicos dentro de la misma célula.

Como prueba de concepto, aquí se demuestra la expresión neuronal específica de la proteína fluorescente verde mejorada (EGFP) bajo el promotor de sinapsina10. Este enfoque puede extenderse a 1) diferentes tipos de células cerebrales mediante la utilización de otros promotores específicos del tipo de célula, como el promotor de la proteína básica de mielina (MBP) para los oligodendrocitos y el promotor de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) para los astrocitos11, 2) diferentes proteínas diana de interés mediante la fusión de sus genes con el gen EGFP, y 3) la coexpresión de múltiples proteínas fusionadas con diferentes fluoróforos. Aquí, el EGFP se empaqueta y se expresa a través de la administración de virus adenoasociados (AAV) a través de una inyección intracraneal. Se administra un traumatismo craneoencefálico cerrado mediante un dispositivo de caída de peso, seguido de la implantación de una ventana craneal. La visualización del EGFP neuronal se logra a través de la ventana craneal, utilizando microscopía de dos fotones para detectar la fluorescencia del EGFP in vivo. Con el láser de dos fotones, es posible penetrar más profundamente en el tejido cortical con un mínimo de fotodaño, lo que permite obtener imágenes longitudinales repetidas de las mismas regiones corticales dentro de un ratón individual durante días y hasta meses12,13,14,15. En resumen, este enfoque de combinar una cirugía de TCE con imágenes intravitales tiene como objetivo avanzar en la comprensión de los eventos moleculares que contribuyen a la patología de la enfermedad inducida por LCT16,17.

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Protocolo

Todos los protocolos relacionados con los animales se llevaron a cabo de acuerdo con la Guía para el Cuidado y Uso de Animales de Laboratorio publicada por el Comité del Consejo Nacional de Investigación (EE. UU.). Los protocolos fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Facultad de Medicina Chan (UMMS) de la Universidad de Massachusetts (Permiso Número 202100057). En resumen, como se muestra en el esquema del estudio (Figura 1), el animal recibe una inyección de virus, un TCE, una implantación de ventana y luego imágenes intravitales en una secuencia de tiempo.

NOTA: Se han eliminado los términos comerciales. Consulte la Tabla de materiales para conocer el equipo específico utilizado.

1. Inyección intracraneal de VAA con un dispositivo estereotáxico

  1. AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP
    1. Utilice un título viral de 1 x 1013 genomas virales por mililitro (vg/mL). Syn1 se refiere a Synapsin1, que es un promotor neuronal específico que permite una expresión viral restringida en las neuronas. El virus puede ser preparado internamente o subcontratado.
  2. Preparación para la cirugía de inyección estereotáxica para la administración de VAA
    1. Tijeras regulares de autoclave, un calibrador quirúrgico, tijeras quirúrgicas de resorte, pinzas quirúrgicas, pinzas para mosquitos, gasas, un aplicador con punta de algodón y una jeringa de microlitros de vidrio.
    2. Desinfecte el área de la cirugía con etanol al 75%. Expanda el paño quirúrgico estéril desechable para cubrir la región de la cirugía en la plataforma estereotáxica.
      NOTA: Para mantener la temperatura corporal del animal durante la cirugía de inyección, utilice un aparato de calentamiento regulado por retroalimentación.
    3. Pesa y registra el peso corporal del ratón.
    4. Abra la válvula del tanque de oxígeno y ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L/min. Abra la máquina de anestesia y ajuste el valor del nivel de isoflurano a tres.
      NOTA: El gas portador puede ser aire ambiente u oxígeno al 100% en este paso.
    5. Coloque el ratón en la cámara de inducción y déjelo reposar durante 5 minutos para lograr la anestesia completa.
    6. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y coloque la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
    7. Coloque el cono de la nariz del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón.
    8. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5%, con gas portador a un caudal de 1 L/min hasta el final de la cirugía. Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante la cirugía para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
    9. Llene una jeringa de microlitros (10 μL) con la solución de virus. Luego, fije la jeringa en la bomba de microinyector correspondiente del dispositivo estereotáxico.
  3. Cirugía de inyección
    1. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) con una jeringa de insulina desechable y aplicar una pomada oftálmica lubricante en los ojos del ratón.
    2. Retira el cabello del cuero cabelludo en la parte superior de la cabeza recortándolo con unas tijeras normales 1.
    3. Limpie la piel del cuero cabelludo con gasas y aplicadores con punta de algodón. Desinfectar la piel con etanol al 75% primero y luego betadine. Repita esto tres veces (es decir, etanol seguido de betadine), dejando la aplicación final de betadine en la piel.
    4. Vuelva a comprobar la profundidad de la anestesia para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola). Haga una incisión de ~ 1 cm con unas tijeras normales 2 a lo largo de la línea media para exponer el cráneo parietal derecho y retire el periostio con un aplicador con punta de algodón.
    5. Marque dos puntos en el cráneo con un rotulador en estas coordenadas: punto A: 2,5 mm posterior al Bregma y 1 mm lateral a la línea media sobre el hemisferio derecho; punto B: 2,5 mm posterior al Bregma y 2 mm lateral a la línea media sobre el hemisferio derecho.
    6. Taladre con cuidado dos agujeros a través del cráneo en las coordenadas marcadas con un taladro dental eléctrico con una broca fina de carburo EF4.
      NOTA: Tenga cuidado de no dañar el tejido cerebral.
    7. Ajuste el marco estereotáxico para alinear la punta de la aguja de la jeringa de microlitros con el orificio del cráneo que está 1 mm lateral a la línea media.
    8. Baje la aguja de la jeringa para tocar la superficie del cerebro y, a continuación, establezca esa ubicación como el punto cero (para el eje z). Baje la punta de la aguja en la corteza cerebral a una profundidad de 0,5 mm e infunda lentamente 1 μL de la solución viral a una velocidad de 200 nL/min.
    9. Espere 5 minutos después de que la solución del virus se inyecte completamente en el tejido cerebral antes de retirar la aguja para evitar el reflujo de la solución.
    10. Retire lentamente la aguja de la jeringa. Repita la inyección en el otro sitio. Suturar la incisión con una sutura quirúrgica estéril y no absorbible (calibre 6-0).
    11. Administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/mL, generalmente ~45 μL), por vía intramuscular] y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) después de la cirugía mientras el animal aún está anestesiado.
    12. Suelte el ratón del marco estereotáxico y suspenda la anestesia. Coloque al ratón en una jaula limpia sobre una manta térmica y vigile al animal hasta que esté ambulatorio (aproximadamente 15 min). Luego, transfiéralo a la jaula de origen.
    13. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) de nuevo a las 8 h, 16 h y 24 h, respectivamente, después de la primera inyección de buprenorfina.
      NOTA: A las 2-4 semanas después de la inyección del virus, el ratón recibe un TBI y la implantación de la ventana craneal en el mismo sitio que la inyección de AAV.

2. Administración de una inducción repetitiva de LCT

NOTA: Los parámetros del TCE se han ajustado con respecto a los informes anteriores7,8, en los que el impacto del TCE se entregó una vez. El protocolo aquí aplica el mismo parámetro, excepto que aumenta el número de impacto total a 10.

  1. Equipo de TBI
    1. Utilice un dispositivo portátil hecho a medida para la administración de un traumatismo craneoencefálico cerrado (Figura 2A) en la cabeza del ratón en el lado derecho, como se indica en la Figura 2B.
  2. Preparación antes de la cirugía
    1. Equipo quirúrgico de autoclave, que incluye tijeras regulares, un calibrador quirúrgico, tijeras quirúrgicas de resorte, pinzas quirúrgicas, pinzas para mosquitos, piezas para postes de cabeza, gasas y aplicadores con punta de algodón.
    2. Pesar y registrar el peso corporal del ratón 2 h antes de la cirugía. Para minimizar el edema cerebral durante la implantación de la ventana craneal, inyecte fosfato sódico de dexametasona a una dosis de 4,8 mg/kg [2 mg/ml, generalmente ~70 μl (es necesario inyectar en dos sitios)] en el músculo cuádriceps con una jeringa de insulina. Después de la inyección de dexametasona, pero antes de comenzar la cirugía de LCT, prepare las ventanas de vidrio como se indica en el paso 3.1 para su uso posterior.
    3. Desinfecte el escenario quirúrgico y el equipo de TBI con etanol al 75% y amplíe el paño quirúrgico estéril desechable para cubrir el escenario quirúrgico en la plataforma estereotáxica. Encienda el aparato de calefacción y el monitor de temperatura, ajustando la temperatura objetivo a 37 °C.
    4. Abra la válvula del tanque de oxígeno y ajuste el flujo de oxígeno a 1,5 L/min. Abra la máquina de anestesia y ajuste el valor del nivel de isoflurano a tres.
      NOTA: El oxígeno 100% puro puede ayudar al animal a sobrevivir a los impactos de una lesión cerebral traumática.
    5. Coloque el ratón en la cámara de inducción y déjelo reposar durante 5 minutos para lograr la anestesia completa.
    6. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y coloque la cabeza del ratón en el marco estereotáxico.
    7. Coloque el cono de la nariz del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón.
    8. Mantener la anestesia con isoflurano al 1,5% mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1 L/min hasta el final de la cirugía. Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante la cirugía para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
  3. Cirugía de LCT
    1. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) con jeringas de insulina desechables y aplicar pomada oftálmica en los ojos del ratón.
    2. Retire el vello de la parte superior de la cabeza recortando con unas tijeras 1 y luego aplicando un agente depilatorio durante 1 minuto.
      PRECAUCIÓN: No aplique el producto depilatorio durante más de 3 minutos en el cuero cabelludo, ya que es un irritante de la piel. Evite que cualquier agente depilatorio entre en contacto con los ojos del ratón.
    3. Limpie la piel del cuero cabelludo aplicando gasas y aplicadores con punta de algodón. Luego, desinfecte la piel, usando primero etanol al 75% y luego betadine. Repita esto tres veces (es decir, etanol seguido de betadine), dejando la aplicación final de betadine en la piel.
    4. Vuelva a comprobar la profundidad de la anestesia para asegurarse de que el ratón está completamente anestesiado (es decir, frecuencias respiratorias lentas pero constantes a aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola). Cubrir la piel con pinzas quirúrgicas 3 y hacer una incisión de 12-15 mm de largo en la línea media a partir de aproximadamente 3 mm posteriores a los ojos.
    5. Extirpe la piel sobre el hemisferio izquierdo y derecho del cráneo con unas tijeras de resorte 2.
    6. Una vez que el cráneo esté expuesto, retire el periostio frotando suavemente con un aplicador estéril con punta de algodón y enjuagando con solución salina estéril.
    7. Inspeccione visualmente el estado del cráneo para asegurarse de que esté intacto, a excepción de los dos pequeños orificios, que se hicieron para la cirugía de inyección de virus anterior.
    8. Secar la zona del cráneo y marcar el lugar del impacto del TCE en las siguientes coordenadas: 2,5 mm posterior al Bregma y 2 mm lateral desde la sutura sagital hacia la derecha (Figura 2B).
    9. Retire rápidamente el mouse del marco estereotáxico y coloque la cabeza en el cojín amortiguador debajo del dispositivo TBI.
    10. Alinee la punta del impactador con el sitio de impacto marcado.
    11. Levante la columna de metal tirando de la cuerda de nailon atada a 15 cm por encima de la cabeza del ratón y luego suéltela, permitiendo que el peso caiga libremente sobre la varilla del transductor, que está en contacto con la parte superior del cráneo en el sitio del TBI. No toque la cabeza del ratón cuando realice el impacto de la lesión cerebral traumática.
    12. Mueva el mouse sobre la manta térmica y colóquela boca arriba mientras monitorea el estado de la respiración.
    13. Una vez que el ratón pase de una posición supina a una posición prona, coloque el ratón en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 minutos con isoflurano al 3% mezclado con oxígeno puro al 100% a un caudal de 1,5 L/min.
    14. Una vez que el ratón esté completamente sedado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), repita los pasos 2.3.9-2.3.14 para lograr un total de 10 impactos.
      NOTA: En nuestro estudio, se han encontrado diez impactos de TCE que inducen un fenotipo robusto con baja mortalidad en ratones (datos aún no publicados). Los parámetros pueden ajustarse para lograr una gravedad diferente de la lesión cerebral aumentando o disminuyendo el número de impactos y/o la altura a partir de la cual se libera el peso. Todos los parámetros están sujetos a la aprobación de la IACUC local.
    15. Revise el cráneo bajo un microscopio quirúrgico y retire al ratón del estudio si se ha producido una fractura de cráneo.
    16. Para una cirugía simulada, siga los mismos procedimientos descritos anteriormente, incluida la colocación del animal debajo del impactador, pero sin administrar los impactos de la LCT.
    17. Después de que el ratón pase de una posición supina a una posición prona después del10º impacto de TBI, coloque el ratón en la cámara de inducción de isoflurano durante ~ 5 min. Siga los pasos 2.2.6-2.2.8 para colocar la cabeza del ratón en el marco estereotáxico para la cirugía de implantación de ventana craneal que se describe a continuación.

3. Cirugía de implantación de ventana craneal

NOTA: Los pasos de implantación de la ventana craneal que se indican a continuación se adoptaron de Goldey et al.9, y aquí se aplicaron sus especificaciones del poste de la cabeza y el pocillo de imagen.

  1. Preparación de la ventana
    NOTA: Complete la preparación de la ventana en el paso 2.2.2 antes de comenzar la cirugía de TBI. La ventana está formada por dos cubreobjetos redondos de vidrio (uno de 3 mm y otro de 5 mm de diámetro, como se indica en la Figura 2C) que se unen entre sí mediante adhesivo óptico transparente, como se describe a continuación.
    1. Desinfecte los cubreobjetos de vidrio sumergiéndolos en etanol al 75% durante 15 min. Saque las cubiertas de vidrio del etanol y déjelas secar sobre una superficie estéril (es decir, la tapa de una placa estéril de 24 pocillos) durante ~ 10 minutos.
    2. Llene una jeringa de insulina con pegamento óptico transparente evitando la formación de burbujas. Bajo el microscopio 1 (Tabla de materiales) con un aumento de 0,67x, coloque una pequeña gota (~1 μL) de pegamento óptico en el centro del cubreobjetos de 5 mm. Luego, coloque inmediatamente el cubreobjetos de 3 mm en la parte superior y céntrelo con el cubreobjetos de 5 mm.
    3. Aplique presión suavemente con pinzas finas para esparcir el pegamento de manera uniforme. Deseche la ventana de vidrio si se forma una burbuja o pared alrededor del cubreobjetos de 3 mm.
    4. Para curar el pegamento, coloque los cubreobjetos en una caja UV durante 150 s a una potencia de 20 x 100 μJ/cm2. Compruebe que los dos cubreobjetos estén bien unidos, utilizando unas pinzas 4 para empujar suavemente el lateral del portaobjetos de 3 mm. Si el cubreobjetos se mueve, vuelva a colocarlo en la caja UV durante 60 segundos más. Guarde la ventana de vidrio en una placa estéril de 24 pocillos para su uso posterior.
  2. Raspar la superficie del cráneo.
    NOTA: A partir de aquí, realice todos los pasos de la sección 3 bajo un microscopio quirúrgico. Comience con 10x y ajústelo al aumento deseado.
    1. Taladre suave y lentamente la superficie del cráneo con una broca de carburo FG4 a una velocidad de rotor baja (es decir, el número de salida establecido en ~ 1-2) para eliminar el periostio restante y crear una superficie rugosa del cráneo, de modo que el cemento dental se una de forma segura con el cráneo. También se puede utilizar un bisturí en lugar de un taladro como alternativa.
    2. Use solución salina para enjuagar y eliminar el polvo óseo de la superficie del cráneo.
  3. Separa los músculos.
    NOTA: La separación muscular sirve para aumentar el área de superficie del hueso del cráneo expuesto que servirá como punto de contacto para el cemento dental, asegurando así la integridad estructural del implante. Este paso de separación muscular generalmente expone ~ 3 mm de la placa temporal del cráneo.
    1. Aproximadamente a 5 mm por detrás del ojo, donde se encuentra la sutura que conecta el cráneo parietal y temporal, inserte suavemente las puntas finas cerradas (pinzas # 5/45) para separar los músculos laterales del cráneo, y mueva suavemente las puntas cerradas en la dirección posterior hasta la sutura lambdoidea.
    2. Separe los músculos laterales en el lado donde se producirá la implantación de la ventana craneal.
      NOTA: Tenga cuidado de no separar los músculos demasiado cerca del ojo, para evitar lesionar la arteria oftálmica; de lo contrario, puede producirse una hemorragia grave y persistente. No separe los músculos del hueso occipital, ya que el ratón necesita estos músculos para levantar la cabeza.
    3. Lave los residuos del sitio quirúrgico con solución salina y seque el área con una gasa. Se puede aplicar espuma de gel en el sitio quirúrgico para detener el sangrado.
  4. Implante el poste de la cabeza.
    1. Utilice un poste de titanio hecho a medida (Figura 2D), descrito en una publicación anterior9, para fijar la cabeza del ratón de forma segura mientras se realiza la cirugía de craneotomía y para la obtención posterior de imágenes de dos fotones.
    2. Use un rotulador y un calibrador quirúrgico para trazar la circunferencia de la craneotomía en el cráneo limpio y seco del lado derecho. El punto central del círculo trazado está a 2,5 mm posterior al Bregma y a 1,5 mm de la sutura sagital en el hemisferio derecho. El diámetro del círculo trazado es de unos 3,2-3,5 mm, ligeramente mayor que el cubreobjetos de vidrio de 3 mm. Asegúrese de que el círculo de craneotomía pueda cubrir los sitios de inyección del virus (los dos orificios hechos durante la inyección del virus se pueden usar como referencia) y el sitio de la lesión cerebral traumática.
    3. Afloje la barra de la oreja y gire la cabeza para que el plano de la craneotomía quede perfectamente horizontal, y luego apriete la barra de la oreja nuevamente.
    4. Use la barra de madera de un aplicador con punta de algodón para agregar dos pequeñas gotas de superpegamento en el borde delantero y trasero del poste de la cabeza.
    5. Coloque el poste de titanio sobre el centro de la craneotomía y ajústelo rápidamente para que descanse dentro del mismo plano donde se implantará la ventana craneal. Aplique una ligera presión hasta que el superpegamento se seque; Esto suele tardar ~30 s.
    6. Prepare el cemento dental en una fuente de mezcla de cerámica preenfriada (permaneciendo al menos 10 minutos en un congelador a -20 ° C): combine 300 mg de cemento en polvo, seis gotas de líquido base rápida y una gota de catalizador, y luego revuelva la mezcla hasta que esté bien mezclada (~ 15 veces).
      NOTA: El cemento debe ser pastoso. Si está demasiado diluido, agregue un poco más de cemento en polvo. Si está demasiado espeso, agregue el líquido base rápido una gota a la vez hasta lograr una consistencia pastosa.
    7. Aplique rápidamente una cantidad generosa de mezcla de cemento dental en el perímetro exterior de la circunferencia trazada y cubra cualquier superficie ósea expuesta. Sin embargo, no cubra el sitio de la craneotomía. Espere ~ 15 minutos para que el cemento dental se seque y se endurezca antes de continuar.
    8. Suelte la barra de la oreja y asegure el poste de la cabeza al marco de metal para asegurarse de que la cabeza sea estable para una perforación precisa a lo largo de la circunferencia de craneotomía marcada. Si hay cemento sobre el sitio de la craneotomía, use la broca de carburo FG4 para perforarlo y eliminarlo.
  5. Craneotomía
    1. Utilice un calibrador quirúrgico para verificar el diámetro del círculo marcado, como se define en el paso 3.4.2. Ajústelo según sea necesario, de modo que la ventana craneal encaje perfectamente dentro de la craneotomía.
    2. Con un taladro dental eléctrico, grabe y adelgace el cráneo a lo largo del exterior del círculo marcado, usando primero una broca de carburo FG4 (velocidad establecida en una de salida ~ 9-10). Esto crea una "pista" dentro de la cual se adelgaza el cráneo.
      PRECAUCIÓN: Para minimizar las lesiones por calor y lograr una pista lisa, siga moviendo la broca. No taladre en el mismo lugar durante más de 2 s.
    3. Periódicamente, deje de perforar e riegue toda el área con solución salina estéril, para reducir el calentamiento del taladro y eliminar el polvo óseo.
    4. Continúe adelgazando el cráneo con una broca de carburo FG1/4, como se describe en el paso 3.5.2, hasta que el cráneo sea delgado como el papel y transparente.
      NOTA: Usar las dos manos para sostener el taladro puede facilitar el control del taladro y evitar insertar la broca en el cerebro.
    5. Complete el adelgazamiento del cráneo con una broca de carburo EF4. Cuando se produce una grieta entre el colgajo óseo y el hueso del cráneo circundante, a veces se produce una liberación de líquido cefalorraquídeo (LCR), lo que indica que el cráneo ha sido perforado por completo.
    6. Continúa adelgazando y perforando el resto del cráneo a lo largo de la pista. Evite perforar el punto donde una vasculatura obvia cruza debajo del cráneo para evitar el sangrado.
    7. Inserte una punta fina de pinza (pinza 1) ~ 0,5 mm a través del lugar agrietado y levante el colgajo óseo suavemente hacia arriba sin hacer mella en el cerebro subyacente.
    8. Después de retirar el colgajo óseo, irrigar el área de la craneotomía con solución salina. La superficie del cerebro podría ser de 1 a 2 mm más alta que el borde de la craneotomía.
    9. A partir de este paso, cubra siempre el cerebro expuesto con solución salina para proteger el tejido cerebral.
    10. El sangrado puede ocurrir al levantar el colgajo óseo en los sitios originales de inyección de AAV debido a la adhesión del tejido y el crecimiento de la vasculatura después de la cirugía de inyección. Si esto sucede, presione suavemente el sitio con un aplicador seco con punta de algodón durante ~ 2 minutos (o más según sea necesario). Se puede usar espuma de gel para detener el sangrado. No use productos químicos ni pinzas de calentamiento para detener el sangrado, ya que esto puede causar lesiones.
    11. Use las pinzas 1 para eliminar suavemente la materia aracnoidea visible.
  6. Ventana de vidrio para implantes
    1. Utilice las pinzas quirúrgicas 2 para levantar la ventana de vidrio estéril, con el cubreobjetos de vidrio de 3 mm hacia abajo. Coloque y ajuste la ventana de vidrio sobre el sitio de la craneotomía para asegurarse de que la ventana pueda ajustarse perfectamente al borde de la craneotomía. El cubreobjetos de vidrio de 5 mm está en la parte superior.
    2. Prepare el cemento dental de la siguiente manera: combine 100 mg de cemento en polvo, dos gotas de líquido base rápida y una gota de catalizador. Revuelva la mezcla hasta que esté bien mezclada (~ 15 veces). Espere ~ 6 minutos hasta que el cemento se vuelva pastoso y espeso. Si el cemento es demasiado delgado, puede filtrarse en el espacio debajo de la ventana en el paso 3.6.4 y oscurecer la ventana.
    3. Mientras espera que el cemento se vuelva pastoso y espeso, aplique una cantidad adecuada de presión a la ventana a través de un manipulador estereotáxico, para verificar que el cráneo pueda entrar en contacto de manera segura y hermética con la ventana de vidrio. Asegúrese de que el líquido de cemento dental en el paso 3.6.4 no llegue al espacio debajo del vidrio y, por lo tanto, oscurezca la ventana.
    4. Use un cepillo aplicador de precisión ajustable para agregar una pequeña cantidad de cemento a lo largo del borde de la ventana para sellar la ventana de vidrio con la calavera. Espere ~ 10 minutos para que el cemento se seque por completo y luego suelte suavemente y retire el manipulador sobre la ventana. A partir de este paso, se necesitan ~ 4 h para terminar los 10 impactos de TBI e implantar el poste de la cabeza y la ventana craneal.
    5. Recorte el cemento dental con el taladro dental con una broca de carburo FG4 si hay exceso de cemento cubriendo la ventana.
      NOTA: El exceso de cemento alrededor de la ventana puede evitar que las lentes del objetivo de dos fotones se acerquen a la superficie de la ventana.
  7. Implantar bien la imagen
    NOTA: Un pocillo de imágenes (Figura 2D) es un anillo de goma con un diámetro exterior de ~1,6 cm, que coincide con la superficie superior del poste de la cabeza y retiene el agua por encima de la ventana craneal para la obtención de imágenes de dos fotones.
    1. Una vez completada la implantación de la ventana, taladre los restos de cemento dental en la superficie superior del poste de la cabeza y limpie el área con una gasa quirúrgica húmeda. Deje que el área se seque durante ~ 3 minutos.
    2. Use un aplicador con punta de algodón para mojar una pequeña cantidad de superpegamento y pegarlo en la superficie superior del poste de la cabeza. Coloque rápidamente el anillo de goma en el poste de la cabeza. Aplique una presión media sobre el anillo de goma durante ~ 2 minutos para garantizar un contacto cercano con el poste de la cabeza. Use superpegamento con moderación, de lo contrario, puede adherirse a la ventana de vidrio y oscurecer la imagen de dos fotones.
  8. Administración de analgésicos y antibióticos
    1. Inmediatamente después de implantar el pozo de imagen, pero antes de suspender el isoflurano, administrar cefazolina [500 mg/kg (333 mg/ml, generalmente ~45 μl), por vía intramuscular] y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) utilizando jeringas de insulina desechables.
    2. Después de la administración del medicamento, suspenda la anestesia, libere al ratón del marco estereotáxico y devuélvalo a su jaula de origen, que está encima de una manta térmica.
    3. Vigile de cerca el ratón durante ~15 minutos hasta que sea ambulatorio.
      NOTA: Aloje a los ratones individualmente, ya que pueden morder el pozo de imágenes de goma de otros ratones. Proporcione comida y gel de agua cerca del ratón en la jaula para que pueda acceder a él ad libitum.
    4. Administrar buprenorfina (1 mg/kg, por vía subcutánea) y meloxicam (5 mg/kg, por vía subcutánea) de nuevo cada 8 h después de la dosis anterior hasta 48 h después de la cirugía de implante de ventana craneal.

4. Imágenes intravitales de dos fotones

  1. Utilice el microscopio 2 (Tabla de Materiales), equipado con un láser multifotónico coherente sintonizable y un objetivo de aumento de 20x (NA 1.0; inmersión en agua), para obtener imágenes intravitales18. El filtro utilizado para la señal EGFP es "BP 500-550".
  2. Prepare el ratón de ventana craneal para la obtención de imágenes intravitales.
    1. A partir del día de la cirugía (designado como día 0), lleve a cabo imágenes de dos fotones en los puntos de tiempo designados después de la lesión cerebral traumática. Coloque el ratón de ventana craneal en la cámara de inducción de anestesia y administre isoflurano al 3% mezclado con gas portador a un caudal de 1,5 L/min durante 5 min.
      NOTA: El gas portador puede ser aire ambiente u oxígeno al 100%.
    2. Una vez que el ratón esté completamente anestesiado (es decir, con una frecuencia respiratoria lenta pero constante de aproximadamente un ciclo cada 2 s, junto con la ausencia de un reflejo de pellizco de cola), retire el ratón de la cámara de inducción y sujete rápidamente el poste de la cabeza a un soporte. Deje que el torso del ratón se apoye en una placa de plástico redonda (19 cm de diámetro) que esté equipada con el soporte.
      NOTA: Se colocó una almohadilla para calentar las manos debajo del torso del mouse para proporcionar soporte térmico durante la obtención de imágenes intravitales.
    3. Aplique un ungüento oftálmico lubricante en los ojos del ratón y coloque el cono nasal del tubo de anestesia sobre el hocico del ratón. Mantenga la anestesia mediante el uso de isoflurano al 1,5% con gas portador a un caudal de 1 L/min.
    4. Verifique periódicamente la frecuencia de la respiración y aplíquele un pellizco en la cola o en los dedos de los pies al menos cada 15 minutos durante las imágenes para evaluar la anestesia adecuada. Ajuste la concentración de isoflurano según corresponda para mantener la profundidad deseada de la anestesia.
    5. Alinee la cabeza del ratón para asegurarse de que la ventana craneal esté directamente debajo de la lente del objetivo de dos fotones. Agregue un poco de agua a la imagen muy por encima de la ventana craneal. Baja el objetivo para que quede sumergido en el agua.
  3. Obtención de imágenes intravitales de ratones ventana intracraneal
    1. Encienda la lámpara de mercurio del osciloscopio. Observa primero el cerebro con epifluorescencia a través del ocular.
      NOTA: La vasculatura aparece de color negro. Seleccione un área en la que la ventana esté despejada. Apague la epifluorescencia, ajuste la longitud de onda del láser a 860 nm para la señal EGFP y ajuste la configuración del láser para obtener una señal óptima (es decir, brillante pero no saturada).
    2. Establezca el modo de escaneo en Fotograma y el paso de línea en 1. Establezca el número de promedio en 16, la profundidad de bits en 8 bits, el modo como Line y el método como Mean.
    3. Utilice el patrón de vasculatura como un "mapa de referencia" para obtener imágenes de la misma región del cerebro para obtener imágenes longitudinales posteriores. Imagine el nivel superficial (capa I, a menos de 100 μm de la superficie meníngea) para tres planos donde la vasculatura cortical domina a través de un modo de pila z, con un intervalo interplano de 10 μm, como se indica en la Figura 3A.
    4. Obtenga imágenes de seis planos a nivel profundo (capa IV y V, ~400 μm más profundo que el nivel superficial), a través de un modo de apilamiento z como se indica en la Figura 3A, con un intervalo entre planos de 10 μm y una velocidad de escaneo de 8.
    5. Después de terminar la imagen (~ 20 minutos por mouse), suspenda la anestesia, suelte al mouse de los marcos y devuélvalo a su jaula de origen que está sobre una manta térmica. Monitoree el mouse consecutivamente hasta que sea ambulatorio, lo que generalmente toma ~ 7 minutos.
    6. Tome imágenes longitudinales del ratón en el día 0, 1 semana y 4 meses después de la cirugía de LCT.

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Resultados

Como prueba de concepto de este protocolo, se inyectaron partículas virales que expresan AAV-Syn1-EGFP en la corteza cerebral de ratones machos TDP-43 Q331K/Q331K (fondo C57BL/6J)19 a la edad de 3 meses. Se observa que también se pueden utilizar animales salvajes C57BL/6J, sin embargo, este estudio se llevó a cabo en ratones TDP-43 Q331K/Q331K porque el laboratorio se centra en la investigación de enfermedades neurodegenerativas. Se realizó una cirugía de LCT 4 semanas despué...

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Discusión

En este estudio, se combinaron la inyección de AAV, la administración de TBI y un poste de cabeza con implante de ventana craneal para el análisis de imágenes longitudinales de neuronas marcadas con EGFP dentro de la corteza cerebral del ratón (capas IV y V) para observar los efectos de TBI en las neuronas corticales. Este estudio señala que el sitio de TCE elegido aquí, por encima del hipocampo, proporciona una superficie relativamente plana y amplia para la implantación de la ventana craneal. Por el contrario, el cráne...

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Divulgaciones

No se declaran conflictos de intereses.

Agradecimientos

Agradecemos al Dr. Miguel Sena-Esteves, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por regalar el virus AAV(PHP.eB)-Syn1-EGFP, y a Debra Cameron, de la Facultad de Medicina Chan de la Universidad de Massachusetts, por dibujar el boceto del cráneo de los ratones. También agradecemos a los miembros actuales y pasados de los laboratorios Bosco, Schafer y Henninger por sus sugerencias y apoyo. Este trabajo fue financiado por el Departamento de Defensa (W81XWH202071/PRARP) para DAB, DS y NH.

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Materiales

Lista de materiales utilizados en este artículo
NombreEmpresaNúmero de catálogoComentarios
Cepillos aplicadores de precisión ajustablesParkellS379
BD jeringa de insulinaBDNDC/HRI#08290-3284-385/16" x 31G
BetadinePurdueNDC67618-151-17que incluye povidona yodada al 7,5%
BuprenorfinaPAR FarmacéuticaNDC 42023-179-05
CefazolinaHIKMA FarmacéuticaNDC 0143-9924-90
Plato mezclador de cerámicaParkellSKU: S387Para la preparación de cemento dental
Aplicadores con punta de algodónZOROcatlog #: G9531702
CatalystParkellS371nombre completo: "C" Universal TBB Catalyst Polvo
cemento dentalParkellS396Radiopaque L-Powder para C& B Metabond
Taladro dentalForedomH.MH-130
Controlador de taladro dentalForedomHP4-310
DexametasonaPhoenixNDC 57319-519-05
Broca de carburo EF4MicrocopiadorLote# C150113Diámetro de la cabeza/Lgth/mm 1.0/4.2
EthonalFisher Scientific04355223EA75%
FG1/4 broca de carburomicrocopia# C150413Diámetro de la cabeza/Lgth/mm 0.5/0.4
Broca de carburo FG4 Lote demicroscopio# C150309Diámetro de la cabeza/Lgth/mm 1.4/1.1
Poste de la cabezaN/AN/AAparato de calefacción hecho a medida
CWETC-1000 Ratónequipado con el instrumento estereotáxico y que se utiliza durante la cirugía
de funcionamiento Manta calefactoraCVS pharmacyE12107dispositivo de calentamiento adicional y ser utilizado después de la cirugía
IsofluranoPivetalNDC 46066-755-03
Cámara de inducción de isofluranoVetequip89012-688 cámara deinducción para corto
Máquina volatilizadora de isofluranoVetequip911103
Soporte para máquina de volatilización de isofluranoVetequip901801
Microscopio quirúrgico LeicaLEICA 10450243
Ungüento oftálmico lubricantePicetalNDC 46066-753-55
RotuladorDelascoSMP-BK
MeloxicamNorbrookNDC 55529-040-10
Bomba de microinyección y su controladorWorld Precision Instrumentsmicro4 y UMP3
Jeringa de microlitroHamiltonHamilton 800141701 RN, 10 μ Calibre L para jeringa y calibre 32 para aguja, 2 pulgadas, estilo de punta 3
Pinzas antimosquitosCAROLINAArticulo #:625314Acero inoxidable, curvo, 5 pulgadas
Agente depilatorioMcKesson CorporationN/ANair Hair Aloe & Loción depilatoria de lanolina
Microscopio 1NikonSMZ745Microscopio Nikon para la preparación de la ventana craneal
Microscopio 2Microscopio de dos fotonesZeissLSM 7 MP
Láser multifotónico CoherenteChameleon Ultra II, Modelo: MRU X1, láser VERDI 18Wpara microscopía de dos fotones
Sutura quirúrgica no absorbibleHarvard Apparatuscatlog# 59-68606-0, con aguja redonda
Norland Optical Adhesive 81Norland ProductsNOA 81
Soporte de aguja antiengancheCAROLINAArticulo #: 567912
Base rápida líquidaParkellS398"B" Base rápida para C& B Metabond
Tijera regular 1Eurostateurostat ES5-300
Tijera regular 2World Precision InstrumentsN° 501759-G
Cubreobjetos redondos 1Warner instrumentsCS-5R Cat# 64-0700para 5 mm de diámetro
Cubreobjetos redondos 2Warner instrumentsCS-3R Cat# 64-0720para 3 mm de diámetro
Anillos degomaArtículo# OO-014-70-50Juntas tóricas solución
salinaBioworld L19102411PR
tijera de resorte 1World Precision InstrumentsNº 91500-09punta recta
Tijera de muelle 2World Precision InstrumentsNº 91501-09punta curva
Plataforma estereotáxicaKOPFModelo 900LS
Súper pegamentoHenkelArticulo #: 1647358
quirúrgico CalibradorWorld Precision InstrumentsNo. 501200
Pinzas quirúrgicas 1CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICACatlog# 0508-5/45-POestilo 5/45, curvo
Pinza quirúrgica 2CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICACatlog# 0103-5-POestilo 5, recto
Pinza quirúrgica 3CIENCIAS DELA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICAcatlog# 72912
Pinza quirúrgica 4CIENCIAS DE LA MICROSCOPÍA ELECTRÓNICACatlog# 0508-5/45-POestilo 5/45, curvo
Gasa quirúrgicaZOROcatlog #: G0593801
Lámpara quirúrgicaLeicaLeica KL300 LED
Caja UVSpectrolinkerXL-1000también llamado reticulante UV
VaporguardVetequip931401
Adhesivo para tejidos Vetbond3M Animal CareNúmero de pieza:014006
de Lote de

Referencias

  1. Bowman, K., Matney, C., Berwick, D. M. Improving traumatic brain injury care and research: a report from the National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. JAMA. 327 (5), 419-420 (2022).
  2. National Academies of Sciences, Engineering, and Medicine. Traumatic Brain Injury: A Roadmap for Accelerating Progress. , The National Academies Press. (2022).
  3. Xu, X., et al. Repetitive mild traumatic brain injury in mice triggers a slowly developing cascade of long-term and persistent behavioral deficits and pathological changes. Acta Neuropathologica Communications. 9 (1), 60(2021).
  4. Chen-Plotkin, A. S., Lee, V. M. Y., Trojanowski, J. Q. TAR DNA-binding protein 43 in neurodegenerative disease. Nature Reviews Neurology. 6 (4), 211-220 (2010).
  5. Mackenzie, I. R., Rademakers, R., Neumann, M. TDP-43 and FUS in amyotrophic lateral sclerosis and frontotemporal dementia. The Lancet. Neurology. 9 (10), 995-1007 (2010).
  6. McKee, A. C., et al. The first NINDS/NIBIB consensus meeting to define neuropathological criteria for the diagnosis of chronic traumatic encephalopathy. Acta Neuropathologica. 131 (1), 75-86 (2016).
  7. Henninger, N., et al. Attenuated traumatic axonal injury and improved functional outcome after traumatic brain injury in mice lacking Sarm1. Brain. 139, 1094-1105 (2016).
  8. Bouley, J., Chung, D. Y., Ayata, C., Brown, R. H., Henninger, N. Cortical spreading depression denotes concussion injury. Journal of Neurotrauma. 36 (7), 1008-1017 (2019).
  9. Goldey, G. J., et al. Removable cranial windows for long-term imaging in awake mice. Nature Protocols. 9 (11), 2515-2538 (2014).
  10. Kugler, S., et al. Neuron-specific expression of therapeutic proteins: evaluation of different cellular promoters in recombinant adenoviral vectors. Molecular and Cellular Neurosciences. 17 (1), 78-96 (2001).
  11. von Jonquieres, G., et al. Glial promoter selectivity following AAV-delivery to the immature brain. PLoS One. 8 (6), 65646(2013).
  12. Trachtenberg, J. T., et al. Long-term in vivo imaging of experience-dependent synaptic plasticity in adult cortex. Nature. 420 (6917), 788-794 (2002).
  13. Mostany, R., et al. Altered synaptic dynamics during normal brain aging. The Journal of Neuroscience. 33 (9), 4094-4104 (2013).
  14. Yang, Q., Vazquez, A. L., Cui, X. T. Long-term in vivo two-photon imaging of the neuroinflammatory response to intracortical implants and micro-vessel disruptions in awake mice. Biomaterials. 276, 121060(2021).
  15. Stosiek, C., Garaschuk, O., Holthoff, K., Konnerth, A. In vivo two-photon calcium imaging of neuronal networks. Proceedings of the National Academy of Sciences. 100 (12), 7319-7324 (2003).
  16. Grutzendler, J., Gan, W. B. Two-photon imaging of synaptic plasticity and pathology in the living mouse brain. NeuroRx. 3 (4), 489-496 (2006).
  17. Isshiki, M., et al. Enhanced synapse remodelling as a common phenotype in mouse models of autism. Nature Communications. 5, 4742(2014).
  18. Mondo, E., et al. A developmental analysis of juxtavascular microglia dynamics and interactions with the vasculature. The Journal of Neuroscience. 40 (34), 6503-6521 (2020).
  19. White, M. A., et al. TDP-43 gains function due to perturbed autoregulation in a Tardbp knock-in mouse model of ALS-FTD. Nature Neuroscience. 21 (4), 552-563 (2018).
  20. Chou, A., et al. Inhibition of the integrated stress response reverses cognitive deficits after traumatic brain injury. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (31), 6420-6426 (2017).
  21. Padmashri, R., Tyner, K., Dunaevsky, A. Implantation of a cranial window for repeated in vivo imaging in awake mice. Journal of Visualized Experiments. (172), e62633(2021).
  22. Foda, M. A., Marmarou, A. A new model of diffuse brain injury in rats. Part II: Morphological characterization. Journal of Neurosurgery. 80 (2), 301-313 (1994).
  23. Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
  24. Sun, W., et al. In vivo two-photon imaging of anesthesia-specific alterations in microglial surveillance and photodamage-directed motility in mouse cortex. Frontiers in Neuroscience. 13, 421(2019).
  25. Li, D., et al. A Through-Intact-Skull (TIS) chronic window technique for cortical structure and function observation in mice. eLight. 2 (1), 1-18 (2022).
  26. Paveliev, M., et al. Acute brain trauma in mice followed by longitudinal two-photon imaging. Journal of Visualized Experiments. (86), e51559(2014).
  27. Han, X., et al. In vivo two-photon imaging reveals acute cerebral vascular spasm and microthrombosis after mild traumatic brain injury in mice. Frontiers in Neuroscience. 14, 210(2020).
  28. Jang, S. H., Kwon, Y. H., Lee, S. J. Contrecoup injury of the prefronto-thalamic tract in a patient with mild traumatic brain injury: A case report. Medicine. 99 (32), 21601(2020).
  29. Courville, C. B. The mechanism of coup-contrecoup injuries of the brain; a critical review of recent experimental studies in the light of clinical observations. Bulletin of the Los Angeles Neurological Society. 15 (2), 72-86 (1950).
  30. Drew, L. B., Drew, W. E. The contrecoup-coup phenomenon: a new understanding of the mechanism of closed head injury. Neurocritical Care. 1 (3), 385-390 (2004).

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